专利名称：从苏云金芽孢杆菌中鉴定、定量和纯化杀昆虫蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及从苏云金芽孢杆菌中，特别是苏云金芽孢杆菌的多基因菌株中鉴定、定量和纯化杀昆虫蛋白质。
苏云金芽孢杆菌(以下简称Bt)是一种革兰氏阳性土壤细菌，特征在于它能够在孢子形成期间产生大的结晶多分孢子包含物。这些包含物由表现出高特异性杀昆虫活性的蛋白质(前毒素)组成。
它鉴定了许多有不同昆虫宿主毒性谱的Bt菌株。许多菌株都有抗鳞翅目中某些成员之幼虫的活性(迄今已鉴定了有抗100种以上鳞翅昆虫活性的Bt菌株)，但显示对双翅或鞘翅目昆虫有毒性的菌株也是已知的。
已证明Bt多分孢子包含物是一种有价值的常规杀昆虫剂代用品。它们对靶昆虫有高度毒性，而且由于它们的特异性而对环境无害。其他昆虫目、动物和植物似乎不受该毒性结晶蛋白质的影响。二十多年前就已使用各种Bt的配方作为生物学杀昆虫剂，以控制农业和森林害虫，并在近年来用以控制各种人和动物疾病的昆虫载体。
Bt产生几种类型的毒素，其确切生物化学性质可因菌株不同而不同。其中有些，特别是α和β外毒素，对各种昆虫目或许多细胞类型有毒性。多分孢子结晶包含物毒素(也称为δ内毒素)，其为蛋白质，具有更有限的和特异性的宿主范围。当被幼虫吞噬时，Bt结晶包含物溶解在幼虫中肠中并在幼虫中肠中迅速受到蛋白水解，转化成较小的毒性多肽(分子量范围为23-80KD)。所产生的毒素与宿主昆虫的中肠上皮细胞相互作用，在细胞膜中产生孔隙并破坏渗透压平衡。上皮细胞肿胀并溶解。幼虫停止摄食并最终死亡。已证明敏感昆虫的中肠上皮细胞上存在几种Bt毒素的特异性高亲和性结合位点，这一事实可解释这些毒素的高度特异性。
近几年逐渐明确，Bt备有特别大的和可变的杀昆虫蛋白质家族。使用几种实验方法得到的数据表明许多对鳞翅昆虫有毒性的Bt亚种中的结晶蛋白质基因位于一个或多个大的质粒上；在某些亚种中，该基因可被定位在染色体上。Bt前毒素的基因通常是质粒装载的这一事实已使Bt成为基因操作的适用候选物。其中包括，最年已导致产生能够表达Bt结晶蛋白质基因的昆虫抗性转基因农作物。
另外，近年也已了解到，许多Bt菌株含有编码前毒素的几个密切相关的基因。例如Bt变种Kurstaki NRD-12菌株即是三基因菌株。几个这样的基因的存在导致由单—Bt菌株产生几种其氨基酸序列密切相关的前毒素。蛋白水解酶在体外或在昆虫中肠内对这些前毒素混合物的酶促作用，产生几种只是少数几个氨基酸残基有所不同的毒素，从而使所得到的毒素混合物难以分离。然而，因为这些小的差异常常是出现在毒素序列的关键区域，所以它们可能造成对所选择的昆虫靶有明显不同的毒性。因为由Bt的多基因菌株所产生的毒素混合物的组合和个别毒素的表达水平可随着发酵条件而变化，所以其对各种昆虫的相对毒性就可能不同，而且作为一种结果，多基因Bt菌株的宿主范围也有所差异。因此，为了从多基因生产菌最佳化生产最想要的毒素，监测并定量存在于内毒素结晶中的不同毒素就变得十分重要。
从Bt的各个菌株的δ-内毒素中纯化杀昆虫毒素的各种尝试是现存技术中已知的。所提出的典型方法包括用蛋白水解酶如胰蛋白酶或昆虫消化液消化Bt的结晶包含物，然后用各种分析方法，如电泳法、凝胶过滤法和离子交换层析法分离水解产物。然而，这些方法都不能分离和纯化从Bt的多基因菌株中得到的密切相关的毒素。
同样，也提出了Bt菌株的许多定性的定量特征。例如包括使用鞭毛抗体，用DNA探针检查基因或检测RNA产生的水平。虽然这些方法可用于确性特征和分类目的，但对于定量基因表达和监测给定菌株的存活性，或生产用于分析杀昆虫活性、协同作用、膜研究或昆虫抗性的个别毒素标准品来说是不能令人满足的。
