产生具有正确的折叠和二硫键键合的igf－i和igfbp－3的方法

专利名称：产生具有正确的折叠和二硫键键合的igf－i和igfbp－3的方法
技术领域：
本发明总的来说涉及产生有活性的，适当折叠的蛋白质的领域，更具体地说涉及类胰岛素生长因子-I(IGF-I)和类胰岛素生长因子结合蛋白-3多肽的再折叠。
背景技术：
生长因子是多肽，该多肽在靶细胞的限定种群中刺激产生广泛多样的生物反应(如DNA合成，细胞分裂，特定基因的表达，等等)。多种生长因子已经被人们鉴别，其中包括转化生长因子β1(TGF-β1)、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)和IGF-II。
IGF-I和IGF-II在氨基酸顺序和结构上有联系，每个多肽具有大约7.5千道尔顿(Kd)的分子量。IGF-I调节生长激素的主要作用，因此是出生之后生长的初级调节物。在其它各种生长因子的作用中也已经牵涉了IGF-I，因为用这些生长因子对细胞的处理导致IGF-I产量的增加。相反，人们相信FGF-II在胎生长中是一种主要角色。两者IGF-I和IGF-II都具有类胰岛素活性(并因此得名)，对于在神经组织、肌肉、繁殖组织、骨胳组织和其它广泛的多种组织中的细胞来说，还是促细胞分裂的(刺激细胞分裂)。
与大多数生长因子不同，IGF在循环中大量存在，但这种IGF只有很小的一部分在循环中或其他体液中是游离的。多数循环的IGF与IGF结合蛋白-3结合。人们可以通过在血清中对IGF-I测量来诊断不正常的与生长有关的病症，例如，脑垂体肥大症、顶端肥大症、侏儒症和各种生长激素缺乏症。虽然许多组织都产生IGF-I，但人们相信大多数循环的IGF-I是在肝脏中合成的。
几乎所有的IGF都循环在非共价键联系的由IGF-I或者IGF-II，IGFBP-3组成的三重复合物中，并且其中一个较大的蛋白质亚单位被称为酸不稳定亚单位(ALS)。这个三重复合物是由三种等摩尔量的组分组成的。ALS没有直接的IGF-结合活性并且表现为只与IGF-I或IGFBP-3双重复合物结合。IGF-I+IGFBP-3+ALS的三重复合物具有的分子量约为150Kd。这个三重复合物被认为是在循环中起的功能是“作为IGF-I和IGF-II的储藏器和缓冲带，从而避免游离IGF的浓度的快速变化”(Blum等(1991)“血浆IGFBP-3水平作为临床指示物”，类胰岛素生长因子的现代概念，381-393页，(E.M.Spencer，ed.，Elsevier，纽约)。
多数循环的IGF-I，IGF-II，和IGFBP-3以复合物的形式存在，因此，人们可以探测到的游离IGF是很少的。而且，血液中高水平的游离IGF是不合乎需要的。高的血液IGF水平会由于IGF的类胰岛素活性导致严重的低血糖。与IGF和IGFBP-3相比，在血浆中有一个充足的游离ALS库，从而保证了进入循环的IGF或IGFBP-3复合物立即形成三元复合物。
当IGFBP-3是循环中最丰富的IGF结合蛋白时，人们已经在各种组织和体液中鉴定了至少五个其它性质截然不同的IGF结合蛋白(IGFBPs)。虽然这些蛋白质结合IGF，它们每一个都起源于不同的基因，并具有截然不同的氨基酸序列。因此，结合蛋白不只是一个共有前体的类似物或者衍生物。不同于IGFBP-3，除IGFBP-3以外的其它的循环IGFBP不以IGFs饱和。除IGFBP-3以外，没有IGFBP能形式150Kd的三元复合物。
IGF-I和IGFBP-3可以通过从天然来源纯化或重组方法产生。本领域已知的如，从人类血清中的IGF-I的纯化(Rinderknecht等，(1976)美国科学院学报，732365-2369)。在EP 0,128,733中展示了产生IGF-I的重组过程(在1984年十二月出版)。IGFBP-3可以从天然来源纯化，通过用一种方法诸如Baxter等中显示的((1986)“人类血浆中的生长激素-依赖性类胰岛素生长因子(IGF)结合蛋白不同于其它人类IGF结合蛋白，”生物化学及生物物理研究通讯。1391256-1261)。IGFBP-3可以通过如在Sommer等中(同上，715-728页)讨论的由重组有机体合成。重组体IGFBP-3以1比1的摩尔比率结合IGF-I。
对大鼠和猪的创伤局部施用IGF-I/IGFBP-3复合物显著的比单独施用IGF-I更有效(Sommer等，同上)。对切除垂体的、切除卵巢的，和正常的大鼠皮下施用IGF-I/IGFBP-3复合物，以及对猕猴(cynomologous monkeys)的静脉施用，从根本上阻止了单独施用IGF-I时的低血糖作用。
当单个测量时，IGF-I和IGFBP-3都具有二硫化物异构酶活性。然而，两种蛋白质的混合物本质上抑制了这一活性(Koedam和Leo vanden Brande(1994)“类胰岛素生长因子(IGFs)和IGF结合蛋白-3均表现二硫化物异构酶活性”生物化学及生物物理研究通讯，1981225-1231)。
通过运用重组表达系统，特别是在原核生物(如大肠杆菌)中表达，基因工程已经使产生大量的由克隆的DNA编码的多肽成为可能。表达的异源肽(其根本不被宿主细胞产生或只以有限的量产生)可以构成宿主的整个细胞多肽的显著比例。
