抗Fas配体抗体和利用抗Fas配体抗体的测定方法

专利名称：：抗Fas配体抗体和利用抗Fas配体抗体的测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗Fas配体抗体和一种利用抗Fas配体抗体的测定方法。更具体而言，本发明涉及一种应用抗Fas配体抗体测定人体液中的Fas配体的方法以及适合用于这种测定的抗体。本发明也涉及一种对Fas配体诱导的凋亡有高度抑制作用的抗Fas配体抗体。本发明还涉及产生这种抗体的杂交瘤或细胞系。
背景技术：
：人Fas配体是一种多肽，Nagata等人报道它是一种能诱导表达Fas抗原的细胞发生凋亡的生物分子(Takahashi.T.等，《国际免疫学》(InternationalImmunology)，卷6，1567-1574，1994)。人Fas配体是一种属于TNF家族的II型膜蛋白，分子量约40KD。据估计人体内Fas配体就象TNF的情形一样，是以三聚体的形式存在(Tanaka，M.等，《欧洲分子生物学组织杂志》，(EMBOJournal)卷14，1129-1135，1995)。人Fas配体的胞外区与大鼠Fas配体的胞外区(Suda，T.等《细胞》(Cell)，卷75，1169-1178，1993)和小鼠Fas配体的胞外区(Takakashi，T.等《细胞》(Cell)卷76，969-976，1994)高度同源。人的Fas配体不仅识别人的Fas抗原，而且还识别小鼠的Fas抗原并诱导凋亡。反过来，大鼠的Fas配体和小鼠的Fas配体识别人的Fas抗原并诱导凋亡。凋亡因与机体自身稳定密切相关而引起了人们的注意。上文提及的不同物种间Fas配体具有同源性提示了由Fas配体和Fas抗原介导的凋亡在机体自身稳定中发挥重要作用。最近，Fas配体和Fas抗原异常与一种自身免疫病之间存在的有趣的关系已被报道。这篇报道指出MRL-lpr/lpr(一种自身免疫病的模型小鼠)的Fas抗原基因有突变，而表达这种突变Fas抗原基因的细胞不能诱导凋亡(Watanabe-Fukunnaga.R等.《自然》(Nature)卷356，314-317，1993；Adachi，M.等《国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，卷90，1993)。同时，也有报道指出C3H-gld/gld(另一种自身免疫病模型小鼠)的Fas配体基因有突变，并且gld小鼠的Fas配体没有诱导凋亡的活性。gld小鼠的Fas配体基因的突变是一种点突变，这种点突变的结果是Fas配体胞外区C末端的第7个氨基酸被另一个氨基酸所代替(Tomohiro，Takahashi，等，《细胞》(Cell)，卷76，969-976，1994)。上述的gld小鼠的Fas配体不能与Fas抗原相结合(FredRamsdell等，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)，卷24，928-933，1994)。上述发现产生了这个假说一些自身免疫病是由Fas抗原或Fas配体的异常诱导的，也就是说是由留在体内的自身反应性T细胞诱导的，这些细胞如果正常的话应以发生凋亡的方式从体内清除的。最近，人们认为风湿病中滑膜的异常增生也是由细胞不能正常地凋亡而引起的。Kobayashi，M.等进一步推断AIDS病毒感染后T细胞数目的减少是由Fas配体介导的，因为T细胞膜上Fas抗原的表达是由AIDS病毒感染诱导的(Nikkei，《科学》(Science)，卷6，34-41，1993)。因为Fas配体-Fas抗原介导的凋亡与疾病之间的关系逐渐被搞清楚，所以人们越来越期望能用Fas配体或Fas抗原治疗与凋亡异常相关的疾病，如上面提到的自身免疫病、风湿病以及AIDS。Nagata等还报道他们成功地获得一种抗Fas配体的抗体，并且这种抗体能够抑制凋亡(MasatoTanaka等，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBOJournal)，卷14，1129-1135，1995；国际专利申请公开号WO95/13293)。
发明内容如上所述，Nagata等已经作了一系列深入研究工作以分离Fas配体和制备抗这种Fas配体的抗体。然而，到目前为止尚无关于准确测定人体液中Fas配体的报道，并且可溶性Fas配体在人体液中是否存在也不能确定。通常认为有生理活性的细胞因子象Fas配体是局部少量产生以在局部介导反应。这样的细胞因子通常半衰期短，并且介导完一个反应后，被迅速地从组织或血液中清除。因此，象Fas配体这样的细胞因子在外周血中不易测出。最初报道Fas配体是一种跨膜蛋白(膜结合蛋白)，并且在一项体外实验中于某些特殊的条件下Fas配体可从细胞上释放下来。(MasatoTanaka等，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBOJournal)，卷14，1129-1135，1995)。这样的现象在体内生理条件下能否发生还不知道，人体液中是否有Fas配体存在也不知道。即使Fas配体在人体液中存在，估计它的浓度也非常低，并且在这样低的浓度下测定Fas配体会非常困难。此外，体液中可能存在着各种各样干扰免疫测定的物质；因此，这就要求建立一个高敏感性和高特异性的Fas配体测定系统和一种适合用于这种测定的抗体。鉴于Fas配体与各种已指明疾病之间的关系，相信用测量体液中Fas配体的浓度作为一种诊断这样的疾病的方法会有临床价值。然而，到目前为止尚无关于人体液中Fas配体浓度波动的报道。鉴于有的疾病使用一种象Fas配体这样的诱导凋亡的物质可能有效，将来会对患有这样疾病的病人给予Fas配体或影响Fas配体活性或表达的物质，所以能够测出人体液中Fas配体的浓度就非常必要，这样就可以监测血中浓度和判断治疗效果。因此人们期待着有一种高敏感性、高特异性的Fas配体测定方法。至于中和性抗体，人们期待会有一种有更高中和活性、作用机制更清楚的中和抗体；并且由于要用于治疗，出于有效性和安全性的原因，人们期待会有一种能在低剂量下抑制凋亡的抗体。不幸的是，对人的治疗使用非人源的单克隆抗体如小鼠的单克隆抗体有一些缺陷，尤其是在重复性治疗方案中，这将在下面解释。举个例子，小鼠的单克隆抗体循环半衰期相对短些，而且当用于人时缺少其它的一些重要的免疫球蛋白功能特性。也许更重要的是，非人源性单克隆抗体包含相当程度的当给病人注射时具有免疫原性的氨基酸序列。大量的研究表明，在注射了外源性抗体之后，病人针对这种抗体而产生的免疫反应相当强，在最初的治疗以后基本可以抵消抗体的治疗作用。而且，因为用于治疗各种疾病的不同种小鼠和其它有抗原性(对人而言)的单克隆抗体数量不断增加，以任何不同的非人源性单克隆抗体治疗一次或数次后，接下来的即使是无关联的治疗也会由于交叉反应而无效甚或有害。虽然所谓的“嵌合抗体”(如小鼠可变区与人的恒定区连接)的制备取得了一定程度的成功，但仍然存在明显的免疫原性的问题。一般来说，使用典型的人单克隆抗体制备技术制备与Fas配体相互作用的人免疫球蛋白，就象制备与许多抗原相互作用的人免疫球蛋白一样是极其困难的。同样地，使用重组DNA技术制备所谓的“人源化”或“重构”抗体其效果难以保证，这部分归因于不能预测产生的免疫球蛋白的亲和力(例如，请参见Jones等，《自然》(Nature)，321，522-525(1986)；Shearman等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)147卷，4366-4373(1991)；Keetleborough蛋白质工程4，773-783(1991)；Gorman等.《国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88卷，4181-4185(1991)；Tempest等，《生物技术学》(Biotechnology)，9卷，266-271(1991)；Riechmann等，《自然》(Nature)，332卷，323(1988)和EPO出版号0239400，在此引入以供参考)。此外，期待得到能与来源于Fas配体的特定多肽相互作用的抗体，即已知其与Fas配体结合部位的抗体，以对Fas配体进一步研究并对其功能进一步分析。本发明的一个目的是提供一种抗Fas配体抗体和一种应用这种抗体的测定方法；更具体地讲，是一种应用抗Fas配体测定人体液中Fas配体的方法以及适宜应用于这种测定方法的抗体。本发明的另一个目的是提供一种抗Fas配体抗体，它对Fas配体诱导的凋亡表现出高度抑制，如抑制50％或更高；并且该抗体是一种人源化的抗体。本发明的再一个目的是提供产生这样的抗体的杂交瘤或细胞系。还有，本发明也提供包括至少一种前述的本发明的抗Fas配体抗体作为不可缺少的成分或有效成分的新型组合物或药剂，同时也提供用来治疗伴随着、起因于或涉及Fas/Fas配体系统异常或通过Fas抗原导致的凋亡异常的全身性或局部病理状况或疾病的方法，该方法包括给病人注射有效治疗剂量的一种抗Fas配体抗体以抑制表达Fas抗原的细胞发生凋亡。附图简述图1.一幅图解式图，说明推测的人Fas配体胞外区的表位区以及推测的表位区中的氨基酸序列或多肽。图2.一张照片，代替附图，显示用抗M52多肽的单克隆抗体对Fas配体进行Western印迹得到的结果。图3.一幅图，说明抗M52多肽的单克隆抗体对凋亡诱导活性的影响。图4.一幅图，说明抗Fas配体抗血清(批号8-2)中的抗体滴度。图5.一幅图，说明F919-9-18单克隆抗体的凋亡抑制活性。图6.一幅图，说明来源于酵母的Fas配体的胞外区经凝胶过滤层析所得的结果。图7.一幅图，是应用多克隆抗体的夹心EIA系统的标准曲线。图8.一幅图，说明正常人血清在夹心EIA系统中的作用。图9.一幅图，显示患各种疾病的病人血清中Fas配体的浓度。图10.一幅图，说明小鼠F919抗体轻链可变区cDNA序列和翻译后的氨基酸序列。其互补决定区(CDRs)下划单线，成熟链的第一个氨基酸下划双线。图11.一幅图，说明小鼠F919抗体重链可变区cDNA序列和翻译后的氨基酸序列。其互补决定区(CDRs)下划单线，成熟链的第一个氨基酸下划双线。图12.一幅图，说明人源化F919抗体变体2轻链可变区DNA序列和翻译后的氨基酸序列。在其互补决定区(CDRs)下划单线，成熟链的第一个氨基酸下划双线。图13.一幅图，说明人源化F919抗体变体2重链可变区DNA序列和翻译后的氨基酸序列。在其互补决定区(CDRs)下划单线，在成熟链的第一个氨基酸下划双线。图14.一幅图，说明小鼠的与人源化的F919抗体变体1的竞争性结合。在有放射性标记的示踪物小鼠F919抗体存在时，以浓度逐渐升高的预冷的竞争性抗体与表达Fas配体的1A12转染细胞共同孵育，并测定放射活性的结合/游离的比率。所示的结果是两个样品的平均值。图15.一幅图，说明小鼠的和人源化的F919抗体变体2的竞争性结合。在有放射性标记的示踪物小鼠F919抗体存在时，以浓度逐渐升高的预冷的竞争性抗体与表达Fas配体的1A12转染细胞共同孵育，并测定放射活性的结合/游离的比率。所示的结果是两个样品的平均值。图16.一幅图，说明小鼠F919抗体和人源化的F919抗体(变体1)的凋亡抑制活性。所示结果是三个样品的平均值。图17.一幅图，说明小鼠F919抗体和人源化的F919抗体(变体2)的凋亡抑制活性。所示结果是三个样品的平均值。图18.一幅图，是用两种单克隆抗体作夹心EIA所得的标准曲线。图19.一幅图，表示一个HIV病毒感染者的一组血清中Fas配体浓度的变化。图20.一幅图，表示一个甲肝病毒感染者的一组血清中Fas配体浓度的变化。图21.一幅图，表示一个乙肝病毒感染者的一组血清中Fas配体浓度的变化。图22.一幅图，表示一个丙肝病毒感染者的一组血清中Fas配体浓度的变化。实施发明的最佳方式自此之后将对本发明详细叙述。下文所述的抗体由本发明提供。一种抗Fas配体的中和抗体(自此之后有时会称之为中和抗体)，它是(1)一种抗Fas配体的抗体，对Fas抗原表达细胞由Fas配体诱导的凋亡有高度抑制活性，在30μg/ml时凋亡抑制率可达50％或更高，优选10μg/ml，更优选3μg/ml，再更优选1μg/ml，最优选0.3μg/ml。(2)一种至少识别一种有生物活性的Fas配体的抗Fas配体抗体。(3)一种不识别任何无生物活性Fas配体的抗Fas配体抗体。(4)一种具有(2)和(3)特点的抗Fas配体抗体。(5)根据(2)或(4)的抗Fas配体抗体，其中有生物活性的Fas配体如实例中所描述的那样，至少是Fas配体的胞外区、游离Fas配体、Fas配体胞外区的缺失突变体多肽nd5、nd12、nd20、nd32和nd42和人Fas配体胞外区的置换突变体L179F之一。(6)根据(3)、(4)或(5)的抗Fas配体抗体，其中无生物活性的Fas配体至少是Fas配体胞外区的缺失突变体多肽nd49、Fas配体胞外区的缺失突变体多肽cd179和以硫酸铵盐析因聚集反应而变性的Fas配体之一。(7)一种具有(1)和(2)特点的抗Fas配体抗体。(8)一种抗Fas配体抗体，与人Fas配体结合的亲和常数至少是107M-1，优选108M-1，更优选109M-1，特别优选1010M-1或更高。(9)根据(1)～(7)任何一条的抗Fas配体抗体，与人Fas配体结合的亲和常数至少是107M-1，优选108M-1，更优选109M-1，特别优选1010M-1或更高。(10)一种抗Fas配体抗体，至少包括图10或图11所示的互补决定区(CDRs)之一，优选全部包括。(11)根据(1)～(9)任何一条的抗Fas配体抗体，至少包括图10或图11所示的互补决定区(CDRs)之一，优选全部包括。(12)一种作为人源化免疫球蛋白(Ig)的抗Fas配体抗体，它包括人受者Ig框架区(FR)至少之一，优选全部包括，并且包括能与人Fas配体特异结合的非人供者Ig的CDRs至少之一，优选全部包括。(13)根据(1)～(11)任何一条的抗Fas配体抗体，是根据(12)的人源化免疫球蛋白(Ig)。(14)根据(12)或(13)的抗Fas配体抗体，其中非人供者的Ig是根据(1)～(11)任何一条的抗Fas配体抗体。(15)根据(14)的抗Fas配体抗体，其中非人供者的Ig是小鼠F919-9-18抗体。此处所用的术语中和抗体是指对Fas抗原表达细胞由Fas配体诱导的凋亡有抑制活性的抗体，用实例1-3中所描述的方法或用一种已知的方法测定凋亡的水平(用放射活性或特异裂解(％)表示)，中和抗体表现出的凋亡水平比对照组如未加抗体组的水平要低。更进一步讲，中和抗体是以下面的公式计算对凋亡的抑制可达10％或更高的抗体，优选30％或更高，更优选50％或更高，最优选90％或更高。术语Fas配体的生物活性是指Fas配体能诱导或抑制Fas抗原表达细胞发生凋亡的活性，可以通过实例1-3所描述的方法进行测定；或者也可以通过一种已知的方法进行测定。术语抗Fas配体抗体是指具有识别Fas配体或与Fas配体反应活性的抗体，并且包括可以通过本发明所述的任何方法或通过一种已知的方法确认能与Fas配体抗原(如Fas配体的胞外区)相结合的抗体。本发明还提供[2]针对来源于Fas配体的特定肽的抗Fas配体抗体。(1)一种与该肽特异性反应的抗Fas配体抗体。(2)根据(1)的抗Fas配体抗体，其中的肽选自序列鉴定号1-8的肽。(3)根据(1)的抗Fas配体抗体，其中的肽是序列鉴定号1或6的肽。(4)根据(1)的抗Fas配体抗体，其中的肽是序列鉴定号1的肽。(5)根据(4)的抗Fas配体抗体，其中肽的区域与序列鉴定号1氨基酸序列所描述的氨基酸序号1-9或10-20相对应。本发明中的抗体[1]是识别对Fas配体生物活性表达至关重要的表位的抗体。这样的表位被确信是在有生物活性的Fas配体上所表达的，而不是在无生物活性的Fas配体上所表达的。举例说明一下，前者有Fas配体的胞外区，游离Fas配体，Fas配体胞外区的缺失突变体多肽nd5、nd12、nd20、nd32和nd42和人Fas配体胞外区的置换突变体L179F；后者有Fas配体胞外区的缺失突变体多肽nd49，人Fas配体胞外区的缺失突变体多肽cd179和实例4-1中所描述的硫酸铵盐析所形成的Fas配体胞外区的聚集体。本发明还提供如下抗Fas配体抗体，它们在以下[实例]所述的实验中在标准的结合条件下(即生理盐水或血清)与Fas配体的亲和常数至少为约107M-1，优选108M-1，更优选109M-1，最优选1010M-1或更强。本发明也提供如下抗Fas配体抗体，它包括图10或图11所示的互补决定区(CDRs)中的至少一种，优选3种，更优选全部。本发明[1]的抗体的优选实施方案包括杂交瘤F919-9-18产生的单克隆抗体；识别的表位与这样的单克隆抗体所识别的表位相同的抗体；和与这样的单克隆抗体竞争性结合相应抗原的抗体。本发明[1]的抗体能够高度抑制凋亡。本发明[1]的抗体也可应用于一种测定方法，其中Fas配体，尤其是人体液中有生物活性的Fas配体可以高度敏感地被测定，因为这些抗体识别Fas配体。尤其是有生物活性的Fas配体。本发明[2]的抗体的优选实施方案包括由F918-7-3、F918-9-4、F918-20-2等杂交瘤产生的抗体，识别的表位与这样的抗体所识别的表位相同的抗体；以及与这样的抗体竞争性结合相应抗原的抗体。前面所提的[2](5)的抗体中，其中特异地与由序列鉴定号1的肽中氨基酸1-9组成的肽反应的抗体包括F918-7-3；与由序列鉴定号1的肽中氨基酸10-20组成的肽反应的抗体包括F918-9-4和F918-20-2。本发明[2]中的抗体和Fas配体特异性结合，也和参与反应的Fas配体的区域已经搞清的特殊物种的Fas配体特异性结合。因此，这样的抗体可用于对人体液中的Fas配体进行高敏感性测定。这样的抗体也可用于选择性地测定一种或多种特殊的Fas配体。本发明的抗Fas配体抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，只要它结合Fas配体或来源于Fas配体的多肽。不过，鉴于单克隆抗体特性明确，它更为优选。抗体，即免疫球蛋白，包括重链和轻链，根据重链的类型分成五类(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)。五类中IgG和IgA根据重链的类型又可分成亚类。本发明的抗Fas配体抗体可属于其中的任何一类和任何一亚类。免疫球蛋白可以分成两个片段，例如，用胃蛋白酶消化后分成F(ab′)2和Fc′，用木瓜蛋白酶消化后分成Fab和Fc。本发明中的抗体既可以是完整的抗体，也可以是组成抗体一部分的片段，只要这个片段能够与抗原相结合。本发明中的抗体也可以是嵌合抗体或人的抗体。本发明中的抗体也包括用已知方法连接了各种标记物的标记抗体以及与另一种物质如多肽、免疫毒素融合在一起的融合抗体。抗体的基本结构单位包含一个四聚体。每一个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对里有一条“轻”链(约25KD)和一条“重”链(约50-70KD)。每一条链的NH2-未端以约100-110或更多个氨基酸的可变区开始，主要负责抗原的识别。每一条链的COOH部分是一个恒定区，主要负责效应功能。轻链要么是Kappa型，要么是lambda型。重链又可分为gamma，mu，alpha，delta和epsilon，分别决定了抗体的同种型，即IgG、IgM，IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区被一个约有12或更多个氨基酸的“J”区连在一起，重链还包括一个约有10多个氨基酸的D区(请参见《基础免疫学》(Fundamentallmmunology)，Paul，W.编辑，第七章，131-166页，RavenPress.N.Y.(1984)，在此引入以供参考)。每一对轻链/重链的可变区形成了抗体的结合部位。这些链均表现出相同的基本结构，即相对保守的框架区被三个高变区，也称为互补决定区域或CDRs连接起来(请参见“免疫相关蛋白的序列”KabatE.等，U.S.DepartmentofHealthandHumanSeruices，(1987)；和ChothiaandLesk，《分子生物学杂志)》(J，MolBiol)196.901-917，(1987)在此引入以供参考)。