具体地说，Fullmer，C.B.和Wasserman，R.H.〔Analytical Peptide Mapping by High Perform-ance Liquid Chromatograpwy(应用于小肠钙结合蛋白质〕，J.Biol.Chem.254，7208-7212(1979)〕描述了一种包括彻底酶促消化以提供肽混合物的肽酶切图技术。用反相HPLC，结合使用酸和有机溶剂对肽混合物进行分析。
在另一参考文献中，Yamamoto，T.〔Identificationof Entomoeidal Toxins of Bacillus thuringion-sis by High Performance Liquid Chromatography，J.Gen.Microbiol，129，2595-2603(1983)〕描述了使用Fullmer等人的方法学制肽酶切图。例如，该文第2601页图4下方第5行述及“不能定位代表蛋白酶抗性核心的峰”。文中强调使用有机溶剂持久地降低或完全破坏毒素的生物学活性。
在进一步的参考文献中，Yama mo to，T.，Ehmann A.，Gonzalez，J.M.Jr.和Carlton，B.C.(Expres-sion of Three Genes Coding for 135-KilodaltonEntomocidal Proteinin Bacillus thcaringiensisurrent Microbiol.，17，5-12(1988)〕也描述了同样的制作肽酶切图的方法学。在该参考文献中，在胰蛋白酶水解之前，对前毒素进行预纯化。水解后，使毒素混合物在尿素中变性，并用胰蛋白酶再次消化以使用反相HPLC法制备肽酶切图谱(将肽溶解在酸中并在酸/乙腈混合物中洗脱)。如上所述，如此即可破坏毒素的生物学活性。但不幸的是，使用单一基因标准品得到的肽酶切图谱解释由多基因菌株获得的结果，不能识别出菌株Kurstaki HD-1中cryIA(c)〔6.6〕基因产物的存在。它由其他研究者证明存在的这一基因和其蛋白质毒素是一种很重要的成分。
此外，美国专利4,853,331(1989)(Hernstadt，C.and Wilcox E.，Choning and Expression ofBacillus thuningiensis Toxin gene Toxic toBeetles of the oder Coleoptera)描述了单一基因的克隆和由大肠杆菌细胞生产单一Bt蛋白质。用亲和层析法纯化毒素。
与我们的发现相反，上述技术都没有提供在保留毒素生物学活性的情况下，鉴定、定量并纯化由Bt基因表达的前毒素的方法。事实上，这些参照文献都有与本发明不同的目的，即制备肽酶切图，而其中毒素之生群活性的破坏都是不相干的。然而，在我们的发明中，必须保留毒素之生物学活性的基因完整。因此，我们不能使用这些现有技术中所使用的反相HPLC技术。
本发明提供了鉴定由苏云金芽孢杆菌表达的前毒素的方法，该方法包括-在PH为10至12的含水悬浮液中用蛋白水解酶水解含苏云金芽孢杆菌前毒素的材料，以产生被溶解的子毒素，-在10至12的基本恒定PH和含水条件下对子毒素进行高效阴离子交换液相层析，所说的含水条件相当于使用只含有缓中液的第一冲脱液并在预确定的时间内逐步引入至少一种含有缓冲液和适当的盐的其他洗脱液，洗脱液中盐的浓度及时改变，以致使呈生物学活性状态的子毒素与其他水解产物分离开，并-根据由子毒素产生的层析信号鉴定，并在必要时定量前毒素。
可以理解到，根据起始材料的不同，术语“子毒素”可包括前毒素的混合物或个别前毒素。因此，当使用多基因菌株时便包括前毒素的混合物；而在使用单一基因菌株时，则包括单一前毒素。
因此，现已发现了一种从Bt的多基因菌株中分离、鉴定并以其生物学活性状态纯化密切相关毒素的方法。根据该方法，使纯化的蛋白质结晶或例如从Bt多基因菌株的粗制发酵混合物在大约10至12，较好10.5的PH条件下直接经受蛋白水解酶的作用。然后使用阴离交换高效液相层析柱，在PH10至12，较好PH10.5至11.5条件下对该蛋白水解消化过程释放出的毒素进行阴离子交换高效液相层析(HPLC)。用加在渐增的盐较好是氯化钠梯度中的适当PH的缓冲溶液洗脱毒素。该步骤提供了显示有一个清晰可辨的毒素特征性峰，因此可以对原混合物进行定性和定量分析。可使用半制备性或制备性层析柱按比例放大分离工艺，从而大量分离纯的活性毒素。