当克隆的DNA在重组表达系统中以高水平表达时，有几个问题人们会经常碰到。在宿主细胞的细胞质中超量表达的多肽经常聚集成不能溶解的“包含体”或“折射体”，特别是当细菌作为宿主细胞时(Williams等(1982)科学215687-689；Schoner等(1985)生物技术3151-154。当然，内含体的形成不限于细菌表达系统。例如，当在昆虫细胞中利用杆状病毒表达系统产生时，果蝇属的Kruppel基因产物能形成包含体。多肽聚集形成“包含体”或“折射体”对生物和生化测定相对来说是没有用的。把这种不能溶解的物质转化成为有活性的，可溶性的多肽需要缓慢的和困难的溶解和再折叠方案，这些增加多肽的生产成本并且经常大大地减少具有生物活性的多肽的净产量。
甚至当异源多肽在宿主细胞的细胞质中以可溶性形式表达时，因为不正确的折叠，它们还可能没有生物活性。不正确的折叠发生在宿主细胞的细胞质之中或在分离过程中。
从重组表达系统获得有生物活性的重组蛋白质内在的困难是增加包含半胱氨酸残基的多肽(如IGF-I)。IGF-I包含六种半胱氨酸残基，所有这些形成被人们认为是稳定蛋白质的活性构造的分子内二硫键。IGF-I中的半胱氨酸残基能形成不正确的二硫键，即，在天然IGF-I中尚未发现的半胱氨酸残基之间所形成的二硫键。包含不正确的二硫键的IGF-I分子已经减少了生物活性(Raschdorf等(1988)Biomed.Env.Mass Spectros.163-8)。
人们发现如果发酵温度降低于30℃，可溶性的多肽的量就可以在大肠杆菌重组体表达中增加。这种方法作为使多肽从包含体的复性的一种选择是有用的，但是需要能在30℃下有效地运行的表达系统。当然，这种方法可能不会是在商业上切实可行的，因为发酵温度的降低增加了所用时间，因此发酵的成本伴随着培养受到污染的风险也增加。
在本领域已知的再折叠蛋白质的方法。例如，美国专利4,511,502、4,511,503和4,512,922描述的被认为是对从包含体回收的蛋白质的再折叠通用的方法(仅需稍加修改)。这些方法通常寻求打破不正确折叠的蛋白质的结构，然后允许弱的分子内力，即，氢键，疏水相互作用，和离子键，使蛋白质折叠到适当的形式，其后通过氧化形成正确的二硫键。
在一种这样的方法中，被折叠的蛋白质是一定条件下纯化的，该条件是在整个纯化过程中加入还原剂使蛋白质的半胱氨酸部分作为游离的硫氢基团。这允许在没有不正确的分子内二硫键下，在纯化过程中对蛋白质折叠。将还原剂稀释以使折叠的蛋白质在空气或其它一些氧化剂存在时形成二硫键。这种方法能被容易的结合到大多数纯化过程中，对具有相对不复杂的三级结构的重组蛋白质有理想的作用。
另一种方法是在硫氢化合物的还原形式(R-SH)和氧化形式(R-S-S-R)存在下折叠蛋白质。这允许二硫键通过纯化方法形成，破裂，和重新形成。被提供到缓冲液中的硫氢化合物的还原的和氧化形式具有足够的变性能力使所有的蛋白质的中间形态在再折叠方期间保持可溶性。人们建议尿素作为一种适合的变性剂，这是由于其中间变性能力允许蛋白质得到其正确的构造，同时也保持折叠的中间产物的溶解性。当时蛋白质折叠成具有一种不太复杂的折叠模式时，这方法最有效。
可用于更困难的再折叠情况的一种替代的方法是破坏任何可以在蛋白质的合成或分离期间形成的二硫键，从而衍生出蛋白质的游离硫氢基。游离的硫氢基是磺酸盐衍生的，从而阻止二硫键的形成。将蛋白质在弱变性剂中折叠，然后脱磺化，从而允许正确的二硫键形成。脱磺化作用在硫氢化合物的存在下发生。少量的化合物相应氧化的形式将保证适合的二硫键仍然完整。pH值改变，即，增加到这样的值以使硫氢化合物至少部分电离，提高磺酸盐的亲核置换。
这些折叠方法，尽管由于通用性而实际，对IGF-I还没有显示出特别的有效性，同时执行起来可能是有困难的或累赘的。
针对IGF-I的再折叠方法已经公开。PCT出版物WO 91/02807、WO 93/11240和WO 93/19084分别公开了用于再折叠重组表达的IGF-I蛋白质的方法。
WO 91/02807公开了IGF-I融合蛋白，其中带正电的氨基酸序列融合到IGF-I的氨基末端。氨基末端添加有助于再折叠，达到了几乎50％正确地折叠的蛋白质产量。这种方法需要氨基末端融合肽的分隔和纯化的额外的步骤，以生产天然的IGF-I。
WO 93/11240公开了一种用于在包含有离液剂、有机溶剂，和在碱性pH值下的还原剂的单一溶液中折叠IGF-I蛋白质的方法，这样得到多至85％的正确折叠的蛋白质。
WO 93/19084公开了一种用三个步骤的折叠方案来再折叠重组产生的IGF-I的方法。把不适当折叠的met-IGF-I，即，具有氨基端甲硫氨酸的IGF(必须把这一甲硫氨酸残基除去以形成成熟的IGF-I)，溶解到变性溶液中。然后将氧化剂加入以形式“氧化还原”溶液。将另外的还原剂加入以增加二硫化物的交换，同时对溶液进行隔夜培养。这种方法结果生产出大约30％的正确折叠的蛋白质，这种蛋白质必须经进一步加工以除去氨基端甲硫氨酸残基。
最近，Hober等(1994)在“类胰岛素生长因子的折叠受类胰岛素结合蛋白控制”(生物化学336758-6761)中描述用天然IGFBP-3来再折叠IGF-I的方法。加入天然的IGFBP-3以在氧化还原条件下减少IGF多肽，从而使天然IGF-I的产量达到89％。IGFBP-3的用途没有公开，未折叠的IGFBP的用途没有公开。
就本领域所知的再折叠方法产生的正确折叠的蛋白质产量显著少于100％。这些方法产生的异源混合物必须进一步纯化，而纯化过程费时和(或)费工。