每一对的两条链的CDRs通过框架区而密切合作以便能与特异的表位相结合。象此处所用的那样，术语“免疫球蛋白”是指一种蛋白，它包含一条或多条基本由免疫球蛋白基因编码的多肽。已经确认的免疫球蛋白的基因包括Kappa，Lanbda，alpha，gamma，delta，epsilon和mu的恒定区基因以及大量的免疫球蛋白的可变区基因。免疫球蛋白可以以除抗体以外的许多形式存在；包括，如Fv，Fab和F(ab′)2，以及双功能杂合抗体(例Lanzavecchia等，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol)，17，105(1987))和单链(如Huston等，《国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.)，85，5879-5883(1988)和Bird等，《科学》(Science)242，423-426，(1988)，在此引入以供参考)。(请参见，Hood等，《免疫学》(Immunology)，Benjamin，N.Y.，2nded.，(1984)，HarlowandLane，《抗体实验室手册》(AntibodiesAlaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory(1988)和HunkapillerandHood，《自然》(Nature)，323，15-16(1986)，在此引入以供参考)。众所周知，天然形式的“成熟免疫球蛋白”在长度方面有一定程度的变化，这是因为序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、置换、插入或加入。因此，可变区和恒定区两者均易发生大量的自然的修饰，而它们又基本一致并能保持各自的活性。根据已经熟知的方法，人恒定区DNA序列和重排的可变区DNA序列可以从许多人的细胞，优选永生化B细胞中分离出来。同样的方法可以用来从非人源细胞中分离非人免疫球蛋白序列。用于分离DNA序列的适宜的来源细胞和用于表达和分泌免疫球蛋白的宿主细胞有许多来源途径，如美国典型培养物保藏中心(“细胞系和杂交瘤目录”，第五版(1985)，Rockville，Maryland，U.S.A.，在此引入以供参考)。除了这些“天然存在”形式的免疫球蛋白链之外，利用本领域技术人员熟知的各种重组DNA技术很容易设计和制备“基本一致”的经修饰的重链和轻链。例如，这些链可以通过数个氨基酸的置换、末端或中间插入和缺失等等而在一级结构水平上与天然存在的序列不同。另外，可以制备只包括一部分一级结构的多肽片段，这些片段有一种或多种免疫球蛋白活性(如结合活性)。尤其是人们已经注意到，象许多基因一样，免疫球蛋白相关基因有不同的功能区，每个区有一种或多种不同的生物活性。通常来说，利用许多已经熟知的技术，如定点诱变技术，很容易对编码想得到的表位结合成份的基因进行修饰(参见，GillmanandSmith，《基因》(Gene)，881-97(1979)和Roberts.S.等，《自然》(Nature)，328731-734(1987)，两者在此引入以供参考)。在本发明的优选实施方案中，表位结合成份是由“嵌合的”或“人源化的”免疫球蛋白基因编码(参见，CoandQueen(1991)，《自然》(Nature)，351501)。嵌合抗体，其轻链和重链的基因是由分属不同物种的免疫球蛋白基因片断构建而成，构建的方法通常是基因工程方法。例如，来自小鼠的单克隆抗体的基因可变区片段(V)可以连接于人的恒定区片段(C)，如γ1和γ4。因此，典型的治疗性嵌合抗体是一种杂合蛋白，这种蛋白是由来自小鼠抗体的V或抗原结合功能区和来自人抗体的C或效应功能区组成，尽管来自其他哺乳动物的也可以被采用。象此处所用的那样，术语“框架区”是指免疫球蛋白重链/轻链可变区的一些部分，它们在一个物种的不同免疫球蛋白中相对保守(如，CDRs之外的部分)，如Kabat等的定义，见所引的文献。象此处所用的那样，术语“人框架区”是指与天然存在的人抗体框架区基本一致(达约85％或更高)的一种框架区或抗体中一些共同序列等。象此处所用的那样，术语“人源化的免疫球蛋白”是指一种免疫球蛋白，它包括一个人的免疫球蛋白框架、至少一个非人抗体的CDRs，并且其中的任何恒定区与人免疫球蛋白的恒定区基本一致，即，至少约85-90％，优选至少95％一致。因此，可能除了CDRs，人源化的免疫球蛋白的所有部分均与一种或多种天然的人免疫球蛋白序列的相应部分基本一致。例如，人源化免疫球蛋白不包括由小鼠可变区/人恒定区组成的嵌合抗体。作为本发明的更优选方式，本发明还提供能特异性地与Fas配体结合、属于人源化免疫球蛋白的抗Fas配体抗体。更具体地讲，本发明提供根据本发明任何一种抗体的抗Fas配体抗体，其为人源化免疫球蛋白，包括来源于多个，优选一个人受者的免疫球蛋白的至少一个框架区，优选一条链的所有框架(4个)，更优选所有框架区(每条链上有4个)，和多于1个，优选所有的(每条链上有3个)来源于非人供者，优选啮齿类，更优选小鼠的能与Fas配体特异性结合的免疫球蛋白的互补决定区。这些免疫球蛋白可有两对轻链/重链复合体，其中至少一条链，尤其是重链包括一个或多个，优选所有的(3个)与人的框架功能性相连的供者(小鼠)免疫球蛋白的CDRs，例如，供者(小鼠)的CDRs，无论有或没有额外的自然相连的供者(小鼠)的氨基酸残基，均可被导入人的框架区以制备人源化的免疫球蛋白，它能与Fas配体结合，亲和力水平强于约107M-1。这些人源化的免疫球蛋白也能阻断提供CDRs的小鼠单克隆抗体与Fas配体的结合。在优选实施方案里，一个或多个CDRs将来源于本发明中的抗体，优选根据发明[1]中任何一种的非人供者抗体，尤其是F919-9-18抗体，并且人源化的免疫球蛋白将属于IgG1或IgG4同种型。更确切地讲，本发明的人源化免疫球蛋白包括至少一个，优选全部的(每条链上有3个)CDRs，其每一个均包含或由序列鉴定号11，13，15，19，21或23的氨基酸序列组成。优选人源化免疫球蛋白的每一个CDR和框架区的位置与它们所来源的供者免疫球蛋白的对应部分相当。通常情况下，本发明的人源化抗体将包括重链可变区序列，其中人源化免疫球蛋白重链可变区框架的序列与供者免疫球蛋白重链可变区框架的序列65％或65％以上但95％或95％以下一致(即序列同源性百分比)，优选70％或70％以上但90％或90％以下一致。通常情况下，人们选择来自于同一个人抗体的重链和轻链以减小不相匹配的可能性，但来自于两个不同人抗体的重链和轻链也可使用。至于人框架区，要把提供CDR的非人免疫球蛋白的框架区或可变区的氨基酸序列与人免疫蛋白的序列库中的相应序列进行比较，并选择有高度同源性的序列。优选框架氨基酸序列同源性达60％或60％以上，更优选65％或65％以上。受者免疫球蛋白重链可变区序列优选在与供者免疫球蛋白重链可变区序列最为同源的人免疫球蛋白重链可变区代表性序列库的5段序列中，更优选3段序列中。人源化免疫球蛋白的设计可按下面所述进行。(1)当一个氨基酸属于下述类型时，要用的人免疫球蛋白(受者免疫球蛋白)框架氨基酸可以被提供CDR的非人免疫球蛋白(供者免疫球蛋白)的框架氨基酸所代替(a)受者免疫球蛋白人框架区的氨基酸在那个位置对人免疫球蛋白来说不同寻常，而供者免疫球蛋白相应的氨基酸在那个位置对人免疫球蛋白来说有代表性；(b)氨基酸所在的位置紧邻一个CDR；或者(c)氨基酸至少有一个原子与免疫球蛋白三级结构模型中的CDR距离为约5以内，优选4以内，更优选3以内(参见Co等，《国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，88，2869(1991))。(2)当受者免疫球蛋白人框架区的每一个氨基酸和供者免疫球蛋白的相应氨基酸在那个位置对人免疫球蛋白来说都不同寻常时，这样的氨基酸就可以被在那个位置对人框架区有代表性的氨基酸置换。关于获得人源化免疫球蛋白的详细叙述(参见，Queen等，《(国家科学院院刊》(Proc.Natl，Acad，Sci.U.S.A.)86，10029(1989)，国际专利申请公开号WO90/07861和WO92/11018，Co等，《国家科学院院刊》(Proc，Natl，Acad.SciU.S.A.)，88，2869(1991)，Co和Queen，《自然》(Nature)，卷351，501(1991)和Co等《免疫学杂志》(J.Immunol，)148，1149(1992)，在此引入以供参考)。通常符合上述标准的所有或绝大部分氨基酸均被置换是可取的。然而，有时并不清楚是不是每一个氨基酸都符合上述标准，这样就制备了各种各样的置换免疫球蛋白，它们有的有特异性置换，有的没有。本发明的人源化抗体通常用相应的供者(小鼠)框架残基在至少第1，3，5，更常见在第7位上置换人轻链框架残基。而且，当人的框架是来自Eu抗体，特别当CDR供者是小鼠F919-9-18的时候，氨基酸的置换包括在表4和5中所列的位置的置换。人源化抗体通常也包括用相应的供者(小鼠)重链框架残基在至少第1，3，5，7，9，11，13，更常见在第16位上进行置换。而且，当人的框架是来自Eu抗体，特别是当CDR供者是小鼠F919-9-18的时候，氨基酸的置换包括表4和表5中所列的位置上的置换。通常这些位置可以用含有典型氨基酸或类似氨基酸的人免疫球蛋白相应位置的氨基酸置换。再者，框架区某些位置上的氨基酸可以直接与抗原相互作用，比如通过非共价键相互作用。这些位置上的氨基酸可以被置换。尤其是人们相信重链26-30位的氨基酸被包括在一个高变环里(Chothia和Lesk，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，196，901-917(1987))，那么这些位点的氨基酸也可象CDRs一样被植入。人源化抗体在用于人的治疗方面较小鼠并且某些情况下较嵌合抗体至少有三个潜在的优越性。1)因为效应部分是来源于人的，它与人免疫系统的其他部分的相互作用可能会更好(如通过补体依赖的细胞毒(CDC)或抗体依赖的细胞毒(ADCC)更有效地破坏靶细胞)。2)人免疫系统将不会认为人源化抗体的框架区或C区为外源物质，因此，针对被注射的这样的抗体的抗体反应将会比针对完全是外源性的小鼠抗体或部分是外源性的嵌合抗体的抗体反应更小。3)有人报道注射的小鼠抗体在人体循环的半衰期要比正常抗体的半衰期短得多(Shaw，D.等，《免疫学杂志》(J.Immunol)，138，4534-4538(1987))。注射的人源化抗体的半衰期很可能更接近于天然存在的人抗体的半衰期，这就允许给予的剂量可以更少，频率更低。本发明的抗Fas配体抗体既包括对Fas抗原和Fas配体的结合有影响的抗体，也包括对Fas抗原和Fas配体的结合无影响的抗体。有些抗体，比如本发明[1]中的抗Fas配体的抗体，能与Fas配体结合但不诱导凋亡；这样的抗体可以作为在体内与Fas配体竞争的物质以人工抑制凋亡。本发明中的抗Fas配体抗体可以用于对Fas配体的测定，并且作为进行这样的测定所用试剂或试剂盒的一个组分。本发明还提供一种测定方法、用于这种测定的一种试剂和一种试剂盒，如下所述。用抗Fas配体抗体测定人体液中Fas配体的方法、试剂和试剂盒。(1)测定Fas配体的方法、试剂和试剂盒，其中至少使用或包括一种在[1]或[2]中所描述的抗体。(2)根据(1)的用于测定的方法、试剂和试剂盒，这种测定是用竞争法进行。(3)根据(1)的用于测定的方法、试剂和试剂盒，这种测定是用夹心法进行。(4)根据(1)～(3)任一项的用于测定方法、试剂和试剂盒，其中组合使用或包括两种或两种以上相同类型或不同类型的中和抗体。(5)根据(1)～(3)任一项的用于测定的方法、试剂和试剂盒，其中组合使用或包括两种或两种以上相同或不同类型的根据[2]的抗体。(6)根据(1)～(3)任一项的用于测定的方法、试剂和试剂盒，其中组合使用或包括根据[2]的抗体和中和抗体。(7)根据(6)的用于测定的方法、试剂或试剂盒，其中该中和抗体是F919-9-18，它由登记号为BP-5535的杂交瘤所产生。(8)根据(6)或(7)的用于测定的方法、试剂和试剂盒，其中根据[2]的抗体能特异的与序列鉴定号1的肽反应。(9)根据(8)的用于测定的方法、试剂和试剂盒，其中根据[2]的抗体能特异地与序列鉴定号1中氨基酸序号11-20的肽反应。(10)根据(8)或(9)的方法、试剂和试剂盒，其中根据[2]的抗体是F918-9-4或F918-20-2。一种抗Fas配体抗体可以和另外两种或更多种抗Fas配体抗体组合应用于根据(1)～(10)的用于测定的方法、试剂和试剂盒。中和抗体，特别是本发明中的中和抗体据信能够识别Fas配体上的结构或表位，这种结构或表位对Fas配体的生物活性而言是必要的；因此，本发明中应用中和抗体的测定方法能够高度敏感地测定标本中特别是人体液中的Fas配体，尤其是有生物活性的Fas配体。这种测定方法可以用来代替生物测定，后者是检测标本中的Fas配体生物活性。如前述，Fas配体在生理条件下是以三聚体的形式存在和行使功能，因此就可以用组合的同一种抗体通过夹心法进行测定，这将在实例中进行描述。由于本发明[2]中的抗体能特异性地与Fas配体反应，且参与这种反应的肽的区域已经搞清，因此应用本发明[2]中的抗体的测定方法能高度敏感地测定标本中尤其是人体液中的Fas配体。对一种或多种特定Fas配体的选择性测定也是可行的。将中和抗体，尤其是本发明中的中和抗体与本发明[2]中的抗体组合起来，可以对一种或多种特定的有生物活性的Fas配体进行选择性测定。更进一步，应用本发明的不同测定方法同时测定同一标本可以获得Fas配体的总量，特定Fas配体的量和特定Fas配体的量所占比例。这种测定不仅可以知道在一种特定疾病或病理状况下Fas配体的量的变化，也可以知道质的变化。本发明所测标本并不限于人体液。不过，本发明的测定方法适于测定体液特别是人体液中的Fas配体，优选的人体液标本选自血液、浆液、血清、尿液、脑脊液、淋巴、唾液、腹水和胸膜腔渗出液之一。如实例所示，Fas配体作为本发明抗体所识别的抗原和本发明的测定方法所检测的物质，并不限于任何特定的Fas配体，而是只要它来源于Fas配体，尤其是人的Fas配体即可。它可以与Fas抗原结合，也可以不结合，可以诱导凋亡，也可以不诱导；可以是一种在机体本身就可以找到的内源性Fas配体；也可以是一种外源性Fas配体可以来源于自然存在的生物体，也可以通过遗传工程的方法制备或化学合成；可以被一条糖链所修饰，也可以不被修饰。代表性的Fas配体包括表达Fas配体的细胞，Fas配体，Fas配体的胞外区，游离Fas配体或来源于Fas配体的一个肽片段，Fas配体的缺失突变体或置换突变体，其中有一个或多个氨基酸缺失或置换，以及包括部分Fas配体在内的融合蛋白。该测定方法可以用来测定正常供者或那些患各种疾病的供者体液中的Fas配体。应当指出的是正是本发明第一次使测定体液中Fas配体的浓度成为可能。例如，肝炎、HIV感染或自身免疫病患者的Fas配体浓度比正常供者的要高，这样的发现可用于诊断这些疾病。而且，不影响由Fas配体诱导的凋亡的抗Fas配体抗体可用于体内诊断。本发明还提供一种用于如下所述测定的方法，一种试剂和一种试剂盒。使用抗Fas配体抗体测定人体液中Fas配体的方法、试剂和试剂盒。(1)测定人体液中Fas配体的方法、试剂和试剂盒，用于预测或检测Fas配体的升高/降低和/或Fas抗原/Fas配体系统的异常；用于预测、检测和诊断有这种异常的疾病和与这样的疾病相关的病理状况。(2)用于检测与Fas/Fas配体异常有关的疾病中Fas/Fas配体系统异常而引起的全身性或局部病理状况。(3)根据(1)或(2)的方法、试剂和试剂盒，根据[3]的方法进行。(4)根据(1)～(3)的方法、试剂和试剂盒，其中该疾病是一种自身免疫病、肝炎或HIV感染。本发明还再提供一种杂交瘤或细胞系，如下所述。产生抗Fas配体抗体的杂交瘤或细胞系。(1)产生根据[1]或[2]的抗体的杂交瘤或细胞系。(2)具有登记号FERMBP-5533、FERMBP-5534或FERMBP-5535的杂交瘤(在本说明书中，它们分别称为F918-7-3、F918-9-4、F919-9-18。这些杂交瘤于1995年6月22日保存于日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所，1-3，Higashi1ChomeTsukuba-shiIbaruki-Ken，并且于1996年3月9日根据《布达佩斯条约》移交了它们的管理权。)。本发明进一步还提供新型组合物或药剂，它们含有本发明前面提及的抗Fas配体抗体中的至少一种作为活性或有效成分；本发明也提供治疗全身性或局部病理状况或疾病的方法、这些病理状况或疾病伴随、起因于、涉及或包括Fas/Fas配体系统的异常或由Fas抗原诱导的凋亡的异常。这些方法包括一个步骤，在该步施用本发明中的抗Fas配体抗体的至少一种，尤其是抑制表达Fas的细胞的Fas配体诱导的凋亡的抗Fas配体抗体。获得根据本发明的抗Fas配体抗体的方法将在下文中进一步描述。如实例所示，用以制备本发明的抗Fas配体抗体的抗原不限于任何特殊的抗原，只要它包含来源于Fas配体的肽，优选人Fas配体。用以制备本发明的抗Fas配体抗体的抗原可以与Fas抗原结合，也可以不结合；可以诱导凋亡，也可以不诱导凋亡；可以来源于自然存在的生物体，也可以通过遗传工程的方法或化学合成制备；可以被一条糖链所修饰，也可以不被修饰。代表性的抗原包括表达Fas配体的细胞，全长Fas配体，Fas配体的胞外区，游离Fas配体，来源于Fas配体的一个肽片段，Fas配体的缺失突变体或置换突变体，其中一个或多个氨基酸缺失或置换以及包括部分Fas配体的融合蛋白。本发明的抗Fas配体抗体，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，可以参考已知的方法制备(见《免疫学实验操作指南》(日文)，由日本免疫学会编辑、出版和发行。)。抗Fas配体抗体的制备简述如下。为制备抗Fas配体抗体，动物首先要用免疫抗原(Fas配体或为Fas配体一部分的肽)接种，并且可同时接种适当的佐剂，如完全弗氏佐剂(FCA)或不完全弗氏佐剂(FIA)；如果需要，动物要在2-4周的间隔后再次免疫。再次免疫之后，收集血液以获得抗血清。用作抗原的Fas配体并不由于它的制备过程而有所限制，只要所用的Fas配体有足够的纯度可用以制备抗体即可。当用作免疫抗原的多肽是一个含约10-20个氨基酸的低分子量多肽时，这条多肽可以在用作抗原前与一个载体如钥孔血蓝蛋白(KLH)相连接。用Fas配体免疫的动物并不限于任何特定的物种，优选的是本领域技术人员在免疫学实验中通常使用的动物，如大鼠、小鼠、兔子、仓鼠、绵羊、马、母鸡、山羊、猪和奶牛。优选能产生目的抗体的动物种类。通过纯化所得抗血清可以制备多克隆抗体。纯化可以通过把盐析、离子交换层析、亲和层析和其他已知的合适方法组合起来进行。单克隆抗体的制备如下文所述。从被免疫动物中收集抗体产生细胞如脾细胞或淋巴细胞，收集到的细胞通过利用聚乙二醇、仙台病毒、电脉冲等等的方法与一种骨髓瘤细胞系相融合以制备杂交瘤。然后选出产生Fas配体结合抗体的克隆并进行培养。通过纯化所选克隆的上清可以获得单克隆抗体。纯化可以通过把盐析、离子交换层析、亲和层析和其他合适的方法组合起来进行。抗Fas配体的抗体还可以通过遗传工程的方法获得。例如，mRNA可以从以Fas配体或它的肽片断免疫的动物的脾细胞或淋巴细胞中提取，或从产生针对Fas配体的单克隆抗体的杂交瘤中提取；利用这些提取的mRNA可以构建一个cDNA文库。筛选产生与抗原反应的抗体的克隆，将获得的克隆进行培养。从培养混和物中就可以得到目的抗体，把已知的纯化方法组合起来进行纯化。本发明的免疫球蛋白，包括结合片段或由此来源的其他衍生物，用很多重组DNA技术可以方便地制备，最终表达于转染的细胞，优选永生化的真核细胞，如骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。包含编码人源化免疫球蛋白框架区的第一序列和编码所需的免疫球蛋白互补决定区的第二序列库可以通过合成制备或通过适宜的cDNA和基因组DNA片段重组进行制备。