虽然本发明主要是用于从得自Bt之多基因菌株的毒素混合物中分离或鉴定个别毒素，但本发明也可用于鉴定得自Bt单基因菌株之单一毒素的特征。当得自Bt单基因或多基因的一种或多种毒素被鉴定后，也可确定Bt菌株的特征。
根据本发明的方法，也可以确定得自已知Bt菌株之已知毒素的表达水平，并可监测菌株的存活性。
图1显示根据本发明的一个优选实施方案，使用ProteinPAK DEAE 5 PW半制备柱进行层析分离的梯度条件。
图2显示在图1的梯度条件下，使用Protein PAK DEAE5PW半制备柱层析得到的Bt Kurstaki NRD-12菌株之多分孢子结构的胰蛋白酶消化产物的层析图谱。
图3、4和5分别显示出分离后再注入图2所示成分B、C和D在图1的梯度条件下得到的层析图谱。
图6显示使用MonoQ层析柱，根据本发明的另一个优选实施方案，使用MonoQ层析柱进行层析分离的梯度条件。
图7显示在图6所示梯度条件下对Bt Kurstaki NRD-12菌株多分孢子结晶的胰蛋白酶消化产物进行层析所得到的层析图谱。
图8显示图9中所示层析分离的梯度条件。
图9显示与图2所示者相似的并在图8所示梯度条件下用Protein PAK DEAE柱得的层析图谱(未分辨出毒素峰)。
图10a和10b显示Bt Kurstaki NRD-12菌株的3种菌株和从分离的单一蛋白质毒素中鉴定的肽片段的氨基酸序列。
根据本发明的一个实施方案，典型的包括下列步骤a)从发酵混合物中纯化Bt内毒素结晶；
b)直接用蛋白水解酶消化该结晶；以及c)对水解产物进行阴离子交换HPLC分离，虽然用蛋白水解酶消化的材料一般是从粗发酵混合物中纯化的结晶内毒素，但这样一个纯化步骤不是必需的。也可以使用在酶促消化前从发酵液中分离的粗Bt材料得到阴离子交换HPLC洗脱曲线中的可识别的特征性毒素峰。
然后用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶直接水解纯化的结晶或洗过的粗材料。优选的酶是胰蛋白酶。另外，昆虫肠汁如蚕(Bombyx mori)的肠液也是有效的。每种特定的酶产生稍有不同的一组毒素，这是因为每种酶对内毒素蛋白质来说都有独特的特异性。可使用商品酶制剂。酶的浓度范围为0.1至2mg/mL，较好1mg/mL。
用蛋白水解酶消化内毒素的混并不严格，并可以从20到40℃，较好约37℃。水解时间也不严格，但应有足够长的时间以确保在给定的PH、温度和酶浓度条件下几乎完全释放出毒素。在用胰蛋白酶消化时，消化时间约为10分钟至12小时。
水解可在有特定PH范围的未缓冲或缓冲的溶液中进行。适用溶液的例子是3-环己基氨基-1-丙磺酸/NaOH缓冲液(CAPS)、硼酸盐缓冲液或未缓冲的NaOH溶液。并不是所有的溶液都同样有效。因为水解期间释放的毒素是明显巯水的并难溶于水中，所以溶液中最好含有有助于毒素蛋白质分子溶解的成分。这种成分的一个例子是3-环己基氨-1-丙磺酸(CAPS)。优选的溶液是PH10.5的0.1M CAPS/NaOH缓冲液。
水解后，用例如离心和过滤法除去反应混合物的固体成分。用滤液样品进行HPLC分析。用相差显微镜检查，沉淀团块不应含有任何可辨认为包含体(作为完全消化的特征)。
对蛋白水解产物的HPLC分离提供了可用于鉴定和定量毒素的酶解图谱。为使毒素达到足够的溶解度，必须在PH不低于10，较好为10.5至11.5的条件下进行分离。另一方面，为避免毒素变性并保证柱的适当工作，PH不应高于大约12。在指定的PH范围内，毒素分子带有负电荷，并且可经液-固相都离子交换层析得以分离。使用HPLC技术可在短时间内实现分离。