人们在本领域中需要一种简单、迅速、高效的方法用于再折叠IGF和IGFBP-3，使它们由正确的二硫键形成正确的构造。
因此，本发明的一个目标是提供一种通过共折叠(cofolding)两个多肽进行的，迅速高效的再折叠IGF-I和IGFBP-3的方法，从而达到正确折叠的蛋白质的高产量。本发明的另一个目的是提供一种简单、高效的，用于产生纯化的天然1GF和IGFBP-3的复合物的方法。
在本文中，整个公开中所引用的专利，专利申请和出版物一并以全部进行参考。
发明概述在一方面本发明提供一种迅速、高效的用于再折叠IGF-I和IGFBP-3的有效方法，另外提供用于获得天然IGF-I/IGFBP-3复合物的有效方法。本发明还提供了从天然IGF-I/IGFBP-3复合物中纯化天然IGF-I和天然IGFBP-3的方法。
在另一方面，本发明提供了一种迅速的用于再折叠IGF-I，使天然的IGF-I产量很高的高效的方法。
还有另一个方面，本发明提供一种迅速的用于再折叠IGFBP-3，使天然的IGFBP-3产量很高的高效的方法。
附图简要描述

图1显示了人类IGF-I的氨基酸顺序图2显示了编码人类IGF-I的核苷酸序列图3和图4显示了IGFBP-3的可替换的两个氨基酸序列。图5、6和7显示编码人类IGFBP-3三个核苷酸序列。图8显示编码酵母泛素水解酶(YUH)的核苷酸序列。图9和图10显示了IGF-I和IGFBP-3共折叠的结果。实心菱形分别代表IGF-I或IGFBP-3单独再折叠，而空心菱形代表共折叠的结果。
发明的说明因为不正确的折叠和不正确的二硫键结构，在重组表达系统中以高水平表达的蛋白质经常地表现出低的或不可检测的生物活性。本发明提供了一种新的方法用于迅速的极高效地再折叠重组产生的IGF-I和IGFBP-3，产生天然的IGF-I和IGFBP-3。在意外的结果中，本发明人发现经变性和还原的IGF-I和IGFBP-3的混合物的氧化，即，共折叠[在变性和还原的条件下，未折叠的或不正确折叠的IGF-I与未折叠的或不正确折叠的IGFBP-3组合，随后氧化]对两种蛋白质在再折叠效率上产生协同增加，产生近100％天然的IGF-I和很高比例的天然IGFBP-3。本发明发明人也意外的发现再折叠的动力学过程从根本上改变，特别是IGFBP-3的折叠方面，使得再折叠所需时间大大减少。这些结果是特别惊人的，因为人们知道添加等摩尔量的IGFBP-3(Koedam和Leo van den Brande同上)对IGF-I的二硫化物异构酶活性(一种酶促活性，使二硫键的破裂和重新形成的，同时有助于蛋白质的再折叠)有抑制。本发明也提供了从重组表达系统产生天然IGF，天然IGFBP-3和天然IGF或IGFBP-3复合物的有效方法。直接根据本发明的IGF-I和IGFBP-3的共折叠形成IGF-I/IGFBP-3复合物。通过用那些本领域中已知而简单的方法可以容易地将这些复合物与在折叠反应中不正确折叠的蛋白质中分离开来。如果需要，可用那些本领域已知的方法容易的进一步对IGF-I和IGFBP-3分别进行分离和纯化。
定义“类胰岛素生长因子”或者“IGF”由一族因子构成，包括但不限于，IGF-I和IGF-II。IGF是大约7.5Kd的分子量的多肽。IGF包括天然产生的IGF-I或者IGF-II，类似物或者其变体，以及IGF-I或者IGF-II之间和其它氨基酸序列之间的融合体。IGF可从天然来源得到或由重组方法制备。
本文中所用的“胰岛素类生长因子结合蛋白-3”或“IGFBP-3”是胰岛素生长因子结合蛋白的家族中的一员，它包括但不限于，IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6。IGFBP-3可以从天然的来源或重组方法制备。IGFBP-3与IGF-I形成复合物，第三个分子已知是ALS。
本文中所用的“天然IGF-I”指这样的IGF-I，其包括天然产生的IGF-I、类似物，及其变体，其是正确折叠的且只包含正确的二硫键。正确的二硫键是在氨基酸残基C6-C48、C47-52，和C18-C61，或IGF-I的类似物和变体中的那些氨基酸残基的同源物之间形成的。天然的IGF-I有生物活性。
“不可溶的IGF-I”是指沉淀的或者聚合的IGF-I，其包含在宿主细胞中，或以其它方式与宿主细胞相联系，并假设其具有不正确或不成形的二硫键从而是生物无活性的结构。不可溶的IGF-I可能在包含体或折射体中，即，相差显微镜下是可见或不可见的。
“不正确折叠的IGF-I”指IGF-I，其具有不正确或不成形的二硫键从而是生物无活性的结构。不正确折叠的IGF-I可能是，但不一定是不可溶的。
“不可溶的IGFBP-3”指沉淀的或者聚合的IGFBP-3，其包含在宿主细胞中，或以其它方式与宿主细胞相联系，并假设其具有不正确或不成形的二硫键从而是生物无活性的结构。不可溶的IGFBP-3可能在包含体或折射体中，即，相差显微镜下是可见或不可见的。
“不正确折叠的IGFBP-3”指IGFBP-3，其具有不正确或不成形的二硫键从而是生物无活性的结构。不正确折叠的IGF-I可能是，但不一定是不可溶的。
本文所用的“天然的IGFBP-3”指这样的IGFBP-3，其包括天然产生的IGFBP-3、类似物，及其变体，其是正确折叠的且只包含正确的二硫键。天然的IGFBP-3有生物活性。