一方面，本发明针对编码重链和/或轻链CDRs的重组DNA片段，这些重链和/或轻链的CDRs是来自能与所期望的Fas配体表位相结合的免疫球蛋白，优选根据本发明[1]的抗体，如单克隆抗体F919-9-18。编码这些区的DNA区段一般会被连接到编码合适的人框架区的DNA区段上。有代表性的DNA序列，它们编码包含单克隆抗体F919-9-18的重链和轻链CDRs的多肽链，被包括在图12和13中。由于密码子简并和非关键性的氨基酸置换，其他的DNA序列可以方便地置换那些序列，如下所述。关于人源化免疫球蛋白设计和制备的详细描述请参见国际专利申请公开号WO/07861。DNA区段一般还会包括一个可操纵地与人源化免疫球蛋白编码序列相连的表达控制DNA序列，它包括自然相连的或异源性的启动子区。这些表达控制序列优选能够转化或转染真核宿主细胞的载体的真核启动子系统，但是针对原核宿主细胞的控制序列也可以使用。一旦载体导入到适宜的宿主中，宿主就可以置于适宜高水平表达核苷酸序列的条件下，根据需要，接下来就可以收集和纯化轻链、重链、轻/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其他免疫球蛋白的形式。本发明的能最终表达所需人源化抗体的核苷酸序列可以通过许多不同的多核苷酸(基团组DNA或cDNA、RNA、合成的寡核苷酸等)和许多组成成分(如V，J，D和C区)，并利用许多不同的技术而制备。将适宜的基因组序列和合成序列连接起来是目前最常用的制备方法，但cDNA序列也可以使用(请参见欧洲专利出版号0239400和Reichmann，L.等，《自然》(Nature)，332，323-327(1988)，在此引入以供参考)。根据已经熟知的方法，可以从许多人细胞中，但优选永生化B细胞中分离人恒定区DNA序列(请参见，Kabat，在所引文献中，和WP87/02671)。制备本发明的免疫球蛋白的CDRs将同样来源于能与Fas配体结合的单克隆抗体，也将同样以熟知的方法在任何合适的哺乳动物，包括小鼠、大鼠、兔子或能产生抗体的脊椎动物中制备。合适的提供DNA序列的细胞和用于免疫球蛋白表达和分泌的宿主细胞有许多来源，如美国典型培养物保藏中心(细胞系和杂交瘤目录，第五版(1985)Rockville，Maryland，U.S.A.)。在优选的实施方案中，这些CDRs有与F919-9-18的CDRs的序列分别相应的序列，还可能包括与编码相应的F919-9-18的CDR氨基酸序列等同的核苷酸序列。除了此处详细描述的人源化免疫球蛋白之外，利用本领域的技术人员熟知的各种重组DNA技术，易于设计和制备其它“基本同源”的修饰抗体。比如，许多不同的人框架区可以单独或组合用作本发明的人源化免疫球蛋白的基础。并且，框架区在一级结构水平上可以通过几个氨基酸的置换、末端和中间插入和缺失等而与天然序列有所不同。一个框架区的许多氨基酸几乎不能或完全不能直接影响抗体的特异性或亲和力。因此，目前认为，可允许许多单个的同源置换而不会改变所获得的人源化免疫球蛋白的特异性和亲和力。但是总体而言，这样的置换是不可取的。通过许多众所周知的技术可易于进行基因的修饰改变，比如定点诱变(参见，Gillman和Smith，《基因》8卷81-97页，(1979)，以及RobertsS等，《自然》(Nature)328卷731-734页(1987))。另一种选择方法，可以制备只包括抗体一级结构一部分的多肽片断，这些片段包含一种或多种免疫球蛋白活性(如，结合活性)。这些多肽片断可以通过以下方法制备，通过本领域中众所周知的方法，蛋白水解裂解完整的抗体，或利用定点诱变将终止密码子插入到pvk和pvgldhfr载体中的所需位置上，比如插入到CH1之后以制备Fab片断或插入到铰链区后以制备F(ab′)2片断。利用DNA接头连接VL和VH可以制备单链抗体(见Huston等，在所引用的文献中和Bird等，在所引用的文献中)。作为一个实例，根据以下方法在大肠杆菌中可制备Fv或Fab片断，Buchner和Rudolph(1991)《生物/技术学》(Bio/Technology)9卷157-162页和Skerra等(1991)《生物/技术学》(Bio/Technology)9卷273-277页，在此引入作为参考)。Fv和Fab也可通过在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达来制备。再者，因为免疫球蛋白相关基因象其它许多基因一样，包含不同的功能区，每一区具有一种或多种不同的生物活性，所以这些基因可以与其它基因的功能区融合以制备具有新特性的融合蛋白(如，免疫毒素)(其它基因比如，酶，见普通转让的1987.12.15提交的U.S.S.N.132，387，在此引入作为参考)。本发明的抗-Fas配体抗体可用于检测体液和组织中的Fas配体。再者，本发明的抗-Fas配体抗体也可用于制备适合在Fas配体的纯化中使用的一种抗体柱，以及用于检测在纯化过程中所得到的级分中的本发明的Fas配体。在细菌宿主中表达编码人源化免疫球蛋白的序列有助于应用在编码更高亲和力的人源化免疫球蛋白序列的筛选中，该更高亲和力人源化免疫球蛋白通过以下方法制备，在CDR区诱导一种突变并且制备噬菌体展示库，该库将用于筛选对Fas配体有高亲和力和/或高特异性结合活性的具有突变CDR的人源化免疫球蛋白。这种高亲和力的潜在优势可用于制备这样一种具有突变CDR的人源化免疫球蛋白，即它对Fas配体的亲和力得到提高和/或对除Fas配体之外的众多分子的交叉反应性得到降低。在该
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内已经可以获得各种用于制备包括编码免疫球蛋白可变区序列的噬菌体展示库的方法。参见如，Sesalini，《欧洲生物化学学会联合会通讯》(FEBSLett.)307卷66-70(1992)；Swimmer等，《国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89卷3756-60页(1992)；Gramm等，《国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89卷3576-80页(1992)；Crasson等，《自然》(Nature)352卷624-8页(1991)；Scot和Smith，《科学》(Science)249卷386-90页(1990)；Gallard等，《生物/技术学》(Bio/Techniques)9卷1373-1377(1991)，在此引入作为参考。所获得的编码具有更高强度亲和力的CDR-突变的人源化免疫球蛋白的序列随后在适合有效表达的宿主中进行表达。正如前面所述，一段DNA序列只有操纵性地与表达调控序列连接才能表达于宿主中，即，将它定位于能够使表达调控序列发挥功能的一个位点上才能够得以表达。这种表达载体在宿主中作为一种附加体或宿主染色体DNA的重要部分一般可以复制。一种表达载体通常包括一种筛选标志，如四环素抗性(tetR)、G418抗性(neoR)、霉酚酸(micophenolacid)抗性(gpt)或HSV-tk等标志，这种标志能使对已经用所需DNA序列转化的细胞的检测得以进行。见，如，USP4,704,362，在此引入作为参考。大肠杆菌是一种尤其有利于克隆本发明DNA序列的原核生物宿主。其它适合的微生物宿主包括芽胞杆菌，如枯草芽胞杆菌，以及诸如沙门氏菌属、沙雷氏菌属和各种假单胞菌属的菌株等肠道细菌。表达载体可在这种原核生物宿主中扩增，并且代表性的这种载体包括适合宿主细胞的表达调控序列(如复制起点)。载体还包括任何一种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，和来源于λ噬菌体的启动子系统。代表性的启动子(如果有的话，与操纵基因序列一起)调控基因表达，并且启动子包括转录和翻译得以起始和完成的核糖体结合位点的序列。其它的诸如酵母等微生物也可以用于表达。酵母属的种类是优选的宿主，它具有包含以下表达调控序列的载体，如包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶在内的各种酶的启动子，复制起点，终止序列，和由此而来的所需类似序列。一种植物或一种植物细胞培养物也可用于表达本发明的人源化免疫球蛋白。见，Laric和Fry，《人抗体杂交瘤》(Hum.AntibodiesHybridomas)2卷4期172-89页(1991)；Benvenuto等，《植物分子生物学》(PlantMol.Biol.)17卷4期865-74(1991)；Durin等，《植物分子生物学》(PlantMol.Biol.)15卷2期281-93(1990)；Hyatt等，《自然》(Nature)342卷76-8页(1989)，在此引入作为参考。优选的植物宿主包括拟南芥属、烟草、黄花烟草，和马铃薯。质粒pMOG18是适合表达编码本发明的人源化抗Fas配体抗体的多核苷酸序列的表达盒，其中已插入的编码人源化免疫球蛋白链的多核苷酸序列和重叠的增强子操纵性地连接于CaMV35S启动子。pMOG18按照Simons等所述的方法进行使用，《生物/技术学》(Bio/Technology)8卷217-221(1990)，在此引入作为参考。另一种方法，按照Hyatt等在所引用的文献中所述，人源化免疫球蛋白可表达于一种植物中，其中，上述引用的Hyatt等人的文献中所用的免疫球蛋白序列可用编码本发明的人源化抗Fas配体抗体的多核苷酸序列进行替换。这是另一种优选实施方案。基于根癌农杆菌T-DNA的载体也可用于表达人源化的免疫球蛋白序列，并且这种载体可优选包含编码壮观霉素抗性的标志基因或其它的筛选标志。昆虫细胞培养也可用于制备本发明的人源化免疫球蛋白，并且代表性的情况是，可以采用基于杆状病毒的表达系统。根据Ptritz等所述的方法，《生物/技术学》(Bio/Technology)8卷651-654页(1990)，该文在此引入作为参考，人源化免疫球蛋白可通过表达编码人源化免疫球蛋白的多核苷酸序列来进行制备，条件是插入编码本发明人源化抗Fas配体抗体的多核苷酸序列而不是小鼠单克隆抗体6A4的轻链和重链的cDNA。除了微生物和植物细胞培养外，哺乳动物细胞培养也可用以表达和制备本发明的多肽。见Winacker，“从基因到克隆”(FromGenetoClone)，VCH出版社，N.Y.，1987，在此引入作为参考。优选采用哺乳动物细胞培养作为实际应用的表达系统，因为在本
技术领域：
中已经发展了多种能够分泌完整免疫球蛋白的适当的宿主细胞系，包括CHO细胞系，各种类型的COS细胞系，Hela细胞，骨髓瘤细胞系等，以及转化的B细胞或杂交瘤。优选采用骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。这类细胞的表达载体包括表达调控序列，如，复制起点、启动子和增强子(Queen等，《免疫学综述》(Immunol.Rev.)89卷49-68页(1986)，在此引入作为参考)，还包括所需要的加工信息位点，如，核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸位点，以及转录终止序列。优选表达调控序列包括来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、和巨细胞病毒，或其它等的启动子。在表达载体中包含诸如neoR表达盒等的筛选标志。编码本发明的人源化免疫球蛋白的转移基因可用于制备一种非人的转基因动物，该动物一般在诸如奶或血清等可回收的体液中表达所需要的人源化免疫球蛋白。这种转移基因通常包含编码人源化免疫球蛋白的多核苷酸序列，该序列与启动子可操纵地连接，同时与诸如啮齿类免疫球蛋白增强子或酪蛋白基因启动子/增强子等增强子连接(Buhler等，《生物/技术学》(Bio/Technology)，8卷140-143页(1990)；Meade等，《生物/技术学》(Bio/Technology)8卷443-446页(1990)，在此引入作为参考)。如下所述，通过本领域中已知的方法，转移基因可被转入细胞或胚胎以制备同源重组产物。优选非人动物包括小鼠、大鼠、绵羊、奶牛、和山羊，其中在奶牛奶中的表达是最优选的(见WO91/08216(1991)，在此引入作为参考)。人源化免疫球蛋白的纯化也可采用本领域中已知的纯化免疫球蛋白的方法进行。根据特定的宿主细胞类型，利用本领域中熟知的方法，可以将包含靶DNA区段(如，编码重链和轻链的序列，和表达调控序列)的载体转入到宿主细胞中。例如，氧化钙转染法通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、lipofectin、biolistics、基于病毒的转导、或电穿孔被用于其它的宿主细胞。在转入到植物细胞或组织的情况下优选利用钨粒介导的轰击转基因法。关于一般描述，见Maniatis等《分子克隆实验室手册》(MolecularClonignALaboratoryManual)，Cold.SpringHarborPress，1982，在此引入作为参考。一旦表达后，完整抗体形式的本发明的多肽、它的二聚体、和单个轻链或重链，或其它的形式均可被纯化，纯化可采用本领域中的任何标准方法，如硫酸铵沉淀、亲和层析、柱层析和凝胶电泳，一般描述见于ScopesR，《蛋白质的纯化》(PurificationofProteins)，Springer-Verlag，N.Y.1982，在此引入作为参考。在制药上应用，优选均一性为90-95％的基本纯净的免疫球蛋白，最优选均一性为98-99％或甚至更高的免疫球蛋白。部分纯化或纯化至所需均一性后，多肽可用于治疗性应用(包括体外应用)，并可用于实践和发展诸如免疫荧光等试验。关于一般描述，见《免疫学方法》(ImmunologicalMethods)，卷I和II，Rufcovitz和Pernis编辑，AcademicPress，N.Y.，1979和1981)。根据本发明的另一方面，本发明提供了一套计算机程序，利用该程序，抗体的三维构象可展示在显示器上。比如，适宜的系统是SiliconGraphicsIRIS4D工作站，在UNIX操作系统以及分子模型包装QUANTA(Polygen公司，美国)的操作程序下运行。计算机系统有利于制备人源化抗体的突变体。在没有作任何其它突变的情况下，本发明的抗体通常就具有足够的结合亲和力。然而在特定氨基酸残基进一步发生改变的过程中可鉴定出具有更高结合亲和力的抗体。三维构象也有助于鉴定出各种作用较小的氨基酸残基，并且这些氨基酸残基可以进行不会改变抗体的结合亲和力到可检测水平的保守替换。总体而言，保守替换可能显著影响免疫球蛋白的特性。然而，许多单一的保守替换不可能有损于免疫球蛋白的特性。据本发明更进一步的一方面，本发明提供了抗Fas配体的人抗体。这种抗体用以下技术方法进行制备，这些技术包括体外免疫、三体瘤(trioma)法(Ostberg等，《杂交瘤》(Hgbridoma)2卷361-367页，(1983)；OstbergUSP4,634,664；和Engleman等，USP4,634,666)，和人抗体基因制备的非人转基因动物(Lomberg等WO93/12227(1993)；KuchellapatyWO91/10741(1991))。将这些技术和常用的Kehler-Milstein法结合起来可制备人源单克隆抗体。根据在Hughs等，《科学》(Science)246卷1275-1281(1989)中一般描述的普通方法，对来自人B细胞的DNA库进行筛选以筛选出与Fas配体或其片断相结合的抗体。然后克隆并扩增编码这样筛选出的具有结合活性的抗体或其片断的序列。结合噬菌体展示技术可以改变Hughs所述方法的效率。见，如，Dowar(WO91/11271)和Mackaferti等(WO92/01047)，在此引入作为参考。在这些方法中，可制备出在外膜上表达各种抗体的噬菌体库。抗体通常表达为Fv或Fab片断。根据对Fas配体多肽或其片断亲和力的增加来筛选出产生所需特异性抗体的噬菌体。在改良噬菌展示法中，可制备出具有选定的小鼠抗体结合特异性的一种人抗体。(见Winter，WO92/20791)。本发明的抗Fas配体抗体包括改变，即，提高或抑制Fas配体对细胞的作用的抗体。为了获得具有抑制Fas配体诱导的凋亡作用的抗体，利用Fas配体或Fas配体表达细胞，和Fas抗原表达细胞，在体外进行试验，筛选在制备上述单克隆抗体或多克隆抗体过程中所获得的血清，或杂交瘤上清。从在这种筛选中所选定的血清或上清中，通过适当组合应用已知的方法，纯化出目的抗体。利用Fas配体或Fas配体表达细胞和Fas抗原表达细胞的筛选过程的优选实施方案见于实例中，并且应当指出该筛选过程也述于国际专利申请公开号WO95/13293等。筛选也可通过利用与示于实例中的特定Fas配体的反应性或非反应性作为指标来进行，即利用与nd32、nd42和L179F中至少之一的反应性，或与nd42和cd179中至少之一的非反应性作为指标。本发明的抗体和包含抗体混合物的组合物可用于预防性和/或治疗性处理。本发明中能够高度抑制Fas配体诱导的凋亡的中和抗体可用于调控机体凋亡的目的。例如，中和抗体可作为治疗试剂以治疗涉及细胞和组织凋亡的疾病，如，风湿病中关节组织的破坏，系统性红斑狼疮(SLE)中自体组织的破坏，糖尿病、流感、AIDS、肝炎等。另一方面，本发明中增加Fas配体诱导的凋亡的抗体可用于除去机体不需要的细胞以治疗，如，早期AIDS，风湿病中滑膜细胞的异常增殖，和自身免疫病中自体抗原反应性T细胞的增殖。本发明中的抗体和它的药用组合物尤其适合于非肠道用药，即皮下、肌肉内或静脉内用药。另外，本发明的抗体也可采用以下方式给药胃灌洗或胃灌注，腹腔输注，眼用油膏、外用油膏、颅内输注(典型的是注入脑室)、心包内输注，或囊内输注，典型的是局部应用的情况。非肠道用药的组合物一般包含一种制药上可接受的载体，并且优选组合物是溶于水性载体或其混合物中的免疫球蛋白溶液。可采用各种水性载体，比如水、缓冲液、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、0.4％生理盐水、0.3％甘氨酸溶液、或人白蛋白溶液。这些溶液应当是无菌的、并且通常无细微的颗粒物质。这种药用组合物可利用本领域中熟知的惯用灭菌方法进行灭菌。为了达到一种生理状态，组合物可包含一种制药上可接受的添加剂，比如pH调节剂、缓冲剂、毒性调节剂以及其它等，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钙。制剂中抗体的浓度可在一大范围内变动，即，从按重量算小于大约0.005％(通常按重量算至少大约1％)到按重量算高至15％或20％的范围内。基本上根据所选定的用药方式来选择浓度，后者又取决于溶液体积、粘性等。对本领域的技术人员来说，在实践中用以制备非肠道用药组合物的方法是已知的或显然的，并且这种方法准确描述于，如，《雷明顿制药科学》(Remington′sPharmaceuticalScience)，(15版，MacPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，1980)，在此引入作为参考。根据计划的特定应用，可适当选择适合灌洗和其它用药途径的组合物。一些药用组合物可能包含抗Fas配体抗体和其它常用于治疗疾病的治疗试剂。上述的所有药用组合物都适合用于团块(boluses)用药和持续应用。依据受治者的疾病、病理状况、病人的状况等可确定组合物预防和治疗有效的量。本发明的抗体可以冰冻或冻干保存，并在使用前重悬于适当载体中。这种冻干/重悬的方法对常规免疫球蛋白已知是有效的，并且可采用已知的冻干/重悬法。本领域的那些技术人员知道这种冻干/重悬过程可能在各种不同程度上导致抗体活性的丢失(如，常规免疫球蛋白和IgM抗体比常规IgG抗体可能有更大的活性损失)，并且可能必需调整所用的量以弥补这种活性的损失。本发明的优选药用组合物包括在免疫毒素中使用根据本发明的主要方面的免疫球蛋白，它作为运载系统以将特定的试剂运载至Fas配体表达的细胞，尤其以达到杀死该种细胞的目的。免疫毒素以含有两种成分为特征，并且尤其有助于在体外或体内杀死所选定的细胞。一种组成成分是细胞毒性试剂，它一旦被细胞吸附或吸收将对细胞是致死性的。