应注意的是，虽然按照本发明的毒素分离可在指出的宽范围内的任何PH值条件下进行，但PH增加到优选的10.5至11.5范围以上将会不必要地增加已分离之蛋白质的变性危险，以及对柱造成不可逆的损害。另一方面，PH降低到10.5以上则增加毒素在HPLC柱中至少部分地形成沉淀的危险，而对定量检测的可靠性带来不利影响。为此，认为PH约10.5-11.5为最宜PH范围。
使用阴离子交换剂装添的柱进行分离。可使用弱或强阴离子交换剂。选择弱都离子交换剂。特别优选的是二乙氨基乙基聚(甲基丙烯酸甲酯)。
使用加在渐增的盐例如氯化钠梯度中的适当缓冲液，在室温下从柱上洗脱毒素。所使用的缓冲液首先是要能够维持所要求的洗脱液的PH。
但很明显，不仅PH，而且缓冲液的组成对于进行成功地分离也是很重要的。在一个优选实施方案中使用了0.05M CAPS/NaOH缓冲液(PH＝10.5)。然而，可以理解到，随着使用一组新的洗脱条件，即可以找到可代替的缓冲系统。
盐梯度的条件对于所使用的柱是特异的。正常情况下，使用一系列具有渐增盐浓度的缓冲液，并在预确定的时间以预确定的次序引入之即可实现这些条件。
用于分离的盐应相当强有力地结合到柱上，但不应与被分离的蛋白质结合或反而对该蛋白质造成不利影响。适用盐包括氯化钠、氯化钾、氯化铵和乙酸钠。也可使用溴化物或碘化物。优选的是氯化钠。某些盐，例如钙盐可与某些蛋白结合并影响这些蛋白质的性质。因此这些盐是不适用的。对于本领域技术人员来说，选择适当的盐将不存在问题。
根据本发明的最优选的实施方案，在水解后直接以两步骤从层析柱上洗脱蛋白质。第一洗脱液是PH11.5的0.05M CAPS/NaOH缓冲液，然后是含0.05M CAPS/NaOH缓中液和0.5M NaCl，PH11.5的第二洗脱液。两种洗脱液以这样一种方式被同时导入柱中，即根据样品的性质，在25至40分钟内将第二洗脱液的量成线性从0增加到33％。该步骤之后是在洗脱毒素同时的20-50分钟常液期间。
可收集相当于待选峰的洗脱液部分，浓缩并再次注入确定分离之毒素的同一性和纯度。当使用半制备或制备柱进行分离时，可分离并收集到活性的、天然的毒素。
由蛋白水解、内毒素结晶的前毒素而产生的迅速鉴定、定量和纯化毒素的方法对本领域是相当有用的。它提供了一种经与已知菌株比较而迅速筛选并检验新的Bt分离物的手段。它还允许进行操纵发酵条件的实验，以便最佳化地从多基因菌株生产最想要的毒素。它还能使生产者鉴定由竞争者的菌株产生的Bt毒素的特征。因为可以以纯的和有活性的形式收集分离到的毒素，所以该方法可用来检验以特定的和控制的方式制备的个别已纯化毒素及个别毒素的混合物。虽然该方法特别适用于Bt的多基因菌株，但显然对Bt的单基因菌株有同样的适用性，并可用于分析来自例如大肠杆菌中已克隆Bt基因的包含体。
实验实施例1分隔和分离来自苏云金芽孢杆菌变种Kurstaki NRD-12多基因菌株的毒素1.多分孢子结晶的纯化按照文献中介绍的方法制备纯化的结晶(如Carey et al.，Biochim Biophys，Acta，872，169(1986))。
2.胰蛋白酶消化用1mg/mL商品胰蛋白酶处理加在0.1M CAPS/NaOH，PH10.5中的20mg/mL NRD-12结晶悬浮液。将反应混合物在室温下搅拌过夜并以10,000rpm离心15分钟。通过0.22μm截留滤膜过滤缓缓倾析的上清。
3.使用弱阴离子交换剂进行HPLC分离使用装配有自动注入器和光电二极管阵列检测器的Waters990溶剂输送系统进行分离。使用Protein PAK DEAE 5 PW阴离子交换柱(7.5×75mm)分析或注入体积-1-20,000μL；流速-4mL/分。
复合洗脱梯度利用3种缓冲液A0.05M CAPS PH10.5