本文所用的“天然IGF-I/IGFBP-3复合物”指天然IGF-I和天然IGFBP-3以非共价键结合的复合物。
本文所用的“还原剂”指在还原态中保持硫氢基团和还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。可接受的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原的谷胱甘肽。
本文所用的“氧化剂”指能从被氧化的化合物中移去一个电子的化合物或物质。可接受的氧化剂包括但不限于氧化的谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化的二硫苏糖醇、氧化的赤藓醇和氧气。
本文所用的“变性剂”或“变性物”指能造成蛋白质的可逆展开的化合物或物质。变性剂或变性物的潜能是由变性剂或变性物的性质和浓度决定的。可接受的变性剂或变性物可能是离液剂、除垢剂、有机溶剂、水溶性溶剂、磷脂或两个或多个这样药剂的组合。可接受的离液剂包括但不限于尿素、胍和硫氰酸钠。有用的除垢剂可以包括但不限于强除垢剂如十二烷基硫酸钠或聚氧化乙烯醚(例如，Tween或Triton除垢剂)，温和的非离子除垢剂(如毛地黄皂苷)，温和阳离子除垢剂如N-[2，3-(二油基氧)-丙基]-N，N，N-三甲基铵，温和的离子除垢剂(如胆酸钠或脱氧胆酸钠)或两性离子除垢剂包括但不限于磺基甜菜碱(两性离子剂)，3-(3-chlolamidopropyl)二甲氨基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-chlolamidopropyl)二甲氨基2-烃基-1-丙烷-磺酸盐(CHAPSO)。有机溶剂，水溶性溶剂如吲哚乙腈，更低的链烷醇(特别是C2-C4链烷醇如乙醇或异丙醇)，或更低的链烷二醇(特别是C2-C4链烷二醇，如乙烯-乙二醇)可以作为变性剂。在本发明中有用的磷脂可能是天然产生的磷脂如磷脂酰乙醇胺，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇，或合成的磷脂衍生物或者变体如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
本文所用的“再折叠”描述了设计为转化多肽(使其从不正确的折叠或展开状态变成其天然的正确折叠结构)的任何过程或方法。
本文中所用的“共折叠”指再折叠过程、反应或方法，其中涉及至少两个相互作用多肽，其结果是从展开或不正确的折叠的状态的多肽向天然的正确折叠结构的多肽的转化。
优选的实施方案的描述本发明涉及IGF-I和IGFBP-3的共折叠，结果形成两种蛋白质的迅速高效的再折叠，从而产生天然的IGF-I和IGFBP-3，本发明还涉及用于天然IGF-I、IGFBP-3和IGF-I或IGFBP-3纯化的简化方法。本发明可按如下步骤进行a)将IGF-I和IGFBP-3以1比3到3比1的摩尔比率组合，然后使其变性并用还原剂还原，或者将IGF-I和IGFBP-3单个变性并还原，然后以1比3到3比1的摩尔比率组合，形成IGF-I/IGFBP-3复合物；b)把氧化剂添加至步骤(a)的IGF-I/IGFBP-3的混合物中；c)(此步可有可无)可以从IGF-I/IGFBP-3共折叠混合物中纯化IGF-I/IGFBP-3复合物；和d)(此步可有可无)IGF-I和IGFBP-3可单个从复合物中纯化。
利用各种宿主细胞，包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞系，依据本发明的用于共折叠的IGF-I和IGFBP-3可在各种高表达的系统中产生。在细菌宿主细胞中产生IGF-I和IGFBP-3是优选地。在大肠杆菌宿主细胞中产生IGF-I和IGFBP-3是更为优选地，包括但是不限于大肠杆菌菌株W3110DE3。
宿主细胞是由包含编码IGF-I或IGFBP-3的DNA的表达载体转化的。宿主细胞可以由本领域已知的各种技术转化，例如但不限于CaCl2用于细菌或酵母宿主细胞，CaPO4用于昆虫或哺乳动物宿主细胞，或电泳用于任何类型的宿主细胞。用于宿主细胞转化的方法可以在Sambrook等(1989)分子克隆实验手册(冷泉港出版社，冷泉港)和Ausubel(1987)分子生物学现代方案(John Wiley父子公司，纽约)中找到。
包含编码IGF-I或IGFBP-3的DNA的表达载体可通过本领域已知的标准方法构建。编码IGF-I或IGFBP-3的DNA可来源于天然来源，如基因组或cDNA文库，或通过化学合成。另外IGF-I或IGFBP-3的变体可用本领域已知的各种方法产生，其中包括定点基因突变。生产变体的方法可在Sambrook，同上和Ausubel，同上中找到。
转化的微生物宿主菌株是在液态培养基(含有可同化的碳源、氮源和无机盐)中，用本领域已知的方法培养。转化的昆虫哺乳动物细胞，是在含有本领域已知的可吸收的碳源、氮源和无机盐和可有可无的维生素、氨基酸、生长因子和其他蛋白质培养添加物的液体培养基中培养。用于培养的液体培养基可包含抗生素或抗真菌剂以阻止不受欢迎的微生物和(或)化合物，包括但不限于筛选包含表达载体的宿主细胞的抗生素。