第二种成分是称为“运载体”的部分，它提供一种方式将毒性试剂运载至一种特定类型的细胞，如，表达Fas配体表位的细胞。通常，利用任一种各种已知的化学方法将两种成分化学交联在一起。当细胞毒性剂是一种蛋白质而第二种成分是完整免疫球蛋白时，结合剂为一种异双功能(heterodifuntional)交联剂，如SPDP、碳二亚胺、戊二醛等。在本领域中各种免疫毒素的制备是众所周知的，并且描述于，如，Torpe等，“单克隆抗体-毒素结合物以作为神奇生物导弹”(MonoclonalAntibody-ToxinConjugatesAmingatMagicBullet)，于《临床医学中的单克隆抗体》(MonoclonalAntibodiesinClinicalMedicine)，AcademicPress，168-190页(1982)，在此引入作为参考。另外一种方法，可利用遗传学方法将两种成分交联。见Chawderly等，《自然》(Natnre)339卷394页(1989)，在此引入作为参考。各种细胞毒试剂均适合用于免疫毒素。细胞毒试剂可包括一种放射性核素，如131碘和其它碘的同位素、90钇、188铼、212铋和其它的α发射体；各种化疗剂，如长春新碱、氨甲喋呤、阿霉素和顺氯氨铂；细胞毒性蛋白，如核糖体抑制蛋白样商陆抗病毒蛋白，假单胞菌外毒素A，溶解素，白喉毒素，溶解素A链，等等；和其它在细胞表面有活性的试剂，如磷脂酶(如磷脂酶C)。关于一般描述，见USSN07/290,968和07/310,252，它们转让给同一受让人；《嵌合毒素》(Chimeratoxin)，Orsness和Phil，Pharmac.There.，25卷355-381页(1982)，以及《癌症检测和治疗的单克隆抗体》(MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy)，Baldwin和Bayers编辑，AcademicPress，(1985)，159-179页和224-226页，在此引入作为参考。免疫毒素中被运载的成分包括本发明的免疫球蛋白。优选应用完整的免疫球蛋白或它的可结合片断，如Fas或Fv。免疫毒素中的抗体一般是人IgM或IgG同种型。然而，按照需要，其它哺乳动物的恒定区也可被采用。Fas配体本身用于治疗和研究需要大量制备高纯度的Fas配体蛋白。本发明的抗Fas配体抗体有助于纯化Fas配体。本发明的中和抗体选择性与有生物活性的Fas配体结合，因此，本发明的抗体尤其有利于高效特异地纯化可作为一种重要治疗试剂的活性Fas配体。本发明的试验方法包括使用如上所述已获得的抗体的步骤，并且该步优选是通过待检样品中分析物Fas配体与如上所述已获得的抗体之间的抗原-抗体反应来捕获待检样品中分析物的步骤。在本发明的试验方法中检测分析物所采用的原理不限于任一特定的原理。然而，作为实例的原理包括凝集法、夹心法、固相直接法固相结合法和竞争法。在这些方法中，优选夹心法和竞争法，最优选是夹心法。在凝集法中，使抗体与诸如乳胶颗粒和红细胞(如，绵羊红细胞)等微粒表面结合，这样当Fas配体存在时，会发生微粒的凝集，然后用凝集程度作为指标来测定Fas配体。应当指出，在凝集法中，除了乳胶和红细胞外，也可应用本领域中常用的微粒，如明胶颗粒、微珠、和碳粒。在夹心法、固相直接法、固相结合法、和竞争法中，可采用诸如酶免试验(EIA)、放免试验(RIA)、化学发光免疫试验、荧光免疫试验、时间分辨荧光免疫试验(TR-FIA)和免疫层析试验(ICA)等原理，用标记的抗原和/或抗体进行试验。下面将描述采用EIA原理，它是本发明中优选试验原理之一，所进行的夹心法，固相直接法和竞争法。在通过EIA进行的固相夹心法中，首先制备识别Fas配体的抗体或用诸如过氧化物酶、碱性磷酸酶、或β-半乳糖苷酶标记的第二抗体。特别是，用过氧化物酶标记的抗体是优选实施方案。下一步，识别Fas配体的抗体吸附于所用的固相支持物上。加入样品或标准品后，加入如上所述的酶标抗体以开始抗原抗体反应。洗涤掉过量酶标抗体后，加入适合所用的酶的发色物质，如，邻苯二胺和H2O2，对硝基苯磷酸，2-硝苯基-β-D-半乳糖苷，以起始与酶的反应。底物形成的颜色依赖于酶的数量，因而依赖于样品中Fas配体的量。因此，通过测定形成颜色的终产物量可以对Fas配体进行定量。在固相直接法中，样品直接吸附于固相支持物，固相支持物上不能吸附Fas配体的表面用诸如BSA(牛血清白蛋白)等不影响测定的一种蛋白质进行封闭。然而加入识别Fas配体的酶标抗体以开始反应。随后进行类似于固相夹心法的操作步骤以确定样品中存在/缺乏Fas配体，或定量测定样品中的Fas配体。在固相竞争法中，可被所使用的抗体识别的特定量的Fas配体直接吸附于固相，然后进行封闭。然后再加入识别Fas配体的酶标抗体和待检样品，使反应进行一定时间。不能与固相结合的物质被洗涤掉，然后加入发色物质以开始与酶的反应。反应结束后，测定样品抑制酶标抗体与固相上Fas配体结合的程度以对样品中的Fas配体定量。以相同的方法，抗体吸附到固相上之后，酶标Fas配体和样品可同时加入，以测定由于样品的加入而抑制酶标Fas配体与固相-固定抗体结合的程度，从而测定样品中Fas配体的量。除了上述的试验方法之外，Fas配体可通过以下方法测定在液相中进行抗原-抗体反应，然后通过凝集沉淀将与酶标抗体结合的Fas配体和不能与标记抗体结合的Fas配体分开，利用抗体或其它物理化学方法对Fas配体进行定量。Fas配体也可这样测定先获得并标记能识别Fas配体-识别抗体的第二抗体，而不是标记Fas配体-识别抗体，然后使它进行抗原抗体反应，从而可测定Fas配体。在夹心法、固相直接法和竞争法中的任何一种方法中，标记酶和发色物质的组合可替换为标记酶和一种生物发光或化学发光物质的组合，或替换为标记酶和发荧光的物质。在这种情况下可采用的代表性酶-发光物质的组合包括碱性磷酸酶-AMPPD，辣根过氧化物酶-鲁米诺，和虫荧光素酶-荧光素，代表性酶-发荧光物质的组合包括碱性磷酸酶-磷酸伞形花内酯，和辣根过氧化物酶-羟丙基丙酸对羟基苯酯。在上述的三种试验方法中，可以采用抗体或抗原直接或间接用放射性同位素、化学发光物质、或荧光物质标记而不是酶标记，通过测定放射活性、发光和荧光的强度来检测样品中的Fas配体。在这种情况下常用的代表性放射性同位素包括125I和131I。典型的化学发光物质包括acridiniumester。当测定荧光强度时，可以采用更高敏感性的方法。其中一种螯合剂直接或间接与抗体或抗原结合，以激发光束照射以测定以时间-分辨方式与螯合剂结合的稀土金属发出的荧光强度，由此来检测样品中的Fas配体(时间-分辨荧光免疫试验，TR-FIA)。典型的稀土金属包括铕。如上所述，本发明中试验方法的目的是测定样品中的Fas配体。待检样品可为一种体液或组织，细胞，或细菌和它们的提取物或上清，并且优选是一种体液。更优选，待检样品可选自血液、浆液、血清、尿液、脑脊液、淋巴、唾液、腹水和胸膜渗出液。本发明的测定方法可用于测定正常献血者或患各种疾病的病人的体液中的Fas配体。本发明首次使得能够测定体液中Fas配体的浓度，并证实了在一些特定疾病中Fas配体的浓度变化。应当指出本发明中用于上述试验的试剂和试剂盒与试验方法中所述的试剂和试剂盒有相同意义。实例下面，借助于实例更详细地举例说明本发明，这些实例仅仅用于举例说明，决不限制本发明的范围。在以下描述中所用的简称是依据于本
技术领域：
中常用简称的那些。进行如下所述的实例中所用的操作参考Sambrook等编辑，“分子克隆，实验室手册，第2版”(MolecularCloning，alaboratoryManual，2nded，)，ColdSpringHarborLaboratory，1989，Imamoto，F等编辑，“重组基因导入细胞并表达”(日文)(IntroductionofRecombinantGentintoCellandtheExpression)，Tanpakushitsu-Kakusan-Kouso(蛋白质，核酸和酶)，专刊28(14)，1983；和Okada，Y.(审校)，“细胞工程技术(一系列文章的摘要)(日文)(CellEngineeringTechnology)，Jikken-Igaku(实验医学)，专刊7(13)，1989；等等。1.制备抗Fas配体多肽抗体1-1抗原多肽的筛选如图1所示，分析序列表中序列鉴定号9的Fas配体胞外区中预测的表位。用BIOSYMINC.的同源模块中所包含的FASTA程序检索蛋白质数据库，该库是实验测定的生物大分子的三维结构有关档案的数据库，以寻找与Fas配体的胞外区氨基酸序列具有高度同源性的蛋白质。结果发现TNF-α(PDB-IDITNF和2TUN)在它们的全部结构上是高度同源的。然后这种TNF-α作为参考蛋白质，利用其三维结构进行Fas配体胞外区的模型化。在制作模型结构时，进行以下操作抽取作为基本结构的结构保守区(SCR)，将TNF-α单体结构在α碳位重叠，然后筛出结构距离在1之内的区域，同时在x-射线晶体衍射中温度因素高达20。至于与结构保守区相连的可变区(VR)，检索PDB以寻找插入或缺失发生时的一种适当结构。BIOSYMSINC.的同源模块被用于构建分子结构。进行构象的球形最小检索(Globalminimumsearch)以寻找在构建的初级结构中置换的侧链，并且利用计算软件，DiscoverofBIOSYMSINC.将结构最佳化以获得Fas配体胞外区的模型结构。用这样获得的模型结构，将在分子表面暴露的结构区，即当TNF-α的单体结构重叠时表现出大裂缝的区域，以及具有高TNF-α温度因素的区域选为包含易为抗原识别的表位的区域。根据模型结构的二级结构信息，选择具有序列表中序列鉴定号1-8所示氨基酸序列的8肽序列以利于合成这些区域的肽时保持抗原的结构。所选定的8个肽的氨基酸序列示于图1。合成肽在碳端引入含巯基的半胱氨酸以利于与载体结合。序列表中序列鉴定号1-8代表没有这种半胱氨酸的序列。1-2制备抗血清根据示于图1的肽的氨基酸序列，委托FujiyaBioscienceKenkyushoK.K.合成序列表中序列鉴定号1-8的肽、如图1所示，将对应于鉴定号1-8的氨基酸序列的肽称为M52-M59，并且该名称用于下述内容中。委托Men-ekiSeibutsuKenkyushoK.K.通过马来酰亚胺法结合载体钥孔血蓝蛋白(KLH)并免疫兔子。1-3抗血清评定通过测定固定化肽和抗血清之间的反应性，在Men-ekiSeibutsuKenkyushoK.K证实了针对所给予肽的抗体的滴度不断增加。然后发现针对所用的8个肽的抗血清在大约6,000-24,000的稀释度与相应的固定化肽发生反应。接着，进行Westem印迹以证实抗血清与人Fas配体结合。10μl含有将在4-1中描述的Fas配体胞外区的培养上清与等体积凝胶上样缓冲液(SEPRASOL，IntegratedSeparationSystem)混合，并于37℃孵育1小时，2μl溶液加样至4-20％SDS-PAGE(Tefco)的加样孔中，并且在25mA室温进行1小时的电泳。电泳结束后，在4℃和200mA的条件下将凝胶转印于PDVF膜(Millipore)，持续90分钟。室温将膜浸入未稀释的封闭试剂(BlockAce，SnowBrandMilkProductsCo.，Ltd)中，不断摇动封闭该膜。该膜剪成条状，每条浸入1ml稀释500倍的抗血清中，抗血清是用含0.05％吐温20的pH6.40.076M的PBS(此后简称为T-PBS)并加入0.5％BSA后进行稀释的，同时室温下不断摇动1小时。反应结束后，用T-PBS洗涤每条膜2次，然后浸入1ml用含10％山羊血清的T-PBS稀释500倍的HRPO标记的抗-兔Igs抗体(DACO)中，室温反应1小时。用T-PBS洗膜5次后，用ECL系统(Amersham)进行检测。通过培养板试验(固相直接法)，证实了抗血清与固定于培养板上的Fas配体胞外区的反应性。首先，50μl已用0.076MPBS，pH6.4(此后称为PBS)稀释至0～25ng/孔的将在4-1中描述的部分纯化的Fas配体胞外区加入免疫培养板(Maxisorp，Nunc.)的各孔中，该培养板在45℃孵育30分钟以将Fas配体胞外区固定在孔中。用离子交换水洗涤各孔5次后，各孔中加入100μl/孔的0.1％BSA/PBS以封闭培养孔。然后除去封闭试剂，各孔中加入用0.1％BSA/PBS稀释的抗血清，于37℃反应1小时。随后用含0.005％吐温20的0.9％NaCl洗涤各孔两次，再加入50μl/孔用10％山羊血清/PBS稀释1,000倍的HRPO标记的抗免Igs抗体(DACO)。反应于37℃进行1小时。反应结束后，用洗液洗涤各孔5次，用离子交换水洗涤两次，然后加入50μl含3mg/ml邻苯二胺和0.027％过氧化氢的0.1MMaIlvaine缓冲液(pH5.0)，反应5分钟。用50μl1N盐酸终止反应，并在490nm处测定吸收值。通过51Cr释放试验测定Fas配体对凋亡诱导活性的影响。106WC8细胞于37℃在含20μCi(51Cr)铬酸钠(NEN)的RPMI1640培养基中培养2小时以用51Cr标记。最终浓度达500倍稀释的抗血清加入到含1×10451Cr标记细胞的反应液中，随后加入来源于COS-1细胞培养上清的Fas配体的胞外区(相当于0.9μg/mlFas配体胞外区的浓度)达10％的终浓度。反应液于37℃孵育4小时，然后用51Cr的释放作为指标测定诱导凋亡的活性。表1说明每一种抗血清对Fas配体的结合活性，以及抗血清对凋亡诱导活性的影响。在Western印迹中，用M52和M57肽免疫所制备的抗血清表现出与Fas配体胞外区的阳性结合(+)，然而其它的抗血清不能与Fas配体的胞外区结合(-)。在培养板试验中，在这些抗肽抗血清中，用M52和M57肽免疫所制备的抗血清表现出与Fas配体的强反应性(++)，同时用M53和M54肽免疫所制备的抗血清也表现出了与Fas配体相当程度的反应性(+)。未发现抗血清具有抑制凋亡的活性，然而用M52免疫所制备的抗血清表现出了增强Fas配体凋亡诱导活性的作用。表1兔抗肽血清与Fas配体胞外区的反应性以及牛抗血清对凋亡诱导活性的影响抗血清M52M53M54M55M56M57M59Western印迹+----+-的结果培养板试验++++--++-的结果对凋亡诱导增加------活性的影响1-4抗血清的纯化应用盐析和通过离子交换柱对M52和M57肽免疫后所制备的抗血清(5ml)进行纯化。首先等体积的0.15MNaCl加入到5ml每种抗血清中，然后逐滴加入与抗血清未稀释前等量的饱和硫酸铵，同时搅拌。搅拌于室温下持续30分钟，然后使混合物静置30分钟。随后在10,000rpm将混合物离心10分钟，所得到的沉淀溶解于5mlpH6.30.02M的磷酸盐缓冲液中并进行透析。离心除去杂质后，溶液上样于已用同一缓冲液平衡的10mlDEAE纤维素(DE52，WHATMAN)填充的层析柱中。回收未被吸附的级分，然后将用另外的50ml缓冲液洗柱所回收的级分与未吸附的级分混合。用DiafloWPM10膜(AMICON)浓缩这样处理所获得的含IgG的溶液，以获得M52和M57肽免疫后所制备的每一种抗血清的纯化抗体。通过在280nm处的吸收值计算出纯化抗体的蛋白质浓度。2.抗M52肽单克隆抗体的制备2-1制备抗原和免疫小鼠1.1mgM52肽溶解于110μlpH7.00.1M的磷酸盐缓冲液。同时1.54mg马来酰亚胺激活的KLH(Boehringer-Mannheim)溶解于154μl蒸馏水中。将所制备的溶液混合，室温下反应2小时。反应液上样于已用生理盐水平衡的Nick柱中(PharmaciaBiotech)，以纯化并获得用来免疫的抗原。70μl这样制备的用来免疫的抗原用生理盐水稀释至0.1ml，然后与等量的完全弗氏佐剂(DIFCO)混合。将溶液腹腔注射入5周龄的雌性ddY小鼠。间隔2周后，与不完全弗氏佐剂(DIFCO)混合的等量抗原以相同的途径给药。2-2抗血清的评定给药1周后，眼底采血，并证实抗血清能与Fas配体的胞外区结合。首先，50μl将在4-1中描述的部分纯化的Fas配体胞外区用pH6.40.076MPBS(此后称为PBS)稀释至每孔0～100ng，加入免疫培养板(MaxisorpNunc)的各孔中，然后免疫培养板于45℃孵育30分钟以将Fas配体的胞外区固定到孔中。用离子交换水洗涤各孔5次后，每孔中加入100μl0.1％BSA/PBS以封闭各孔。除去封闭试剂后，各孔加入用0.1％BSA/PBS稀释的抗血清，于37℃反应1小时。然后用含0.005％吐温20的0.9％NaCl洗涤各孔2次，再加入50μl/孔已用10％兔血清/PBS稀释1,000倍的HRPO-标记的抗-小鼠Igs抗体(DACO)。于37℃反应1小时。反应结束后，用洗液洗涤各孔5次，并用离子交换水洗涤2次后，再加入50μl含有3mg/ml邻苯二胺和0.027％过氧化氢的0.1MMaIlvaine缓冲液(pH5.0)，并反应5分钟。用50μl1N盐酸终止反应，并在490nm处测定吸收值。结果表明M52肽免疫后所制备的小鼠抗血清与Fas配体的胞外区之间具有强反应性。2-3制备单克隆抗体用400μl生理盐水稀释在2-1中所制备的用来免疫动物的抗原70μg，然后通过尾静脉将递增抗体滴度的溶液施用于小鼠。3天后，进行细胞融合，融合方法依据于TamieAndo和TadashiChiba，“应用单克隆抗体的实验操作指导”(IntroductiontoExperimentalOperationUsingMonoclonalAntibody)，Kodansha-Scientific。6天后，通过在2-2中所述的方法筛选培养上清中的抗体，通过有限稀释法将表现出阳性反应的孔中的细胞进行克隆，方法依据于TamieAndo和TadashiChiba所述，“应用单克隆抗体的实验操作指导”(lntroductiontoExperimentalOperationUsingMonoclonalAntibody)，Kodansha-Scientific。克隆后，再进行筛选从而获得能产生与Fas配体反应的抗-M52肽的单克隆抗体的20个杂交瘤克隆(F918系列)。F918-4-5(IgG1/λ)，F918-2-4(IgG1/λ)、F918-7-3(IgG1/k)、F918-9-4(IgG1/λ)、F918-17-1(IgG1/k)、F918-20-2(IgG1/λ)、和F918-23-1(IgG1/k)，如下所述，包含于F918系列中。所获得杂交瘤的亚类包括IgM/k3个克隆、IgG1/k6个克隆、IgG1/λ9个克隆、IgG2b/λ1个克隆、和IgG2b/k1个克隆。杂交瘤培养于无血清的培养基(PHFM-II，GibcoBRL)，然后用60％饱和硫酸铵盐析培养上清。IgG上样于蛋白质A柱(PROSEP-A，BIOPROCESSING)进行纯化。通过测定280nm处的吸收值计算这样获得的纯化抗体的蛋白质浓度。2-4抗体的评定根据1-3中所述的方法进行Western印迹，以证实这样获得的两个批号(F918-7-3和F918-9-4)的纯化抗体(抗体浓度3μg/ml)能与Fas配体胞外区结合。所用的Fas配体是将在4-1中描述的纯化的Fas配体胞外区(来源于毕赤酵母的Fas配体胞外区示于图2)，将在实例5-1中描述来源于COS-1细胞的游离Fas配体，和将在实例3中描述来自COS-1细胞的Fas配体的胞外区。HRPO-标记的抗小鼠Igs抗体(DACO)被用作第二抗体，TMB试剂(SCYTEK，Laboratories)被用于检测。如图2所示，对于F918-9-4，来自酵母的Fas配体胞外区、来自COS-1的Fas配体胞外区和游离的Fas配体均在分子量大约30,000处检测到一条带，证实了抗体与Fas配体的结合。对于F918-7-3，来自酵母和COS-1的Fas配体胞外区检测到一条带，而游离Fas配体未检测到条带。接着，根据在1-3中所描述的方法检测Fas配体对凋亡诱导活性的影响。如图3所示，F918-9-4不能显著改变凋亡诱导活性，而F918-7-3表现出增加凋亡诱导。正如上文所述，M52肽免疫后所制备的单克隆抗体至少包括两种具有不同特异性的抗体。3.制备抗Fas配体抗体3-1制备抗原，并免疫小鼠通过下述方法制备的COS-1细胞表达的Fas配体胞外区被用作抗原来免疫动物。