B0.05M CAPS PH10.5＋0.17M NaClC0.05M CAPS PH10.5＋0.5M NaCl梯度表时间〔min.〕 流速〔mL/min.〕 ％A ％B％CInitial 4.00100.0 0.00.020.00 4.00 0.0 100.00.035.00 4.00 0.0 100.00.050.00 4.00 0.0 90.0 10.055.00 4.00 0.0 90.0 10.060.00 4.00 0.0 0.0 100.065.00 4.00 0.0 0.0 100.070.00 4.00100.0 0.00.079.90 4.00100.0 0.00.080.00 0.50100.0 0.00.0所使用的梯度条件示于图1中。图2显示在这些梯度条件下典型消化产物的层谱图谱，其中分离的毒素的峰标示为B、C和D。峰B相当于cryIA(a)〔4，5〕基因毒素，峰C相当于cryIA(b)〔5，3〕基因产物，峰D相当于cryIA(c)〔6，6〕基因产物。柱的条件或PH或盐浓度的很小改变都可能导致某些蛋白质的滞留时间改变几分钟。如可从表中看出的，分离发生在大约洗脱的前60分钟内。洗脱后清洗柱并使柱再生以用于下一次分离。
在比较试验中，如图8图解显示的，当对Protein PAKDEAE 5 PW分析柱在30分钟内使用从0增加到0.5M的盐浓度线性梯度时，未观察到毒素的分离。在这些梯度条件下获得的胰蛋白酶消化产物的层析图谱示于图9中。峰7周围部分含有毒素。
4.毒素分离和纯化从HPLC洗脱物中收集相应于B、C和D待选峰的部分，使用8KDa聚乙二醇/3.5KDa截留透析管浓缩并再注入HPLC柱中以确定纯度。图3、4和5中显示了有代表性的层析图谱。经反复进行注入一分离步骤后，可使分离的毒素达到100％纯度。
5.毒素鉴定结果的确认用CNBr裂解按上述方法分离并纯化的毒素，并对所得片段进行SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离。将凝胶电转印到聚偏二氯乙烯膜上。染色膜中的肽条带，切下可见的肽条带，使用Applicd Biosystems 475A蛋白质序列分析系统(包括装配有120A PTH分析仪和其900A控制/数据分析软件的470A气相序列仪)测定候选片段的序列。
对于Bt变种Kurstaki NRD-12的三基因菌株，从HPLC洗脱物中分离出三种候选蛋白质(分别是图2和图3、4与5中的峰B、C、D)。对于这些蛋白质，SDS-PAGE显示出三种不同的裂解特性曲线。测定各裂解特性曲线内个别条带的序列，证实了相应于三种毒素中每个种之独有序列的氨基酸序列。可从实验确定的各自基因的DNA序列知道这些序列。
图10显示由胰蛋白酶激活的并按照相同序列片段一一对齐之三种毒素的序列，分别被鉴定为cryIA(a)〔4.5〕、cryIA(b)〔5.3〕和cryIA(c)〔6.6〕。图10中划下线的序列相当于已被分离并测定了序列的肽，其大部含有只是一种蛋白质所特有的氨基酸序列。
6.检查的B菌株以上述方法检查下列菌株的毒素成分Bt Var.Kurstaki HD-1(3种蛋白质)Bt Var.Kurstaki NRD-12(3种蛋白质)Bt Var.Kurstaki HD-73(1种蛋白质)Bt Var.entomocidus (2种蛋白质)Bt Var.aizawai HD-133(2种蛋白质)Bt Var.Kurstaki A 20(3种蛋白质)并且三个大肠杆菌株克隆，各含有一个单一Bt基因并产生单一的毒素产物。三个基因各相当于天然HD-1菌株中的三个基因之一。大肠杆菌毒素的HPLC滞留时间与相应的HD-1毒素完全相同。
7.使用强阴离子交换剂进行HPLC分离使用有-CH2-N(CH3)3带电荷基团的MonoQ HR5/5(pharmacia)阴离子交换柱进行这一分离；注入体积1为20,000L；流速为1mL/min。
洗脱梯度利用2种缓冲液A0.05M CAPS PH＝10.5B0.05M CAPS PH＝10.5＋0.5M NaCl