IGF-I和IGFBP-3可通过本领域已知的各种方法从宿主细胞中纯化。正常情况下，在细菌宿主细胞中产生的IGF-I或IGFBP-3是难溶的或不溶的(以包含体形式存在)。对不能溶的蛋白质，可通过离心从宿主溶胞产物中收集。对难溶性蛋白质，可以加入化合物(包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI))以引起有部分溶解性的蛋白质沉淀。蛋白质沉淀可由离心方便地收集。
可以利用为本领域已知的一些药剂的任何一种，使不能溶解的或沉淀的IGF-I和IGFBP-3可溶。其中优选地是，用尿素或胍盐酸硫胺素的IGF-I或IGFBP-3是可溶的。
当IGF-I和IGFBP-3作为融合蛋白生产出来时，融合序列可以选择性地除去。融合序列的除去可以由酶促或者化学断裂完成，优选地是酶促断裂。利用本领域已知的方法完成酶促除去融合序列。为融合序列的除去所选择的酶将按融合的特性决定，同时反应条件将通过酶的选择加以确定，对本领域技术人员来说，这是明显的。切开的IGF-I或IGFBP-3可以进一步用已知方法从所切开的融合序列进行纯化。这些方法将由融合序列的特性和性质决定，而这对本领域技术人员是明显的。用于纯化的方法可以包括但不限于筛析色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析。
优选地是进一步纯化IGF-I或IGFBP-3，从蛋白质溶液除去DNA。DNA可用任何本领域已知的几种方法除去，如沉淀或离子交换色谱，但是由鱼精蛋白硫酸盐沉淀除去是优选地。IGF-I或IGFBP-3可以通过包括离心或过滤在内的方法从沉淀的DNA分离。
依据本发明的用于共折叠的IGF-I或IGFBP-3可以在DNA除去后直接使用，或利用本领域已知方法进一步纯化和(或)浓缩。相对不纯(粗)的IGF-I和IGFBP-3的共折叠的好处是增加产量并且简化天然IGF-I/IGFBP-3复合物的纯化。共折叠复合物的纯化只需要一个纯化方案(与此相对的是两个，即当对两个多肽在共折叠前分开纯化时)，并允许纯化方案利用天然IGF-I/IGFBP-3复合物的性质。
如果需要，可对IGF-I和IGFBP-3进一步纯化。IGF-I和IGFBP-3的纯化可以通过本领域已知的各种方法完成，包括疏水相互作用色谱、筛析色谱、离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等。另外的纯化也可以包括对纯化的蛋白质的干燥或沉淀的步骤。当IGF-I和IGFBP-3被干燥或沉淀时，蛋白质可以在在变性物中再溶解前组合，或单个再溶解并组合来用于共折叠。
IGF-I和IGFBP-3的变性可由各种变性剂完成，包括但不限于，尿素或胍。尿素为变性剂是优选的。变性可在一步中完成，其中IGF-I和IGFBP-3由浓的用于共折叠的变性剂溶液变性，或在两步中完成，其中IGF-I和IGFBP-3用高浓度的变性剂变性，随后稀释，产生含有一定浓度的变性剂的在共折叠中有用的溶液。在一步变性过程中，变性剂(这里变性剂是尿素)浓度优选地为大约1至2M。在两步变性过程中，变性剂的浓度(这里变性剂是尿素)优选地为大约5至7M，优选地是稀释成为大约1至2M以进行共折叠过程。
IGF-I和IGFBP-3的还原可以和变性同时完成，或者是在变性之后完成。IGF-I和IGFBP-3的还原可以通过各种还原剂完成，包括但不限于，二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇，半胱氨酸，半胱胺(2-氨基乙硫醇)，或还原的谷胱甘肽。优选地还原剂是二硫苏糖醇。如变性中所讨论的，IGF-I和IGFBP-3的还原可以是一步或两步，其中多肽由在共折叠过程中有用的一定浓度的还原剂还原，或者其中的多肽由高浓度的还原剂还原，随后将还原剂稀释到对共折叠有用的浓度。当还原剂是二硫苏糖醇时，还原剂的高浓度最好在大约30至50mM，用于共折叠的浓度最好大约5至15mM。
然后将变性的和还原的IGF-I和IGFBP-3溶液氧化形成二硫键。可接受的氧化剂包括但不限于，谷胱甘肽，胱氨酸，和胱胺。氧化剂优选地是胱胺。
共折叠可以无限的继续。然而，发明人已经发现IGF-I和IGFBP-3的共折叠实质上加速了共折叠的动力学过程。因此，这个反应可以继续更短的时间，短到1到2个小时。理想的是共折叠反应持续4个小时，更理想的是共折叠反应进行1到3个小时。
在完成共折叠反应后，可对天然的IGF-I/IGFBP-3复合物纯化。对天然的IGF-I/IGFBP-3复合物可用各种方法，包括但不限于，筛析、离子交换色谱、疏水相互作用色谱。优选地，天然IGF-I/IGFBP-3复合物用硫代丙基衍生化的柱色谱基质的阳离子交换色谱(如，SP-Sephadex，Pharmacia，Uppsala，瑞典)纯化。另外天然的IGF-I和IGFBP-3可从复合物中用各种方法进行纯化。通过解散复合物(最好是在酸性条件下)从复合物纯化IGF-I和IGFBP-3是优选的，随后通过筛析色谱分析。纯化的复合物或IGF-I或IGFBP-3可被交换到不同的缓冲液中和(或)通过本领域已知的各种方法浓缩。以下的实施例目的在于说明本发明。这些实施例无意以任何形式限制本发明的范围。