来自COS-1细胞的Fas配体的胞外区制备使用一种转化子COS-1/pM1070，此处它是已导入质粒pM1070的COS-1细胞，该质粒描述于国际专利申请公开号WO95/13293中的实例18。更详细说明，8.1μgpM1070溶于40μl10mMTris-HCl(pH7.4)/1mM乙二胺四乙酸(此后简称为TE缓冲液)中。溶液中加入11.3ml含1ml0.2mg/ml的DEAE-葡聚糖和1mlpH7.4的50mMTris-HCl的D-MEM(NipponSeiyakuK.K.)以制备DNA-DEAE-葡聚糖混合液。该DNA-DEAE-葡聚糖混合液滴加到在150cm2Roux培养瓶中已生长至半汇合状态的单层COS-1细胞上，然后在5％CO2存在下于37℃孵育以获得转化子COS-1/pM1070。4小时后，弃去DNA-DEAE葡聚糖混合液，用含10％胎牛血清(FBS，IrvineScientific)的D-MEM培养基置换，继续培养48小时。然后用无酚红的D-MEM(无FBS，加入BSA)替换原有的培养基，继续培养96小时以回收培养上清。在1,200rpm将培养上清离心5分钟以除去沉淀，然后用0.22μm孔径的滤膜过滤。用DiafiowPM10膜(Amicon)浓缩10倍后，2.5ml浓缩物(相当于22.5μg)通过PD10柱(Pharmacia)进行凝胶过滤，反复洗脱至无样品滤出，结果回收了一个3.5ml的级分。这样回收的级分通过Centricon-10(Amicon)浓缩至400μl以使用该浓缩物作为初次免疫的抗原。同时，300μl已浓缩至10倍的培养上清进行4-20％的制备性SDS-PAGE(2-D，TEFCO)，并且参照分子量标志(PrestainedSDS-PAGEStandardLow，BIO-RADLaboratories)将分子量30,000附近的凝胶切割下来。仔细切碎凝胶并过夜浸于生理盐水中，同时振荡，以提取Fas配体的胞外区。提取物通过Centricon-10(Amicon)浓缩至200μl以使用该浓缩物作为再次和最后免疫的抗原。这样制备的200μl用于初次免疫的抗原与等量的完全弗氏佐剂(DIFCO)混合，然后将该溶液腹腔注入5周龄的雌性ddY小鼠。间隔两周后，100μl用于再次免疫的抗原与不完全弗氏佐剂(DIFCO)混合，以相同的方式给药。3-2抗血清的评定再次免疫1周后，从眼底采血，根据在2-2中所述的方法评定抗血清与Fas配体的胞外区相结合的能力。如图4所示，以部分纯化的来自COS-1细胞的Fas配体胞外区免疫的小鼠(8-2)抗血清表现出吸附与稀释度的比率增加，这表明抗血清能与来自酵母的Fas配体的胞外区相结合。根据在1-3中所述的方法也检测了抗血清对凋亡诱导活性的影响，结果发现血清具有强的抑制活性。3-3制备单克隆抗体200μl通过在3-1中所述的SDS-PAGE进行制备的Fas配体的胞外区腹腔注入小鼠(8-2)，该小鼠的血清已被证实与来自酵母的Fas配体的胞外区有结合活性。3天后，进行细胞融合，方法依据于TamieAndo和TadashiChiba，“应用单克隆抗体的实验操作指导”(IntroductiontoExperimentalOperationUsingMonoclonalAntibodies)，Kodansha-Scientihc。6天后，通过两种方法筛选培养上清中的抗体，即，根据在2-2中所述的方法测定与Fas配体的结合，以及用夹心EIA系统进行筛选以获得这样一种抗体，该种抗体能用于采用在1-4中所述的抗M52肽抗体进行的夹心试验。首先50μlDEAE-纯化的兔抗M52肽的抗体用PBS稀释至10μg/ml，加入至免疫培养板(Maxisorp，Nunc)的各孔中，然后在45℃孵育30分钟以使抗体固定在孔中。用离子交换水洗涤5次后，将0.1％BSA/PBS100μl/孔加入到孔中，然后在室温下封闭30分钟。当弃去封闭剂后，25μl浓度为200ng/ml的将在4-1中描述的部分纯化的Fas配体胞外区，和25μl培养上清被加入到各孔中，然后于37℃反应1小时。随后各孔用洗液洗涤2次，再加入50μl用10％兔血清/PBS稀释至1,000倍的HRPO-标记的抗小鼠Igs抗体(DACO)。反应在37℃进行1小时。用洗液洗涤5次，并用离子交换水洗涤2次后，加入50μl含3mg/ml邻苯二胺和0.027％过氧化氢的0.1MMaIlvaine缓冲液，pH5.0，反应10分钟。用50μl1N盐酸终止反应，并测定490nm处的吸收值。在两次筛选过程中，获得了一孔能与在4-1中所述的可溶性Fas配体发生反应的上清。表现出反应活性的该孔细胞通过有限稀释法进行克隆，方法依据于TamieAndo和TadashiChiba所述，“应用单克隆抗体的实验操作指导”，Kodansha-Scientific。克隆后，重复上述过程进行筛选以获得能分泌抗体F919-9-18(IgG2b/k)的杂交瘤，该抗体能与Fas配体的胞外区发生反应并可用于用抗M52肽的抗体进行的夹心试验。3-4抗体的评定根据在1-3中所述的方法评定抗体F919-9-18的凋亡抑制活性。如图5所示由于一种或众多种因素，F919-9-18表现出比抗Fas配体抗体F883-1-1更强的抑制活性，抗体F883-1-1描述于国际专利申请公开号WO95-13293中的实例15和16中，并且F919-9-18的抑制活性甚至强于国际专利申请公开号WO95-13293的实例1中所述的hFas-Fc。4.夹心EIA系统4-1制备标准品按如下所述制备用作标准品的Fas配体胞外区。(1)构建质粒pM1283，它含有编码人Fas配体胞外区179个氨基酸的DNA，氨基酸序列示于序列表中序列鉴定号9。首先，化学合成有义引物1(TCTCTCGAGAAAAGAGAGCAGCTCTTCCACCTG)和反义引物1(AGGGAATTCCTATAGAGCTTATA)。有义引物1包括编码毕赤酵母-表达质粒pPICQ(Invitrogen)的部分α-因子信号序列的核苷酸序列，编码人Fas配体胞外区N端区域的核苷酸序列，以及XhoI酶切位点(CTCGAG)。反义引物1包括编码人Fas配体胞外区C端区域的核苷酸序列，终止密码子(TAG)，和EcoRI酶切位点(GAATCC)。准备100μl含每种引物100pmol的溶液；50ng质粒PM1070，它包括编码人Fas配体胞外区179个氨基酸的DNA，该Fas配体描述于国际专利申请公开号WO95-13293的实例18中；dATP、dCTP、dGTP和dTTP每种20nmol；和2.5单位pfuDNA聚合酶以及10μlpfuDNA聚合酶附带的pfu缓冲液(Stratagene)。每轮PCR循环包括94℃(30秒)，55℃(30秒)，和72℃(1分钟)，用DNA热循环仪(PCRSytem9600，PerkinElmer)循环30次。用EcoRI和XhoI双酶切所得到的PCR产物，在pPIC9的EcoRI-XhoI位点处插入。所获得的质粒称为pM1283，20μgpM1283用BglII酶切使之线性化以用于转化毕赤酵母。(2)转化毕赤酵母毕赤酵母GS115株(Invitrogen)接种于YPD平板(1％(w/v)细菌-酵母提取物；2％(w/v)蛋白胨；2％(w/v)D-葡萄糖；2％细菌培养用-琼脂)，然后于30℃培养2天，取单菌落接种于YPD培养基中(1％(w/v)细菌培养用-酵母提取物；2％(w/v)蛋白胨；2％(w/v)D-葡萄糖)。于30℃以200rpm振荡过夜培养后，10μl培养物接种于500ml容积myer烧瓶的200mlYPD中。在30℃以200rpm再次振荡培养，然后收集OD600值为0.2-0.3的酵母培养物。酵母培养物于室温在1,500xg下离心5分钟，在20ml无菌蒸馏水中重悬并洗涤这样分离的酵母，然后在1,500xg下再离心5分钟。重复该过程，酵母进一步用20mlSED缓冲液(0.95M山梨醇；23.75mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0；50mMDTT)洗涤1次，然后用20ml1M山梨醇洗涤1次，随后重悬于20mlSCE缓冲液(1M山梨醇；1mMEDTA；10mM氯化钠缓冲液，pH5.8)中。7.5μl3mg/ml的酶解酶(Invitrogen)加入到10ml酵母悬液中，该悬液于30℃孵育9分钟，通过OD600值在5％SDS中的降低作为指标进行判断，使70％的酵母转变成原生质球的形式。在750xg下离心10分钟后，酵母用10ml1M山梨醇洗涤1次，然后用10mlCaS溶液(1M山梨醇；10mMTris-HCl，pH7.5；10mMCaCl2)洗涤1次，再悬浮于0.6ml的CaS溶液中。10μg线性化的pM1283加到0.1ml的原生质球溶液中。室温孵育10分钟后，加入1ml聚乙二醇(PEG)/CaT溶液(20％(w/v)PEG3350；10mMTris，pH7.5；10mMCaCl2)，该溶液在室温下再孵育10分钟。然后将溶液在750xg下离心10分钟，离心沉淀中加入150μlSOS溶液(1M山梨醇；0.3×YPD；10mMCaCl2)。室温孵育该溶液20分钟后，加入850μl1M的山梨醇。这样获得的100μl溶液加入到10ml一直在45℃保存的无组氨酸的RD溶液(0.186g/ml山梨醇；20mg/mlD-葡萄糖；13.4mg/ml酵母氮剂(nitrogenbase)；0.4μg/ml生物素；50μg/mlL-谷氨酸；50μg/mlL-蛋氨酸；50μg/mlL-赖氨酸；50μg/mlL-亮氨酸；50μg/mlL-异亮氨酸，1％琼脂)。所得的溶液在RDB平板(2％琼脂；RD溶液)上铺成一层，于30℃孵育4天。所获得的转化子分别接种于MM平板(13.4mg/ml酵母氮剂；0.4μg/ml生物素；0.5％甲醇；1.5％琼脂)和MD平板(13.4mg/ml酵母氮剂；0.4μg/ml生物素；2％D-葡萄糖；1.5％琼脂)，并于30℃继续孵育2天。选出在MD板上增殖而几乎不在MM板上增殖的转化子，然后这些选出的转化子用于表达。(3)利用酵母制备人Fas配体的胞外区在(2)中制备的转化子30℃下在50ml试管中于10mlBMGY(1％(w/v)酵母提取物；2％(w/v)蛋白胨；13.4mg/ml酵母氮剂；0.4μg/ml生物素；1％(v/v)甘油；0.1M磷酸钾缓冲液。pH6.0)中振荡培养2天。这样获得的2ml培养物加入到每个装有100mlBMGY的500mlmyer烧瓶中，通过振荡培养获得2升OD600值在10～20的培养物。在4,000xg下室温离心10分钟以收集酵母，然后悬于400mlBMMY(1％(w/v)酵母提取物；2％(w/v)蛋白胨；13.4mg/ml酵母氮剂；0.4μg/ml生物素；0.5％(v/v)甲醇；0.1M磷酸钾缓冲液，pH6.0)。各取50ml悬液加入到8个500ml的myer烧瓶中，于30℃振荡培养另外的2天。所得的培养物于13,000xg下离心10分钟以获得含有人Fas配体胞外区的培养上清。接着，已用0.22μm孔径的滤膜过滤的50ml培养上清用80％饱和硫酸铵盐析并在4℃静置1小时。在10,000rpm离心10分钟来回收沉淀并溶于含0.15MNaCl的0.067M磷酸缓冲液(pH7.2)中，然后该溶液进行透析。透析后，在10,000rpm离心10分钟并用0.22μm的滤膜过滤以进一步除去杂质。2ml该溶液上样到凝胶过滤柱(Hiprep16/60SephacrylS-300HR，Pharmacia)中，在0.5ml的速度下低速洗脱。回收洗脱物每个级分2ml，通过测定280nm处的吸收值对洗脱级分进行蛋白质检测。根据在1-3中所述的方法，每个级分取出30μl来检测诱导凋亡的活性。每个级分也取出50μl以固定在免疫培养板上，根据在2-1中所述的方法用抗M52肽的抗体检测Fas配体。图6是凝胶过滤图，在两个系列级分中发现与抗M52肽的抗体有结合活性，而只在较低分子量的系列级分中发现有凋亡诱导活性。通过4-20％SDS-PAGE(TEFCO)对表现出活性的级分进行检测，结果发现在分子量大约30,000，即Fas配体胞外区的分子量处的条带只在那些表现出凋亡诱导活性的具有较低分子量的级分中检测到，而分子量超过140,000的条带在具有较高分子量的级分中检测到。因此估计具有较高分子量的级分中含有聚集的Fas配体(此后有时候称为酵母Fas配体聚集体)。回收具有凋亡诱导活性的级分并用Centricon-10(Amicon)进行浓缩。利用BSA作为标准品通过蛋白质测定(BioRadLaboratories)确定浓缩物的蛋白质浓度。该浓缩物被用作人Fas配体胞外区的一种部分纯化的产物。用80％饱和硫酸铵对来自酵母的培养上请进行盐析，对含0.15MNaCl的50mMTris-HCl，pH8.0进行透析，并上样至结合hFas-Fc的蛋白A-Cellurofine(ChissoK.K.)所填充的亲和层析柱(5ml)从而获得纯化的Fas配体的胞外区。亲和层析柱的制备方法包括按照蛋白A-Cellurofine所附带的说明书，将描述于国际专利申请公开号WO95-13293的实例1中的hFas-Fc与蛋白A-Cellurofine结合(ChissoK.K.)。洗涤层析柱后，用含2MNaClpH8.0的50mMTris-HCl，洗脱层析柱，并回收280nm峰处的级分。这样回收的级分对pH6.0的50mMMES缓冲液进行透析，并上样至Monos(HR5/5，Pharmacia)，用含500mMNaCl的pH6.050mMMES缓冲液进行洗脱以回收280nm峰处的级分。回收的级分用Centricon-10(Amicon)浓缩，然后该浓缩物对PBS进行透析。用BSA作为标准品用Lowry法测定蛋白质的浓度。获得了38μg纯化的人Fas配体胞外区(蛋白质浓度，300μg/ml)。4-2用多克隆抗体制备夹心ElA系统采用DEAE-纯化的兔抗M52肽的抗体和抗Fas配体抗血清(批号8-2)制备夹心ElA系统。首先，50μl/孔DEAE-纯化的兔抗-M52肽抗体用PBS稀释至10μg/ml，加入至免疫培养板(Maxisorp，Nunc)的孔中，免疫培养板于45℃孵育30分钟使抗体固定在孔中。用离子交换水洗涤孔5次后，各孔中加入100μl的0.1％BSA/PBS，并室温封闭30分钟。弃去封闭剂后，各孔中加入25μl用0.1％BSA/PBS稀释至浓度为0～250ng/ml的纯化的Fas配体胞外区，以及25μl用0.1％BSA/PBS稀释至500倍的抗Fas配体抗血清(批号8-2)，然后于37℃反应1小时。之后，用含0.005％吐温20的0.9％NaCl洗涤各孔两次，加入50μl用10％兔血清/PBS稀释至1,000倍的HRPO-标记的抗小鼠Igs抗体(DACO)。反应于37℃进行1小时。用洗液洗涤5次及离子交换水洗涤两次后，孔中加入50μl含0.027％过氧化氢的3mg/ml邻苯二胺/0.1MMcIlvaine缓冲液，pH5.0，然后反应10分钟。用50μl1N盐酸终止反应，用分光光度计测定490nm处的吸收值。图7示出标准曲线。结果表明所制备的夹心EIA系统能够高灵敏地定量测定Fas配体。4-3用单克隆抗体制备夹心EIA系统如下所述制备用单克隆抗体的夹心EIA系统。首先，用过氧化物酶标记单克隆抗体，方法依据于Nakane等所述“免疫荧光和相关染色技术”(ImmunofluorescenceandRelatedStainingTechniques)，Knapp，W.，Holubar，K.和Wick，G.编辑，1978。更详细说明，称取6mg过氧化物酶(RZ3.11，Toyobo.Co.，Ltd)并溶于1.5ml蒸馏水中，在该溶液中加0.3ml溶于蒸馏水的0.1M偏碘酸钠。该溶液室温静置15分钟后，加入0.3ml溶于蒸馏水的1.5％1，2-亚乙基二醇，然后溶液在室温静置20分钟。所得到的溶液在4℃对pH4.4，0.00lM乙酸盐缓冲液过夜透析。127ul所得到的活性过氧化物酶(相应于400μg过氧化物酶)中加入7μlpH9.5的1M碳酸盐缓冲液，然后加入500ng对pH9.5，0.01M碳酸盐缓冲液透析过的纯化单克隆抗体(2～3mg/ml)，其后溶液于25℃孵育2小时进行反应。随后溶液中加入12μl4mg/ml的溶于pH9.50.01M碳酸盐缓冲液的氢硼化钠，然后溶液于4℃静置2小时。接着溶液于4℃对0.076M，pH6.4的PBS过夜透析，将所获得的过氧化物酶标记抗体加入其量一半的18％蔗糖和0.3％BSA/PBS后保存在-20℃。其后，50μl/孔的F918系列和F919-9-8单克隆抗体分别加至免疫培养板的孔中(Maxisorp，Nunc)，并于45℃将免疫培养板孵育30分钟使抗体固定在孔中。用离子交换水洗涤各孔5次后，加入0.1％BSA/PBS以封闭各孔，然后培养板于室温孵育30分钟。弃去封闭试剂后，各孔中加入25μl用0.1％BSA/PBS稀释至浓度为0～100ng/ml的纯化Fas配体胞外区，随后加入25μl用10％兔血清/PBS稀释至0.5～2μg/ml的HRPO标记抗体(F918系列或F919-9-18)，然后于37℃反应1小时。之后，各孔用含0.005％吐温20的0.9％NaCl洗液洗涤5次，并用去离子水洗涤两次。接着孔中加入50μl含0.027％过氧化氢的3mg/ml邻苯二胺/0.1MMcIlvaine缓冲液pH5.0，并进行反应10分钟。用50μl1N盐酸终止反应，并用分光光度计测定490nm处的吸收值。表2说明单克隆抗体的组合和在EIA中用这种抗体组合所获得的结果。结果表明了抗M52肽的单克隆抗体(F918系列)与抗Fas配体抗体(F919)组合的可能性。应用以下组合进行的夹心系统也是可能的，即含有两种抗-M52肽单克隆抗体F918-9-4/F918-7-3的组合以及含有相同抗体F919-9-18/F919-9-18的组合。应当注意在表2中，“高”表示高反应性；“相当”表示相当程度的反应性；“低”表示低反应性；“无”表示无反应性。在表2中，兔抗-M52和兔抗-M57是分别用M52和M57肽免疫的兔子的抗血清。表4按下面所述的方法，表达人Fas配体胞外区的缺失突变体，多肽nd5、nd12、nd20、nd32和nd49；人Fas配体胞外区的置换突变体，多肽L179F；游离Fas配体。应当指出多肽nd5、nd12、nd20、nd32、nd42和nd49是从序列表中序列鉴定号9所述的氨基酸序列的N端分别缺失5个氨基酸、12个氨基酸、20个氨基酸、32个氨基酸、42个氨基酸和49个氨基酸的多肽，即，分别具有从第6、第13、第21、第33、第43和第50位氨基酸延伸到第179位氨基酸的氨基酸序列的多肽。多肽cd179是从序列表中序列鉴定号9所述的氨基酸序列的C端缺失了1个氨基酸的多肽；即，具有氨基酸序号1～178的氨基酸序列的多肽。多肽L179F是在序列表中序列鉴定号9所述的氨基酸序列中C端氨基酸残基亮氨酸已被苯丙氨酸取代的多肽。游离Fas配体是表达在COS-1细胞表面并释放到培养上清中的Fas配体，并且用于表达的COS-1细胞是已导入含有全长Fas配体的质粒的细胞。(1)制备质粒pM1081按下述的方法制备编码人Fas抗原的信号肽和人Fas配体胞外区的质粒pM1081。作为沉默突变的结果，pM1081含有在编码人Fas抗原信号肽的序列中引入的SpeI和PshAI识别位点，以及在编码人Fas配体的序列中引入的PstI识别位点。首先，化学合成有义引物2(TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG)和反义引物2(CTTCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCGACACTAGTCAGAACCAGAGG)。有义引物2包括编码人Fas抗原信号肽的序列的5端区域；以及EcoRI位点(GAATTC)。反义引物2包括人Fas配体胞外区的N端和编码人Fas抗原信号肽的序列的C端；PstI位点(CTGCAG)；SpeI位点(ACTAGT)；和PshAI位点(GACTAGTGTC)。制备含有所获得的反义引物2和有义引物2每种100pmol；50ng含有编码人Fas抗原的DNA的质粒pBLF58-1(Itoh，N，等，《细胞》(cell)，66卷，233-243页，1991)；以及2.5UpfuDNA聚合酶和10μl包含于pfuDNA聚合酶配套试剂(Stratagene)中的pfu缓冲液的溶液100μl。