梯度表时间〔min.〕 流速〔mL/min〕 ％A ％BInitial 1.0100.00.035.00 1.0 0.0 100.040.00 1.0 0.0 100.045.00 1.0100.00.049.99 1.0100.00.050.00 0.1100.00.0所用的梯度条件示于图6中。图7显示在这些梯度条件下胰蛋白酶消化产物的层析图谱，其中出现在大约洗脱的22和28分钟之间的峰10、11和12相当于作为cryIA(a)〔4.5〕、cryIA(b)〔5.3〕和cryIA(c)〔6.6〕基因产物的已分离毒素。从图6中可以看出，分离过程发生在35分钟期间氯化钠线性梯度从0增加到0.5M条件下。
实施例2使用实施例1中所述同样方法学分析下列Bt菌株并鉴定基因产物，不同的是按照下列梯度表使用两种缓冲液进行洗脱。使用弱阴离子交换剂A0.05M CAPS/NaOH PH11.5B0.05M CAPS/NaOH＋0.5M NaCl，PH11.5分析规模的梯度表时间〔min〕 流速〔ml/mir〕 A％ B％起始1100 02 1100 040*167 3341 0.5 67 3360 0.5 67 3361 167 3365 10 10070 1100 071 0.1 100 0*该梯度时间可依据样品的性质，可在25-40分钟之间有所变异用微序列测定法和生物检测法进一步证实这些结果菌株 表达的基因 相对比例％Bt var kurstaki HD-1cryIA(a) 28cryIA(b) 39cryIA(c) 33Bt var kurstaki NRD-12 cryIA(a) 41cryIA(b) 36cryIA(c) 23Bt var kurstaki A-20cryIA(a) 17cryIA(b) 17cryIA(c) 66Bt var entomocidus cryIA(a) 40cryIA(b) ＜5
cryIA(c) ＜5cryIB ＜5cryIC 50Bt var kurstaki HD-73cryIA(c) 100HD-2 cryIC(+4种其他 25蛋白质)Bt var thurinqiensis cryIBBt var tenebrionis cryIIIA＞90Btvar israelensiscytA 30(+4种其他 (in蛋白质) cryIVC+D混合物)
权利要求
1.鉴定由苏云金芽孢杆菌基因表达的前毒素的方法，该方法包括-在PH范围为10至12的水悬浮液中用蛋白水解酶水解含苏云金芽孢杆菌前毒素的材料，以产生被溶解的子毒素，-在范围为10至12的基本恒定PH下和相当于使用第一洗脱液的含水条件下对子毒素进行高效阴离子交换液相层析，所说的第一洗脱液只含有缓冲液关在预定的时间内逐步引入至少一种含缓冲液和适当的盐的其他洗脱液，洗脱液中盐是浓度及时改变，以致使子毒素以生物学活性状态与水解的其他产物分离开，并-根据由子毒素产生的层析信号鉴定并在必要时定量前毒素。
2.根据权利要求1的方法，其中基因是由苏云金芽孢杆菌的菌株表达的，并且该方法被用以鉴定菌株的特征。
3.根据权利要求2的方法，其中苏云金芽孢杆菌的菌株是多基因菌株，并且该方法是经分离得自由各个基因表达之前毒素的个别子毒素而被用于确定菌株的特征。
4.根据权利要求3的方法，其中菌株是已知菌株，并且该方法被用于确定基因的表达水平和菌株的存活性。
5.根据权利要求1的方法，其中蛋白质前毒素是由己克隆的苏云金芽孢杆菌基因表达的。
6.根据权利要求1的方法，其进一步包括分离和纯化以生物学活性状态存在之个别毒素的步骤。
7.根据权利要求1的方法，其中含前毒素材料是苏云金芽孢杆菌的多分孢子结晶。
8.根据权利要求1的方法，其中含前毒素材料是分离自发酵液的苏云金芽孢杆菌的粗发酵混合物。
9.根据权利要求1的方法，其中蛋白水解酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和昆虫肠液。