实施例实施例1.用于IGF-I和IGFBP-3生产的包含IGF-I和IGFBP-3序列的表达载体用以生产IGF-I和IGFBP-3的表达构建体类似于pJU1002和pJU1003(Squires等(同上)生物化学杂志26316297-16302)，除插入翻译耦合器下游的基因是辅酶-IGF(pER10088)，和IGFBP-3(pDJ12833)。此外，pER10088和pDJ12833不同于pJU1003在于它们不含有在那个质粒中的tet基因的5’末端的合成的16bp的衔接子序列；但是它们确实包含在pBR322-来源的骨架的单一PvulI位点的DNA插入物pER10088在那个位置包含接头5’...CCTCGAGG...3’；pDJ12833包含一个携带pSC101的par座的385bp片段(Meacock和Cohen(1980)细胞20529-542)。
pER10088包含开放读框(ORF)，该读框包括(按顺序，5’到3’)一个ATG三联体(起始)，酵母泛素的76密码子，成熟人类胰岛素生长因子I的70合成密码子和终止密码子。
PDJ12833包含ORF，其包括一跟随成熟人类的IGFBP-3的264密码子的ATG三联体。氨基-末端95密码子是合成的；其余部分来源于这个基因的天然的cDNA。
在每种情况之下，ORF相对于翻译偶合体的位置完全如Squires等(1988)对成纤维细胞生长因子的描述。
实施例2.IGF-I的重组产生IGF-I可以用如在实施例1中所描述的那些表达载体构建体生产。利用氯化钙转染，将用于IGF-I融合蛋白(PER10088)生产的表达构建体引入大肠杆菌菌株W3110DE3(Sambrook，同上)。
将W3110DE3/PER10088在37℃下在100升液体中培养直到培养物在600纳米的光密度(OD600)达到至少大约25。添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)到0.4mM诱导IGF-I表达。将诱导的细菌进一步培养，后经离心收集。沉淀的细胞在具有乙二胺四乙酸(EDTA)的醋酸钠缓冲液(50mM，pH＝5.5)中再悬浮。用Microfluidizer(M-210-EH型，Microfiuidics公司)对细菌进行透析。因为并非所有在这些宿主细胞中所产生的IGF-I融合蛋白都是不能溶解的，将聚乙烯亚胺(PEI)加入至浓度为0.1％，以沉淀可溶性和部分可溶的IGF-I融合蛋白。
不可溶解的和沉淀的IGF-I融合蛋白通过离心收集，然后用2M尿素，50mM磷酸钾，2mM二硫苏糖醇(pH值5.8-5.9)洗涤一次，通过离心回收。然后用6M尿素，20mM三氨基甲烷，30mM二硫苏糖醇，1mM乙二胺四乙酸(pH值＝8.0)将IGF-I沉淀溶解。把鱼精蛋白硫酸盐添加到浓度为0.14％，使DNA从溶液中沉淀。沉淀的DNA通过离心除去，含有IGF-I融合蛋白的上清液在Q-Sepharose上通过离子交换色谱进一步纯化。IGF-I融合蛋白以泛素水解酶消化，所述的水解酶来源于在大肠杆菌中表达pER1011(一个编码酵母泛素水解酶的表达载体(编码酵母泛素水解酶的序列如图8所示))，随后按照Liu等(1989)(生物化学杂志26420331-20338 PER1011与PJU1002类似，除了在PvuII位点存在5’...CCTCGAGG...3’接头外)进行纯化，产生成熟的IGF-I。
然后将IGF-I在2M尿素、10mM二硫苏糖醇和20％乙醇中，在10mM胱胺的存在下变性和再折叠。用在SP-琼脂糖凝胶上的阳离子交换色谱和用C18柱(Vydac)进行反相高性能液相色谱进一步纯化IGF-I。
实施例3.IGFBP-3的重组产生IGFBP-3可以用如在实施例1中所描述的那些表达载体构建体产生。利用本领域已知的方法(如在Sambrook，同上和Ausubel，同上中描述的)，将用于IGFBP-3 PDJ12833产生的表达构建体引入大肠杆菌菌株W3110DE3中并且分离克隆。
将克隆W3110DE3/PDJ12833在37℃下在100升液体中培养直到培养物达到在600纳米的光密度(OD600)为25。添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)到0.4mM诱导IGFBP-3的表达。将诱导的细菌进一步培养，后经离心收集。沉淀的细胞在具有乙二胺四乙酸(EDTA)的醋酸钠缓冲液(50mM，pH＝5.5)中再悬浮。用Microfluidizer(M-210-EH型，Microfiuidics公司)对细菌进行透析。
不可溶解的和沉淀的IGFBP-3通过离心收集，然后用2M尿素，50mM磷酸钾，2mM二硫苏糖醇(pH值5.8-5.9)洗涤一次，通过离心回收。然后用6M盐酸胍，100mM三氨基甲烷，25mM二硫苏糖醇，5mM乙二胺四乙酸(pH值＝8.0)将IGFBP-3沉淀溶解。然后用100mM三氨基甲烷，5mM乙二胺四乙酸(pH值＝8.0)将含IGFBP-3的溶液稀释。把鱼精蛋白硫酸盐添加到浓度为0.14％，使DNA从溶液中沉淀。沉淀的DNA通过离心除去，含有IGFBP-3的上清液通过50mM三氨基甲烷(pH＝10.6)进一步稀释。IGFBP-3在将胱胺加到6mM后进行隔夜再折叠。
用超滤作用将IGFBP-3溶液浓缩，然后通过对2M尿素，20mM三氨基甲烷(pH＝7.0)渗滤进行溶剂交换。使IGFBP-3在Q-琼脂糖凝胶，随后在SP-琼脂糖凝胶上进行离子交换色谱进行纯化。用C18柱(Vydac)通过RP-HPLC进一步纯化IGFBP-3。