每轮PCR循环包括94℃(30秒)，55℃(30秒)，和72℃(1分钟)，用DNA热循环仪(PCR系统9600，PerkinElmer)重复30次循环。用EcoRI和PstI双酶切PCR产物，酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。回收大约70bp的DNA片断并用QIAEX试剂盒(QIAGEN)纯化。将上述大约70bp的片断插入到质粒pM1067的EcoRI-PstI位点，质粒pM1067描述于国际专利申请公开号WO95-13293的实例18中。当证实了所得到的质粒的核苷酸序列后，发现在EcoRI位点和SpeI位点之间有16bp的缺失。为了构建EcoRI位点和SpeI位点之间的序列，化学合成有义寡核苷酸1(AATTCACCATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACCTCTGGTTCTGA)和反义寡核苷酸1(CTAGTCAGAACCAGAGGTAGGAGGGTCCAGATGCCCAGCATGGTG)，并制备20μl含有义寡核苷酸1和反义寡核苷酸1每种1nmol的TE溶液。TE溶液加热至95℃，持续5分钟，逐渐冷却至16℃以使核苷酸退火并产生具有EcoRI酶切位点和另一端有SpeI酶切位点的双链DNA片断。这样制备的DNA片断插入到上述具有16bp缺失的质粒的EcoRI位点和SpeI位点之间以获得pM1081。(2)制备质粒pM1291首先，化学合成有义引物3(CTGACTAGTGTCGCTCAGAAGGAGCTGGCA)和反义引物3(GTCTTCCCATTCCAGAGGCATGG)。有义引物3包括编码位于人Fas抗原信号肽C端的氨基酸序列的核苷酸和编码从人Fas配体胞外区N端第6到第10个氨基酸的氨基酸序列的核苷酸；SpeI位点(ACTAGT)；以及PshAI位点(GACTAGTGTC)。反义引物3是与人Fas配体胞外区cDNA的第164到第186核苷酸的核苷酸序列互补的序列，并包括BstXI位点(CCAGAGGCATGG)。制备含有这样制备的有义引物3和反义引物3每种100pmol；50ng描述于国际专利申请公开号WO95-13293的实例12中的pBX-hFL1；dATP、dCTP、dGTP、dTTP每种20nmol；以及2.5UpfuDNA聚合酶和10μlpfu缓冲液(两种pfu均购自Stratagene)的溶液100ml。重复上述(1)的过程进行PCR。所得的PCR产物用SpeI和BstXI双酶切，并插入到(1)中制备的质粒pM1081的SpeI-BstXI位点。所得的质粒称为pM1291。(3)制备质粒pM1292首先，化学合成有义引物4(CTGACTAGTGTCGCTCGAGAGTCTACCAGC)。有义引物4包括编码位于人Fas抗原信号肽C末端的氨基酸序列的核苷酸序列和编码人Fas配体胞外区的N端第13到第17氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列；SpeI位点(ACTAGT)；和PshAI位点(GACTAGTGTC)。用有义引物4和(2)中的反义引物3重复(2)中的过程进行PCR。所得的PCR产物用SpeI和BstXI双酶切，并插入到(1)中制备的pM1081的SpeI-BstXI位点上。所得的质粒称为pM1292。(4)制备质粒pM1293首先，化学合成有义引物5(CTGACTAGTGTCGCTACAGCATCATCTTTG)。有义引物5包括编码位于人Fas抗原信号肽C末端的氨基酸序列的核苷酸序列和编码人Fas配体胞外区的N末端第21到25氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列；SpeI位点(ACTAGT)；和PshAI位点(GATCTAGTGTC)。用有义引物5和(2)中的反义引物3重复(2)中的过程进行PCR。所得的PCR产物用SpeI和BstXI双酶切，并插入到pM1081的SpeI-BstXI位点。所得的质粒称为pM1293。(5)制备质粒pM1295首先，化学合成引物6(CTGACTAGTGTCGCTAGTCCACCCCCTGAA)。引物6包括编码位于人Fas抗原信号肽C末端的氨基酸序列的核苷酸序列和编码人Fas配体胞外区N末端第33到37氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列；SpeI位点(ACTAGT)；和PshAI位点(GACTAGTGTC)。用有义引物6和(2)中的反义引物3重复(2)中的过程进行PCR。所得的PCR产物用SpeI和BstXI双酶切，并插入到pM1081的SpeI-BstXI位点。所得的质粒称为pM1295。(6)制备质粒pM1296、pM1297、pM1298和pM1300制备于(2)～(5)的质粒pM1291、pM1292、pM1293和pM1295分别用EcoRI和KpnI双酶切，酶切产物进行凝胶电泳。分别回收大约580、570、540和500bp的DNA片断，并用QIAEX试剂盒(QIAGEN)纯化DNA。上述大约580、570、540和500bp的DNA片断分别插入到通过用dhfr基因重组修饰动物细胞表达载体pEF-BOS而制备的pM1103的EcoRI-KpnI位点上。(PEF-BOS见Mizushima和Nagata，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)，18卷5322页，1990)。所得的质粒分别称为pM1296、pM1297、pM1298、pM1300.利用PRISMDyeTerminatorCycle测序试剂盒(Perkin-Elmer)和DNA测序仪(型号373A，Perkin-Elmer)确定这样制备的质粒的核苷酸序列。结果发现质粒pM1296、pM1297、pM1298和pM1300分别含有国际专利申请公开号PCT/JP95/00883的序列表中序列鉴定号1、2、3和4所述的DNA，这些DNA分别是编码人Fas配体胞外区N末端第6、第13、第21和第33氨基酸之后的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明的发明者用已知的方法将质粒pM1297和pM1300分别转化大肠杆菌HB101，所得的转化子大肠杆菌HB101(pM1297)和HB101(pM1300)于1995年4月26日保存于国立生命科学和人体技术研究所(登记号FERMBP-5083，FERMBP-5084)。(7)制备包括编码人Fas配体胞外区的DNA的质粒pM1070-pUC118首先，化学合成有义引物2(TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG)和反义引物4(AACCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCAACAGACGTAAG)。有义引物2包括EcoRI位点(GAATTC)，和编码人Fas抗原信号肽N末端5个氨基酸的核苷酸序列。反义引物4包括PstI位点(CTGCAG)；编码人Fas配体胞外区N末端4个氨基酸的核苷酸序列；和编码人Fas抗原信号肽C末端5个氨基酸的核苷酸序列。制备含所得的引物每种100pmol；50ng包括编码人Fas抗原氨基酸的DNA的pBLF58-1(ItohN等，《细胞》(cell)66卷233-243页，1991)；dATP、dCTP、dGTP、dTTP每种20nmol；以及2.5U的pfuDNA聚合酶和10μlpfu缓冲液(两种均购自Stratagene)的溶液100μl。每轮PCR循环包括94℃(30秒)，55℃(30秒)，和72℃(1分钟)，用DNA热循环仪(PCR系统9600，PerlcinElmer)重复30次循环。PCR产物用EcoRI和PstI双酶切，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。回收大约70bp的DNA片断，并用QIAEX试剂盒(QIAGEN)纯化。用EcoRI和PstI双酶切描述于国际专利申请公开号WO95-13293的实例18中的pM1067，上述大约70bp的DNA片断插入到这样酶切的质粒中以获得质粒pM1070-pUC118。(8)制备包括编码L179F的DNA的质粒pM1090，L179F是C端氨基酸发生置换的人Fas配体胞外区的突变体。首先，化学合成有义引物7(GAGCTACTGCACTACTGGGC)和反义引物5(CTTGGTACCCTATTAGAACTTATATAAGCC)。有义引物7包括编码人Fas配体胞外区第129～135氨基酸的20bp的DNA；并且ApaI位点(GGGCCC)位于其下游6pb。反义引物5包括编码人Fas配体胞外区C末端第175～178氨基酸的核苷酸序列，并且编码第179亮氨基酸的核苷酸序列(CTC)替换为编码苯丙氨酸的核苷酸序列(TTC)。反义引物5也包括终止密码子(TAA，TAG)和KpnI位点(GGTACC)。用有义引物7和反义引物5重复(2)中的过程进行PCR。所得的PCR产物用ApaI和KpnI双酶切，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。回收大约130bp的DNA片断并用QIAEX试剂盒(QIAGEN)纯化。用ApaI和KpnI双酶切含有编码人Fas配体胞外区的DNA的质粒pM1070、pUC118，将上述大约130bp的DNA片断插入到质粒中。所得的质粒用EcoRI和KpnI双酶切，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。回收大约600bp的DNA片断并用QIAEX试剂盒纯化。上述大约600bp的DNA片断插入到pM1103的EcoRI-KpnI克隆位点，pM1103是通过将DHFR基因插入到动物细胞表达载体pEF-BOS(Mizushima和Nagata，《核酸研究》(NucleicAcidRes.)18卷，5322页，1990)中而构建的。所得的质粒称为pM1090。利用PRISMDyeTerminatorCycle测序试剂盒(Perkin-Elmer)和DNA测序仪(373A型，Perkin-Elmer)确定这样制备的质粒的核苷酸序列。结果证实质粒pM1090包含编码人Fas配体胞外区氨基酸序列(序列表中序列鉴定号9)的DNA，其中C末端氨基酸残基，亮氨酸已替换为苯丙氨酸。(9)转化入COS-1细胞如下所述，描述于国际专利申请公开号WO95-13293的实例18中的pM1090、pM1296、pM1297、pM1298、pM1300、pM1070和描述于国际专利申请公开号WO95-13293的实例12中的pEX-hFL1用来制备转化子COS-1/pM1090、COS-1/pM1296、COS-1/pM1297、COS-1/pM1298、COS-1/pM1300、COS-1/pM1070和COS-1/pEX-hFL1。更详细说明，每种质粒DNA8.1μg溶于40μlTris/EDTA溶液中。2.5μl该溶液中加入0.7ml含0.2g/mlDEAE-葡萄糖和50mMpH7.4Tris-HCl的DMEM(NissuiSeiyaku)以制备DNA-DEAE-葡聚糖混合液。将该混合液加入到已在6孔板中生长至半汇合的单层COS-1细胞上，在5％CO2下培养板于37℃孵育以获得转化子COS-1/pM1090、COS-1/pM1296、COS-1/pM1297、COS-1/pM1298、COS-1/pM1300、COS-1/pM1070和COS-1/pEX-hFL1。这样获得的转化子COS-1/pM1090、COS-1/pM1296、COS-1/pM1297、COS-1/pM1298、COS-1/pM1300、COS-1/pM1070和COS-1/pEX-hFL1均于37℃在含1％FCS的D-MEM中培养72小时，然后收集培养上清。通过实例1～3中所述的方法评定培养上清诱导凋亡的活性。(10)游离Fas配体所用的游离Fas配体是从转化子COS-1/pEX-hFL1的培养上清中回收的，COS-1/pEX-hF1是依据于上述(9)所述的方法，通过将描述于国际专利申请公开号WO95-13293的实例12中的pEX-hFL1导入COS-1细胞而制备的(此后游离Fas配体有时称为COS游离)。据报道一种特异的基质金属蛋白酶样的酶酶解膜结合的Fas配体而产生其可溶性(游离)形式(TanakaM等，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBOJ.)14卷1129-1135页(1995)，TanakaM等，《自然医学》(NatureMedicine)2卷317-322页(1996))。游离Fas配体的N末端氨基酸是Fas配体胞外区的第28位谷氨酰胺，即，游离Fas配体缺乏膜结合Fas配体N末端的27个氨基酸。5-2与各种Fas配体的反应性用各种Fas配体来评定8种类型EIA系统的抗原特异性。利用Fas配体胞外区的各种缺失和替换突变体；聚集的Fas配体胞外区(酵母FasL聚集体)和纯化的Fas配体胞外区(酵母FasL)(见4-1中所述)；描述于3-1中的来自COS-1细胞的Fas配体胞外区(COSsFasL)；以及游离的Fas配体(COS游离)作为Fas配体以确定与这些Fas配体每一种的反应性。如表3所示，用M52肽免疫所获得的单克隆抗体包括识别M52肽N末端区的单克隆抗体(F918-7-3)；和识别M52肽C末端区的单克隆体(F918-9-4)。表3也证实了F919-9-18的结合区位于M52肽位点的C末端，因为F919-9-18也与不包括M52肽区的Fas配体的胞外区发生反应，并且F919-9-18只与表现出凋亡诱导活性的Fas配体胞外区发生反应。应当指出“高”表示高反应性；“低”表示低反应性；而“无”表示无反应。表3与夹心EIA系统反应的各种Fas配体</tables>5-3正常人血清的影响为了根据在4-2中所述的方法对正常人血清进行测定，检测人血清对Fas配体测定的影响。描述于实例4-1中的部分纯化的Fas配体胞外区用0.1％BSA/PBS或正常人血清稀释，并制作标准曲线。如图8所示，加入0.1％BSA/PBS和加入正常人血清未见差别，但未加入Fas配体时正常人血清的背景值较0.1％BSA/PBS稍低，于是得出结论正常人血清不影响Fas配体的测定。6.在患各种疾病的病人血清中检测Fas配体利用患各种疾病的病人血清依据4-2中所述的方法对血中的Fas配体进行检测。描述于实例4-1中的纯化Fas配体胞外区用正常人血清稀释至0、10、50、100和200ng/ml，将这些稀释物用作标准品。检测了取自正常献血者的26例血清，取自乙型肝炎病人的36例血清，取自丙型肝炎病人的13例血清，取自HIV抗体阳性病人的14例血清，和取自患其它疾病的病人的血清。图9列出了不同血清的检测结果。正常献血者测定出低于测定敏感性的数值(大约1ng/ml)，而高数值发现于乙型肝炎(9/36)，丙型肝炎(4/13)，和HIV抗体阳性的病人(1/14)(括号中所示为当阈值定在1ng/ml时阳性例数与测定数之比)。阳性病例也见于疟疾患者(2/10)，风湿性关节炎患者，以及抗DNA抗体阳性的自身免疫病患者(1/1)，这表明Fas配体与这些疾病的病因学或病理学相关。7.小鼠F919-9-18抗体可变区cDNAs的克隆和测序用锚定PCR克隆小鼠F919-9-18抗体(此后简称为F919)的重链和轻链可变区cDNAs(见，Co等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)148卷1149页(1992)，普通转让的U.S.S.N.07/634,278)所用的5引物与加入到cDNA中的多聚-dG退火，3引物与恒定区退火。然后将PCR扩增的基因片断插入到pUC18中。从几个独立的克隆中确定轻链和重链可变区cDNA的核苷酸序列。对重链鉴定出了一段单一序列，是典型的小鼠重链可变区。对轻链鉴定出了均与小鼠轻链可变区序列同源的两段单一序列。然而，一段序列由于缺失了1个核苷酸使得V-J结合区发生了移码，所以没有功能，因而称为无效等位基因。另一序列是典型的小鼠kappa链可变区。对每一段序列的几个克隆分别测序并发现它们相同。重链和功能性轻链的可变区cDNA序列以及来源于这些序列的氨基酸序列被示于图10和11中。8.用计算机进行设计使人源化F919可变区模型化为了保持人源化抗体的高结合亲和性，进行Queen等所述的一般方法(见，Queen等，《国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86卷10029(1989)和WO90/07861，在此引入作为参考)。在保持高结合亲和性方面中重要的是框架残基的选择。原则上，从任何人抗体中得到的框架序列都能作为CDR移植的模板；但是，已经证实直接将CDR置换进这种框架将导致对抗原的结合亲和性明显丧失(Glaser等，《免疫学杂志)》(J.Immunol.)149卷2606页(1992)；Tempest等，《生物技术》(Biotechnology)9卷266页(1992)；shalabg等，《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)17卷217页(1992))。人抗体(受者)与起源的小鼠抗体(供者)越同源，人框架越不可能引起能诱导亲和性的小鼠CDRs的改变。依据对抗体序列数据库进行的序列同源性检索，选出人抗体Eu作为与小鼠F919抗体同源的优良框架，虽然其它高度同源的人抗体链也可能是适合的，尤其人亚组I的Kappa轻链和人亚组I的重链(此为Kabat等所述，《免疫学相关蛋白的序列》(SequenceofProteinofImmunologicalInterest)，第5版，U.S.DepartmentofHealth和HumanServices，1991)。利用计算机程序ENCAD(Levitt等，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)168卷595页(1983)，在此引入作为参考)来构建F919可变区的分子模型，其用来在F919框架中确定与CDRs紧密相邻从而有可能与它们相互作用的氨基酸。为设计人源化F919重链和轻链的可变区，将小鼠F919抗体的CDRs插入到人Eu抗体的框架区。在计算机模型提示与CDRs有明显接触的框架位置上；用来自小鼠抗体的氨基酸置换最初人框架区的氨基酸。对人源化F919来说，该置换发生在重链27、30、45、46、68、70、72和97位上的残基以及轻链7、22、70、71、和87位上的残基。构建另一序列变体的人源化轻链以保留两个人框架区的残基(变体2)，即，变体1中7和22位的T和S在变体2中分别替换为S和T。在后面所示的结果表明在轻链的两个变体之间结合亲和力没有明显的差别。因此优选变体2作人源化的轻链，因为它保留了更多的人残基。进一步，在人抗体数据库中其位置上只有极少数情况下才出现的框架残基用这些位置的人共有氨基酸置换。对人源化F919抗体来说，该置换发生于重链的74、93、95、98、107、108、109和111位上的残基以及轻链48和63位上的残基。人源化F919抗体重链和轻链(变体2)可变区的序列示于图13和12中。然而，许多潜在的接触CDR的残基可以替换成仍能使抗体保留对抗原的基本亲和力的其它氨基酸。下面的表中(表4)列举了框架区的许多位置，在该位置上可供选择的氨基酸也是合适的(LC＝轻链，HC＝重链)。表4</tables>同样，在人源化F919轻链和重链中不与CDRs接触的许多框架残基可进行以下氨基酸的置换以来自人EU抗体、其它人的抗体、小鼠F919抗体或其它小鼠抗体相应位置的氨基酸置换，许多框架残基可进行这样的置换而没有明显丧失亲和性或人源化抗体的无免疫原性。下面的表中(表5)列举了框架区中可供选择的氨基酸可能是适合的许多其它的位置。表5选择可供选择的氨基酸的组合可用于产生人源化F919的许多变体，这些变体具有亲和性、特异性、无免疫原性、制备的容易程度、和其它所需特性的各种不同组合。