10.根据权利要求9的方法，其中蛋白水解酶是胰蛋白酶。
11.根据权利要求10的方法，其中水解是在约10.5的PH下直接进行的。
12.根据权利要求11的方法，其中水解是在0.1M3-环己基氨基-1-丙磺酸/NaOH缓冲液中进行的。
13.根据权利要求11的方法，其中水解是在大约20至40℃的温度下进行的。
14.根据权利要求12的方法，其中层析是在10.5至11.5的PH下完成的。
15.根据权利要求14的方法，其中层析是在0.05M3-环己基氨基-1-丙磺酸/NaOH缓冲液中进行的。
16.根据权利要求13的方法，其中盐是氯化钠。
17.根据权利要求1的方法，其中阴离子交换剂是弱阴离子交换剂。
18.根据权利要求17的方法，其中阴离子交换剂是二乙氨基乙基聚(甲基丙烯酸甲酯)。
19.根据权利要求1的方法，其中阴离子交换剂是强阴离子交换剂。
20.根据权利要求1的方法，其中阴离子交换剂含有三甲铵乙基基团。
21.根据权利要求1的方法，其中层析是在基本上与进行水解的PH相同的PH条件下完成的。
22.根据权利要求21的方法，其中水解后直接对溶液进行层析。
23.根据权利要求21的方法，其中高效液相层析信号是根据与在同样条件下用相同的蛋白水解酶水解由已知的苏云金芽孢杆菌基因表达的前毒素，然后在同样条件下进行阴离子交换高效液相层析所得的层析信号相比较而鉴定的。
24.根据权利要求1的方法，其中在PH10.5的0.1M3-环己基氨基-1-丙磺酸/NaOH缓冲液中用胰蛋白酶水解含前毒素材料，在二乙氨基乙基聚(甲基丙烯酸甲酯)上对水解后的溶液直接进行层析，第一洗脱液是PH10.5的0.05M3-环己基氨基-1-丙磺酸/NaOH缓冲液，第二洗脱液是含有0.17M氯化钠的同一缓冲液，两种洗脱液同时以这样一种方式被引入，即第二洗脱液的量在大约20分钟时间里从0线性增加到100％，第三洗脱液是含有0.5M氯化钠的相同缓冲液，第三洗脱液在第二洗脱液的量已达到100％之后约15分钟开始被引入，并且第三洗脱液在大约15分钟时间里从0线性增加到10％。
25.根据权利要求1的方法，其中在PH10.5的0.1M3-环己基氨基-1-丙磺酸/NaOH缓冲液中用胰蛋白酶水解含前毒素材料，在含三甲铵乙基基团的树脂上对水解后的溶液直接进行层析，第一洗脱液是PH10.5的0.05M3-环己基氨基-1-丙磺酸/NaOH缓冲液，第二洗脱液是含有0.5M氯化钠的同样缓冲液，两种洗脱液以这样一种方式被同时引用，即第二洗脱液的量在大约35分钟时间里从0线性增加到100％。
26.根据权利要求25的方法，其中第二洗脱液经大约30分钟以上的时间被引入。
27.根据权利要求1的方法，其中在PH为10.5的0.1M3-环己基氨基-1-丙磺酸/NaOH缓冲液中用胰蛋白酶水解含前毒素材料，水解后的溶液直接加在含三甲铵乙基基因的树脂上进行层析，第一洗脱液PH为11.5的0.05M3-环己基氨-1-丙磺酸/NaOH缓冲液，第二洗脱液含有0.5M氯化钠的同一缓冲液，两种洗脱液以这样一种方式被同时引入，即第二洗脱液的量在大约40分钟时间内从0线性增加到33％。
全文摘要
公开了鉴定由苏云金芽孢杆菌基因表达的蛋白质前毒素的方法。根据该方法，首先在pH约为9.5的含水悬浮液中用胰蛋白水解酶对含前病毒材料如苏云金芽孢杆菌的多分结晶进行有限的水解以产生子毒素。然后在大于10的恒定pH下在渐增的盐较好是氯化钠的梯度中用高效阴离子液相层析法分离子毒素。利用具有渐增浓度盐的并在预定时间和以一定速度被引入的一系列缓冲液达到对所使用的柱特异的梯度条件。
文档编号C07K1/22GK1114358SQ9410724
公开日1996年1月3日 申请日期1994年6月27日 优先权日1990年3月14日
发明者P·C·玛丽安, R·C·保尔, 矢口诚, L·提莫斯 申请人:加拿大国家研究院