实施例4.IGF-I和IGFBP-3的共折叠重组产生的IGF-I和IGFBP-3以等摩尔比率混合，然后由冻干法干燥。把干燥的蛋白质混合物溶解到变性/还原缓冲液中(80mM三氨基甲烷，pH值＝8.3，1.5M尿素，1mM乙二胺四乙酸，10mMDTT)，到最后的浓度为1mg/ml。将胱胺氢氯化物添加至最后浓度为10mM胱胺。单独地的IGF-I再折叠和单独的IGFBP-3再折叠作为对照。共折叠和再折叠反应物在5℃下温育。在加入胱胺以前立即取样(0小时)，和在这之后1，2，3，和4小时取样，对样品进行RP-HPLC分析。对0小时点的分析表明IGF-I和IGFBP-3都完全被还原。用Waters 626-1 HPLC仪在Poros R2/H柱(直径4.6mm，长为100mm)上用线梯度13.5％到54％的吲哚乙腈(带0.1％三氟醋酸)进行RP-HPLC。
IGF-I和IGFBP-3单独地再折叠给出低产率的天然蛋白质。IGF-I单独折叠只给出产量为13％，IGFBP-3单独折叠产生45.1％天然蛋白质。相对地，当共折叠时，实际上所有的IGF-I(99.6％)和大多数IGFBP-3(83％)都正确的折叠。这些结果表明IGF-I和IGFBP-3共折叠的结果在天然IGF-I和IGFBP-3的产量上有协同增加。
共折叠反应的分析还表明，除增加天然蛋白质的产量外，共折叠也改变再折叠的动力学。图9和图10显示了IGF-I和IGFBP-3单独的再折叠或共折叠的时间进程。共折叠方法增加了再折叠的初始速率和再折叠的最大速率以及再折叠的整个产量。
实施例5.共折叠的IGF-I和IGFBP-3的生物活性的测定这个实施例说明根据本发明的再折叠的IGF-I、IGFBP-3和IGF-I/IGFBP-3复合物有生物活性。
把人类骨肉瘤MG63细胞(5×105个细胞)平板接种在175培养瓶中，在细胞培养基(补充了10％胎牛血清、50单位/ml的青霉素，50μg/ml的链霉素，非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基)中培养。将培养瓶放在37℃下潮湿的5％CO2/95％空气中2-3天。在细胞的培养物变得汇合之前，将细胞从培养瓶取走，放在胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液中培养。加入培养基(6ml)以停止胰蛋白酶，将细胞转移到离心管中。将细胞在800xg离心5-10分钟，再在10ml的测试培养基(补充了50单位/ml的青霉素，50μg/ml链霉素，非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，2.5μg/ml牛纤连蛋白，5μg/ml的人类转铁蛋白，75μg/ml的卵清蛋白，3μM地塞米松的RPMI培养基)中悬浮。
将IGF-I参照标准和共折叠的IGF-I和IGFBP-3样品在96-孔平板中用测定培养基系列稀释。对通过共折叠方法再折叠的IGF-I/IGFBP-3复合物，IGF-I和IGFBP-3进行测试。每个孔包含标准或测试样品50μl。IGF-I的参照标准的浓度范围是0.244～500ng/ml。
将已经在测定培养基上制备了的MG63人类骨肉瘤细胞，以5000/孔平板接种，容积为50μl/孔。在每个孔中总体积是100μl。将平板放在37℃下潮湿的5％CO2/95％空气中4天。
在培养后期，通过测量磷酸酶活性来测定细胞生长，其与骨肉瘤的数量成比例的。将平板从培养箱中取出，并将培养基从孔中吸出。每个孔各用200μl的磷酸缓冲盐水冲洗。在每个孔中加入100μl的10mM对-硝基苯基磷酸盐，100mM醋酸钠，1％Triton X-100(pH＝5.5)，将平板在37℃下培养2小时。在每孔中加入10μl的1.0N的氢氧化钠来阻止磷酸对对-硝基苯基磷酸盐的水解。将平板在室温上培养最少10分钟。测量在405nm处的吸收率，同时参考在490nm处的吸收率。
从每个孔的吸收率减去背景吸收率。将平均吸收率作为IGF-I浓度的函数作图。ED50(IGF-I吸收率的值是最大吸收率的一半时的浓度)是从剂量-反应曲线就每种样品和参考标准计算的。每种样品的活性可表达为IGF-I参考标准的ED50与样品的ED50的比率。
本文已经通过直接描述和实施例对本发明进行了详细描述。与本发明等同的和修饰的对本领域技术人员是很明显的，并且包括在本发明的范围内。
权利要求
1.一种用于产生天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物的方法，该方法包括使所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物变性；使IGF-I和IGFBP-3的混合物还原，由此形成还原的和变性的IGF-I和IGFBP-3的溶液；向所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物加入氧化剂；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物。
2.一种用于产生天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物的方法，该方法包括使IGF-I变性；使所说的IGF-I还原，由此产生还原的和变性的IGF-I；使IGFBP-3变性；使所说的IGFBP-3还原，由此产生还原的和变性的IGFBP-3；混合所说的还原的和变性的IGF-I与还原的和变性的IGFBP-3，从而形成还原的和变性的IGF-I和IGFBP-3的混合物；在还原的和变性的IGF-I和IGFBP-3的混合物中加入氧化剂；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物。
3.一种用于产生天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物的方法，该方法包括使IGF-I变性，由此产生变性的IGF-I；使IGFBP-3变性，由此产生变性的IGFBP-3；混合所说的变性的IGF-I与变性的IGFBP-3，从而形成变性的IGF-I和IGFBP-3的混合物；使所说的变性的IGF-I和IGFBP-3的混合物还原，从而形成变性的和还原的IGF-I和IGFBP-3的混合物；在变性的和还原的IGF-I和IGFBP-3的混合物中加入氧化剂；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物。
4.权利要求1的方法，该方法还包括从所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物分离所说的天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物。
5.权利要求1的方法，该方法还包括从所说的天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物分离天然的IGF-I。
6.权利要求1的方法，该方法还包括从所说的天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物分离天然的IGFBP-3。
7.权利要求1的方法，该方法还包括在添加所说的氧化剂之前稀释所说的变性的和还原的IGF-I和IGFBP-3的混合物的步骤。
8.权利要求1的方法，其中所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物的摩尔比率大约为1比3到3比1。
9.权利要求1的方法，其中所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物的摩尔比率大约为1.5比1到1比1.5。
10.权利要求1的方法，其中所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物由尿素或胍变性，所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物由二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺，或还原的谷胱甘肽还原，所说的氧化剂是胱氨酸、胱胺、氧气、氧化的二硫苏糖醇、氧化的二硫赤藓糖醇，或氧化的谷胱甘肽。
11.权利要求1的方法，其中所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物由尿素(浓度大约在1到2M)变性，所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物由二硫苏糖醇(浓度大约在5至15mM)还原，所说的氧化剂浓度大约在5至15mM。
12.一种用于产生天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物方法，该方法包括使IGF-I变性；使所说的IGF-I还原；加入天然IGFBP-3，由此形成IGFBP-3与还原的和变性的IGF-I的溶液；在所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物中加入氧化剂；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物。
13.一种用于产生天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物方法，该方法包括使IGFBP-3变性；使所说的IGFBP-3还原；加入天然的IGF-I，由此形成IGF-I与还原的和变性的IGFBP-3的溶液；在所说的IGF-I和IGFBP-3的混合物中加入氧化剂；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的复合物。
全文摘要
本发明提供了一种新的用于再折叠类胰岛素生长因子I(IGF－I)和类胰岛素生长因子结合蛋白－3(IGFBP－3)的方法。该方法涉及在共折叠反应中混合IGF－I和IGFBP－3。本发明的共折叠方法的结果是使两种分子的正确地折叠的蛋白质实质上有更高的产量,并且改变再折叠的动力学。该方法包括正确地折叠的IGF－I,IGFBP－3,和/或IGF－I/IGFBP3复合物。
文档编号C07K1/113GK1214689SQ96195432
公开日1999年4月21日 申请日期1996年5月30日 优先权日1995年6月7日
发明者A·索莫, Y·奥加瓦, P·陶 申请人:塞尔特里克斯药物公司