因此提供上述表中的实例是用来举例说明，而不是限制。9.构建人源化的F919按上面所述，一旦设计了人源化可变区的氨基酸序列，便构建基因以编码该序列，该序列包括信号肽，剪接供位信号和适当的限制性位点(图12和13)。构建重链的可变区基因并用8个长度为61-79个碱基、相互重叠的合成寡核苷酸进行扩增。寡核苷酸成对退火并用DNA聚合酶的Klenow片断延伸，产生4个双链片断。所得的片断进行变性、退火并用Klenow延伸，产生两个片断。这些片断再变性、成对退火和延伸，产生全长的基因。所获得的产物用Taq聚合酶通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增，凝胶纯化，用XbaI酶切，再次凝胶纯化，并亚克隆进pVg1(见Co等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)148卷1149页(1992))或pVg4表达载体的XbaI位点。pVg4载体的构建是通过将pVg1中含有γ1恒定区基因的XbaI-BamHI片断替换为大约2000bp的人γ4恒定区基因片断(Ellison和Hood，《国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79卷1984页(1982))，后者是从γ4基因的CH1外显子之前的HindIII位点到该基因CH4外显子后的NsiI位点之后的270bp。通过核苷酸测序和限制性图谱分析来证实所得到的质粒。轻链可变区序列被发现是与HuC4G1高度同源的，HuC4G1是以前构建的对gpIIb/IIIa特异的人源化抗体。在全部的可变区中，HuC4G1轻链与HuF919的轻链(变体1)只在30、53、70和92位上有四个氨基酸残基不同。因此我们用合成的寡核苷酸和PCR通过定点诱变将所需要的氨基酸残基在这四个位置上引入在pVk质粒中所构建的HuC4G1轻链基因中，从而构建了HuF919轻链可变区基因。轻链的第2变体序列在7和22位上有另外的两个氨基酸残基不同并以相似的方式进行构建。因此在含有人Ck基因的pVk载体中所得的质粒每个都包含人源化的F919的可变区基因(见Co等，出处同上)。最终获得的质粒也通过核苷酸测序和限制性图谱分析进行证实。所有的操作都依据本领域技术人员熟知的标准方法进行。如下所述，通过重链和轻链的不同组合而构建了4种人源化的F919抗体表6<tablesid="table5"num="005"><tablewidth="675">抗体名称重链轻链HuF919G1.v1gamma1链Kappa链变体1HuF919G1.v2gamma1链Kappa链变体2HuF919G4.v1gamma4链Kappa链变体1HuF919G4.v2gamma4链Kappa链变体2</table></tables>为了构建分泌上述每一种抗体的细胞系，重链和轻链质粒分别转染进小鼠骨髓瘤细胞系SPZ-O-ag14(ATCCCRL1581)。转染前，含重链和轻链的质粒分别用BamHI和FspI酶切使之线性化。每种质粒大约20μg于PBS中转染进1×107个细胞中。转染过程是依据生产商的说明书在360伏和25μFD电容值下利用基因脉冲器(GenePulserapparatusBioRad)进行电穿孔来完成的。将每次转染的细胞置于4块96孔组织培养板中，并在2天后，加入选择培养基(D-MEM，10％FCS，1×HT补充物(Sigma)，0.25mg/ml黄嘌呤，1μg/ml霉酚酸)。大约两周后，通过ELISA筛选出产生抗体的克隆。来自每一种转染的高分泌性克隆的抗体制备如下在常规培养基(含10％FCS的D-MEM)中培养细胞至汇合，然后替换成无血清的培养基(杂交瘤SMF；Gibco)并继续培养直至在培养物中获得最高的抗体滴度。培养上清过蛋白A-Sepharose柱(Pharmacia)；抗体用0.1M甘氨酸，0.1MNaCl，pH3.0进行洗脱，并随后改成磷酸缓冲盐溶液(PBS)。抗体的纯度通过在丙烯酰胺凝胶上分析加以证实，其浓度通过OD280的读数进行确定，同时假定1.0mg抗体蛋白质的OD280读数为1.13。10.人源化F919的特性为了证明小鼠和人源化的F919抗体能与Fas配体抗原结合，每种抗体2.5ng(小鼠F919，HuF919G1.v1，HuF919G1.v2，HuF919G4.v1和HuF919G4.v2)分别与1A12细胞共同冰浴30分钟，其中1A12细胞为经转染并表达Fas配体的小鼠淋巴瘤细胞系WR19L。细胞用冰冷的PBS洗涤，再与FITC-标记的山羊抗人或抗小鼠抗体(TagoImmunologicals)共育30分钟，并通过流式细胞仪(FACS)分析。FACS直方图证实了小鼠和四种人源化的F919抗体能特异地与1A12细胞结合，而不能与未转染的细胞系WR19L结合。为了评定人源化的F919抗体与小鼠F919抗体竞争结合受体(结合Fas配体)的能力，逐步增加浓度(0.01-50μg/ml)的小鼠F919抗体和人源化F919每一变体的抗体分别在4℃与5×105个1A12细胞和固定量(5ng)的示踪物125I-标记的小鼠抗体共同孵育90分钟。小鼠和人源化的F919抗体以基本相同的效率竞争(图14和15)。从数据中计算出的每种抗体的结合亲和力是非常相似的；如下表所示(表7)。因此人源化的过程没有明显改变其来源抗体的结合亲和力。表7</tables>11.评定人源化F919抗体抑制凋亡的活性利用抑制1A12细胞对WC8细胞的细胞毒性的活性作为指标来检测对凋亡的抑制。1A12细胞是小鼠WR19L细胞被转化以表达人Fas配体的转化子(TanakaM.等，《自然医学》(NatureMedicine)2卷317-322页，1996)，而WC8细胞是WR19L细胞被转化以表达人Fas抗原的转化子。WR19L细胞几乎不表达小鼠Fas抗原并对TNF的细胞毒性作用敏感。根据RouvierE.等所述的方法(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.，177卷195-200页，1993)检测细胞毒性。首先，1A12细胞用含10％热灭活的胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基洗涤，然后用作效应细胞。另一方面，在100μl含10％灭活FBS的RPMI1640培养基中，1×106WC8细胞与20μCi[51Cr]铬酸钠[NEN]于37℃孵育2小时，随后用含10％灭活FBS的RPMI1640培养基洗涤并用作靶细胞。在总体积100μl中，1×104个1A12细胞和1×104靶细胞与各种递增浓度的小鼠或人源化的F919抗体于37℃孵育4小时。利用下面所示的公式，从每孔中用γ计数仪测定的培养上清的放射活性计算出特异裂解率。通过靶细胞在培养基中单独孵育测定51Cr的自发释放，并通过0.1％TritonX-100溶解靶细胞测定最大51Cr释放。每一种人源化的F919抗体表现出了与小鼠F919抗体几乎相同或稍强的凋亡抑制活性(图16和17)。12.用两种类型的单克隆抗体通过夹心EIA系统测定血中Fas配体的浓度制备采用两种单克隆抗体(F919-20-2，F919-9-18)的两步夹心EIA系统以测定人血中Fas配体的浓度。(1)制备多聚过氧化物酶标记的抗体依据PIERCE中说明书26101X所述的方法，用2-iminothiolane·盐酸(Trant′s试剂)将SH基团引入单克隆抗体F919-9-18中。更具体地举例说明，15mg抗体(15mg/ml)在凝胶过滤柱中(NAP-10，Pharmacia)以50mM含有0.1MNaCl和1mMEDTA的盐酸三乙醇胺缓冲液pH8.0(此后称为TEA)更换缓冲液。9克所得到的抗体(6mg/ml)加入容器中，每容器1.4mg，并且每容器中加入100ng/mlTEA中的Trants试剂溶液，以使抗体与Trant′s试剂的摩尔比率分别为1∶5，1∶10和1∶50。用氮气排除空气后，室温下分别为反应60分钟。反应结束后，反应液在NAP-5(Pharmacia)中以含0.1MNaCl和5mMEDTA的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0更换缓冲液。依据PIERCE中说明书26101X所述的方法，利用Ellman′s试剂(5，5′-二硫-双-2-硝基苯甲酸)计算出所引入的SH基团的数目。当抗体与Trant′s试剂的摩尔比率是1∶5时，每分子抗体的SH基团数目是1.4；当摩尔比率是1∶10时为1.0；而当摩尔比率是1∶50时为1.3。在抗体与Trant′s试剂的摩尔比率为1∶5时所获得的最高SH基团引入率的抗体被用来制备多聚过氧化物酶(PolyPOD)标记的抗体。PolyPOD(MH)(Boehringer-Mannheim)用纯水溶解成5mg/ml，并将200μg(1.67mg/ml)上述抗体加入到PolyPOD溶液中以使抗体与PolyPOD的摩尔比率分别是4∶1，2∶1和1∶1。反应于30℃进行1小时。每种反应液中加入10μl5mMN-乙基马来酰亚胺以终止反应，并将反应液对0.076M含0.45％NaCl的磷酸盐缓冲液，pH6.4(此后称为PBS)于4℃过夜透析。在280nm和403nm处测定标记抗体的吸收值，并通过下述的公式计算出标记抗体的浓度。透析后测定溶液的体积，并向溶液中加入一半体积的18％蔗糖/0.3％BSA/PBS。所获得的溶液保存-40℃。标记抗体的浓度(mg/ml)＝10×A280-(A403×10/7.58×104)×2.29×104(2)制备F(ab′)2片断下面依据《超高敏感性酶免试验》(UltrahighSensitivityEnzymeImmunoassay)(EijiISHIKAWA，Gakkai，ShuppanCentr，1993)中所述的方法，从单克隆抗体F918-20-2中制备F(ab′)2片断。更详细举例说明，10mg(5mg/ml)抗体对含0.1MNaCl的0.1M乙酸钠缓冲液，pH4.2于40℃过夜透析。加入40μl(0.4mg)在相同缓冲液中的猪胃蛋白酶(Sigma)溶液，并于37℃反应24小时。反应液冰浴致冷，并用三(羟甲基)氨基甲烷调pH至大约7。然后溶液上样至用PBS平衡的蛋白A-固定化玻璃树脂柱(Prosep-A，BioProcessing)中以除去裂解的Fc片断。回收未吸附于柱的洗脱物，并于4℃将洗脱物对PBS过夜透析，然后加入叠氮化钠至终浓度0.05％溶液保存在4℃。从280nm的吸收值计算出F(ab)2片断的浓度。(3)测定人血清中Fas配体的数量从正常献血者中收集血清，利用F919-9-18抗体的吸附除去血清中的Fas配体，利用这样处理的血清作为稀释剂，并进行一系列的倍比稀释，来制备实例4-1中所述的纯化Fas配体胞外区的系列稀释物，从5ng/ml到0.08ng/ml。稀释剂被用作空白对照(0ng/mlFas配体)。按下述方法测定示于表8的一组血清的Fas配体浓度，以此阐明与临床症状的关系。表8产品名称管号代号抗-HIV血清转变组I8PRB909B甲肝血清转变组A5PHT901A乙肝血清转变组6PHM910A丙肝血清转变组7PHV902B用PBS稀释至30μg/ml的F918-20-2F(ab)2片断以70μl/孔加入免疫培养板(MaxisorpNunc)的孔中，于45℃孵育30分钟使抗体固定于孔中。用离子交换水洗涤各孔5次，并且每孔中加入200μl0.1％BSA/PBS以进行封闭。室温下封闭30分钟。从免疫培养板中弃去用作封闭的溶液后，Fas配体系列稀释物的每稀释度20μl和标本加入每孔中，并且每孔加入80μl含0.1％吐温20和0.9％NaCl的0.076M磷酸盐缓冲液，pH6.4作为第一轮反应的缓冲液。反应于37℃进行2小时，然后用含0.005％吐温20的0.9％NaCl洗涤各孔5次。接着，100μl0.5μg/ml稀释度的反应性最强的PolyPOD-标记的抗体(抗体PolyPOD，41)与含10％兔血清和1％小鼠血清的第一轮反应缓冲液加入孔中，反应于37℃进行1小时。用含0.005％吐温20的0.9％NaCl洗涤各孔5次；并用离子交换水洗涤2次。每孔中加入100μl含有0.2mg/mlN-四甲联苯胺和0.01％过氧化氢的0.16M乙酸钠缓冲液，pH5.5，并室温下无光照反应15分钟。每孔中加入100μl1N硫酸以终止反应，用吸收光度计测定波长450nm处的吸收值。图18是根据Fas配体系列稀释物测定值绘制标准曲线。该标准曲线用于计算每个标本的Fas配体浓度。图19-22表示各组血清与时间相关的Fas配体浓度和其它项目(描述于BostonBiomedical各组血清所附的说明书中)的测定值。利用适合转氨酶GPT(AutocellerGPT-2，DaiichiKagakuYakuhinK.K.)体外诊断的药用试剂采用Hitachi自动分析仪7070(Hitachi，Ltd.)测定甲型和乙型肝炎患者的血清组的ALT值。在怀疑患原发性HIV感染的病人的各组血清中，Fas配体值的增加见于感染的早期阶段(图19)。患甲型和丙型肝炎的病人的各组血清被怀疑为原发性感染，并可见随ALT值的增加Fas配体的浓度增加(图20和22)。另一方面，乙型肝炎病人也估计是原发性感染的病例。然而，在此情况下，既未见ALT值的变化也未见Fas配体浓度的增加(图21)。因此，结果表明在Fas配体和疾病的临床状况之间可能存在某种关系，并且Fas/Fas配体系统可能参与临床疾病状况的进展。施用抑制凋亡的抗Fas配体抗体很有可能对这些疾病是有效的。工业实用性根据本发明用抗Fas配体抗体测定人体液中Fas配体的方法，以及在这种测定方法中所用的抗体可被用来检测与各种已表明有Fas配体参与的疾病有关的Fas配体数量的增加/减少或异常，因此本发明的测定方法和抗体可用以预测、检测和诊断特定的疾病和它们的病理状况，以及用于选择适当的治疗，本发明的测定方法和抗体也有助于监测，以及确定治疗效果和已用Fas配体、Fas配体相关的物质或影响Fas配体表达的试剂治疗过的病人的预后。能够调节Fas配体作用的抗体可被用来调节内源性或外源性Fas配体诱导在体内发生的凋亡，因此，该抗体可用于治疗和诊断疾病。AIDS病毒感染的晚期所出现的免疫力的降低以及暴发性肝炎中的肝功能衰竭被认为是免疫细胞功能障碍以由于肝细胞凋亡所致的肝组织功能障碍的结果。在这些病理状况下，有必要抑制Fas配体的作用从而预防细胞的凋亡。应用抑制Fas配体诱导凋亡功能的抗Fas配体抗体应有助于治疗这些病理状况。本发明的抗Fas配体中和抗体在低浓度表现出强烈的抑制凋亡的效果，因此，预期本发明的中和抗体在体内低剂量使用时可获得所需要的治疗效果并抑制副作用。于是将可能获得理想的高效性，安全性和成本。进一步说，本发明的抗Fas配体抗体有助于预防和治疗推测与Fas配体/Fas抗体有关的疾病，比如与心脏梗死有关的再灌注紊乱，移植物抗宿主病(GVHD)，Cokitis溃疡病(ulcerosa)，以及Crohn病。本发明的人源化的抗体用于对人治疗时相对小鼠以及在某些情况下相对于嵌合抗体来说，具有至少3种潜在优势1)因为效应部分是人的，它可以更好地与人免疫系统的其它部分发生相互作用(如，通过补体依赖的细胞毒(CDC)或抗体依赖的细胞毒(ADCC)更有效地破坏靶细胞。2)人免疫系统不应将人源化抗体的框架区或C区识别为异物，因而针对这种注射抗体的抗体反应应小于针对完全为异源的小鼠抗体或部分异源的嵌合抗体的抗体反应。3)据报道，当注射的小鼠抗体在人体内循环时，其半衰期比天然存在的人抗体的半衰期短(ShawD.等《免疫学杂志》(J.Immunol)138卷4534-4538页(1987))。注射的人源化抗体的半衰期将可能有更类似于天然存在的人抗体，这允许给药剂量和频度更低。另一方面，增加Fas配体诱导的凋亡的抗Fas配体抗体可用于除去机体不需要的细胞。例如，如上面所述，AIDS病毒感染的细胞表达Fas抗原，因而，早期的AIDS可用这种抗Fas配体治疗，从而人工增加Fas配体诱导的凋亡并在更早期阶段除去感染的细胞。在其它自身免疫病中，通过人工增加Fas抗原介导的Fas配体诱导的凋亡，可除去自体抗原反应性T细胞。根据Morimoto，H等(《癌症研究》(CancerRes.)，53卷2591-2596页，1993)报导，通过给予阿霉素和顺氯氨铂诱导Fas抗原介导的癌细胞凋亡能带来协同抑癌效果，所以能增加Fas配体诱导的凋亡的抗Fas配体抗体也应有助于治疗癌症。Fas配体本身对治疗和研究的应用应该需要大量制备高纯度的Fas配体蛋白质。本发明的抗Fas配体抗体有助于纯化这种Fas配体。本发明的抗Fas配体抗体尤其有助于活性Fas配体的特异性高效纯化而不损害其活性，并且它是应能作为重要治疗试剂的活性Fas配体。序列表SEQIDNO1序列长度20序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列SerLeuGluLysGlnIleGlyHisProSerProProProGluLysLys151015GluLeuArgLys20SEQIDNO2序列长度14序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列LeuThrG1yLysSerAsnSerArgSerMetProLeuGluTrp1510SEQIDNO3序列长度13序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列TrpGluAspThrTyrGlyIleValLeuLeuSerGlyVal1510SEQIDNO4序列长度11序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列LeuValIleAsnGluThrGlyLeuTyrPheVal1510SEQIDNO5序列长度19序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列ValTyrSerLysValTyrPheArgGlyGlnSerCysAsnAsnLeu151015ProLeuSerHisSEQIDNO6序列长度18序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列LysValTyrMetArgAsnSerLysTyrProGlnAspLeuValMet151015MetGluGlySEQIDNO7序列长度16序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列LysMetMetSerTyrCysThrThrGlyGlnMetTrpAlaArgSer151015SerSEQIDNO8序列长度11序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列LeuValAsnPheGluGluSerGlnThrPhePhe1510SEQIDNO9序列长度179序列类型氨基酸序列分子类型蛋白质初始来源人序列GlnLeuPheHisLeuGlnLysGluLeuAlaGluLeuArgGluSerThr151015SerGlnMetHisThrAlaSerSerLeuGluLysGlnIleGlyHisPro202530SerProProProGluLysLysGluLeuArgLysValAlaHisLeuThr354045GlyLysSerAsnSerArgSerMetProLeuGluTrpGluAspThrTyr505560GlyIleValLeuLeuSerGlyValLysTyrLysLysGlyGlyLeuVal65707580IleAsnGluThrGlyLeuTyrPheValTyrSerLysValTyrPheArg859095GlyGlnSerCysAsnAsnLeuProLeuSerHisLysValTyrMetArg100105110AsnSerLysTyrProGlnAspLeuValMetMetGluGlyLysMetMet115120125SerTyrCysThrThrGlyGlnMetTrpAlaArgSerSerTyrLeuGly130135140AlaValPheAsnLeuThrSerAlaAspHisLeuTyrValAsnValSer145150155160GluLeuSerLeuValAsnPheGluGluSerGlnThrPhePheGlyLeu161165170175TyrLysLeu179SEQIDNO10序列长度23序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCys20SEQIDN011序列长度11序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列ArgAlaSerGlnAspIleSerAsnTyrLeuAsn1510SEQIDNO12序列长度15序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列TrpTyrGlnGlnLysProAspGlyThrValLysLeuLeuIleTyr151015SEQIDNO13序列长度7序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列TyrThrSerArgLeuHisSer15SEQIDNO14序列长度32序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列GlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsnTyrSer151015LeuThrIleSerAsnLeuGluGlnGlyAspIleAlaThrTyrPheCys202530SEQIDNO15序列长度9序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列GlnGlnGlySerThrLeuProTrpThr15SEQIDNO16序列长度10序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列PheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys1510SEQIDNO17序列长度127序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列MetMetSerSerAlaGlnPheLeuGlyLeuLeuLeuLeuCysPheGln151015GlyThrArgCysAspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSer202530AlaSerLeuGlyAspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAsp354045IleSerAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProAspGlyThrVal505560LysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSer65707580ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsnTyrSerLeuThrIleSer859095AsnLeuGluGlnGlyAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySer100105110ThrLeuProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys115120125SEQIDNO18序列长度30序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列GlnIleGlnLeuValGlnSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGlu151015ThrValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SEQIDNO19序列长度5序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列GluTyrProMetHis15SEQIDNO20序列长度14序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列TrpValLysGlnAlaProGlyLysGlyPheLysTrpMetGly1510SEQIDNO21序列长度17序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列MetIleTyrThrAspThrGlyGluProSerTyrAlaGluGluPheLys151015GlySEQIDNO22序列长度32序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列ArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGln151015IleAsnPheLeuLysAsnGluAspThrAlaThrTyrPheCysValArg202530SEQIDNO23序列长度8序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列PheTyrTrpAspTyrPheAspTyr15SEQIDNO24序列长度11序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列TrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValSerSer1510SEQIDNO25序列长度136序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列MetAspTrpValTrpThrLeuLeuPheLeuIleAlaAlaAlaGlnSer151015AlaGlnAlaGlnIleGlnLeuValGlnSerGlyProGluLeuLysLys202530ProGlyGluThrValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe354045ThrGluTyrProMetHisTrpValLysGlnAlaProGlyLysGlyPhe505560LysTrpMetGlyMetIleTyrThrAspThrGlyGluProSerTyrAla65707580GluGluPheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSer859095ThrAlaTyrLeuGlnIleAsnPheLeuLysAsnGluAspThrAlaThr100105110TyrPheCysValArgPheTyrTrpAspTyrPheAspTyrTrpGlyGln115120125GlyThrThrLeuThrValSerSer130135SEQIDNO26序列长度23序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列AspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCys20SEQIDMO27序列长度11序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列ArgAlaSerGlnAspIleSerAsnTyrLeuAsn1510SEQIDNO28序列长度15序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列TrpTyrGlnGlnLysproGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyr151015SEQIDNO29序列长度7序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列TyrThrSerArgLeuHisSer15SEQIDNO30序列长度32序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列GlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsnTyrThr151015LeuThrIleSerSerLeuGlnProAspAspPheAlaThrTyrPheCys202530SEQIDNO31序列长度9序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列GlnGlnGlySerThrLeuProTrpThr15SEQIDNO32序列长度10序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列PheGlyGlnGlyThrLysValGluValLys1510SEQIDNO33序列长度127序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValPro151015GlySerThrGlyAspIleGlnMetThrGlnSerProSerThrLeuSer202530AlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnAsp354045IleSerAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaPro505560LysLeuLeuIleTyrTyrTnrSerArgLeuHisSerGlyValProSer65707580ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsnTyrThrLeuThrIleSer859095SerLeuGlnProAspAspPheAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySer100105110ThrLeuProTrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluValLys115120125SEQIDNO34序列长度30序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SEQIDNO35序列长度5序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列GluTyrProMetHis15SEQIDNO36序列长度14序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列TrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyPheLysTrpMetGly1510SEQIDNO37序列长度17序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列MetIleTyrThrAspThrGlyGluProSerTyrAlaGluGluPheLys151015GlySEQIDNO38序列长度32序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列ArgPheThrPheThrLeuAspThrSerThrAshThrAlaTyrMetGlu151015LeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCysValArg202530SEQIDNO39序列长度8序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列PheTyrTrpAspTyrPheAspTyr15SEQIDN040序列长度11序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer1510SEQIDNO41序列长度136序列类型氨基酸拓扑构型线性序列分子类型蛋白质序列MetAspTrpValTrpThrLeuLeuPheLeuIleAlaAlaAlaGlnSer151015AlaGlnAlaGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLys202530ProGlySerSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe354045ThrGluTyrProMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyPhe505560LysTrpMetGlyMetIleTyrThrAspThrGlyGluProSerTyrAla65707580GluGluPheLysGlyArgPheThrPheThrLeuAspThrSerThrAsn859095ThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaVal100105110TyrTyrCysValArgPheTyrTrpAspTyrPheAspTyrTrpGlyGln115120125GlyThrLeuValThrValSerSer13013权利要求1.一种抗Fas配体抗体，其为抑制Fas抗原表达细胞的Fas配体诱导的凋亡的中和抗体，抑制率50％或更高。2.根据权利要求1的抗Fas配体抗体，其为抑制Fas抗原表达细胞的Fas配体诱导的凋亡的中和抗体，浓度为1μg/ml时，抑制率为50％或更高。3.一种抗Fas配体抗体，其为与具有凋亡诱导活性的Fas配体发生反应而不与没有凋亡诱导活性的Fas配体发生反应的中和抗体。4.根据权利要求1到3任一项的抗Fas配体抗体，其为以至少107M-1的亲和常数与人Fas配体结合的中和抗体。5.根据权利要求1到4任一项的抗Fas配体抗体，其为包括至少一个含有示于图10或图11中序列鉴定号11、13、15、19、21和23的氨基酸序列的互补决定区(CDRs)的中和抗体。6.一种特异性与选自序列表中序列鉴定号1到8的氨基酸序列的一段肽发生反应的抗Fas配体抗体。7.根据权利要求6的抗Fas配体抗体，其特异性与序列表中序列鉴定号1的肽发生反应，而不与序列表中序列鉴定号2到8的肽发生反应。8.根据权利要求6的抗Fas配体抗体，其特异性与序列表中序列鉴定号6的肽发生反应，而不与序列表中序列鉴号1到5和序列鉴定号7到8的肽发生反应。9.一种属于人源化免疫球蛋白(Ig)的抗Fas配体抗体，包括人受者的框架区(FR)和特异性与人Fas配体结合的非人供者Ig来源的CDR。10.根据权利要求1到8任一项的抗Fas配体抗体，它是一种人源化免疫球蛋白(Ig)，包括人受者的框架区(FR)和特异性与人Fas配体结合的非人供者Ig来源的CDR。11.根据权利要求9或10的抗Fas配体抗体，其为抑制Fas抗原表达细胞的Fas配体诱导的凋亡的中和抗体。12.根据权利要求9到11任一项的抗Fas配体抗体，其中人源化免疫球蛋白重链可变区框架氨基酸序列65％或65％以上等同于但95％或95％以下等同于供者免疫球蛋白重链可变区框架的氨基酸序列。13.根据权利要求9到12任一项的抗Fas配体抗体，其中受者免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列在与供者免疫球蛋白重链可变区氨基酸序列最为同源的人免疫球蛋白重链可变区代表性序列库的5段序列中。14.根据权利要求9到13任一项的抗Fas配体抗体，其中所说的人源化免疫球蛋白包括取代受者免疫球蛋白重链或轻链框架中相应氨基酸的供者免疫球蛋白的氨基酸以及下述的每一个氨基酸(i)与供者免疫球蛋白氨基酸序列中的CDR紧密相邻的已测序的氨基酸，或(ii)含有一个与所说的人源化免疫球蛋白或供者免疫球蛋白的CDR的距离在大约5埃之内的原子。15.一种测定Fas配体的方法，其中一种抗Fas配体抗体被用于人体液中Fas配体的测定。16.一种测定Fas配体的方法，其中根据权利要求1到8任一项的抗Fas配体抗体被用于人体液中Fas配体的测定。17.根据权利要求15或16的测定Fas配体的方法，其中测定出人体液中Fas配体量的增加或减少从而预测、检测或诊断Fas抗原/Fas配体系统的功能障碍，与这种功能障碍有关的疾病，或这种疾病的病理学。18.根据权利要求17的测定方法，其中所述的疾病至少是选自乙型肝炎、丙型肝炎和HIV感染的一种疾病。19.根据权利要求15到17任一项的测定方法，其中所说的测定是通过夹心法进行的。20.根据权利要求15到19任一项的测定方法，其中所说的抗Fas配体抗体是根据权利要求1到8任一项的抗Fas配体抗体。21.根据权利要求15到20任一项的测定方法，其中组合应用根据权利要求1到5任一项的相同类型或不同类型的两种或更多种抗Fas配体的中和抗体。22.根据权利要求15到20任一项的测定方法，其中组合应用根据权利要求6到8任一项的相同类型或不同类型的两种或更多种抗Fas配体抗体。23.根据权利要求15到20任一项的测定方法，其中根据权利要求1到5任一项的一种或多种抗Fas配体抗体与根据权利要求6到8任一项的一种或多种抗Fas配体抗体组合应用。24.根据权利要求21的测定方法，其中登记号为FERMBP-5535的杂交瘤所产生的单克隆抗体F919-9-18和特异性与序列表中序列鉴定号1的肽发生反应的单克隆抗体组合应用。25.能分泌根据权利要求1到14任一项的抗体的杂交瘤或细胞系。26.根据权利要求25的杂交瘤，其中所说的杂交瘤是登记号为FERMBP-5533、FERMBP-5534或FERMBP-5535的杂交瘤。27.一种包含根据权利要求1到14任一项的抗Fas配体抗体的组合物。28.一种治疗伴随、起因于或涉及Fas/Fas配体系统异常或Fas抗原诱导的凋亡异常的全身性或局部性病理状况或疾病的方法，包括给病人使用治疗有效量的能抑制Fas抗原表达细胞发生Fas配体诱导的凋亡的抗Fas配体抗体。29.一种测定人体液中Fas配体量的试剂或试剂盒，它包括根据权利要求1到14任一项的抗Fas配体抗体。30.通过根据权利要求15到21任一项的方法测定人体液中Fas配体量的试剂或试剂盒，它包括抗Fas配体抗体作为必要成分。全文摘要本发明涉及抗Fas配体抗体和利用Fas配体抗体的测定方法。更具体地讲,本发明涉及应用一种抗Fas配体抗体来测定人体液中Fas配体的方法和适合用于这种测定的抗体。本发明也涉及高度抑制Fas配体诱导的凋亡的抗Fas配体抗体。本发明还涉及能分泌这种抗体的杂交瘤或细胞系。本发明的一个目的是提供抗Fas配体抗体和利用这种抗体的测定方法,更具体地说是利用抗Fas配体抗体测定人体液中Fas配体的方法和适合用于这种测定方法的抗体。本发明的另一目的是提供高度,比如50%或更高,抑制Fas配体所诱导的凋亡的抗Fas配体抗体,以及属于人源化抗体的上述抗体。本发明的再一目的是提供能分泌这种抗体的杂交瘤和细胞系。更进一步,本发明也提供包含至少一种本发明的上述抗Fas配体抗体作为不可缺少的成分或活性成分的新型组合物或药剂,以及治疗伴随,起因于或涉及Fas/Fas配体系统异常或通过Fas抗原诱导的凋亡异常的全身性或局部性病理状况或疾病的方法,也涉及给病人注射治疗有效的抗Fas配体抗体以抑制Fas抗原表达细胞发生凋亡。文档编号C07K16/28GK1196733SQ96196690公开日1998年10月21日申请日期1996年7月1日优先权日1995年6月30日发明者白川嘉门,松末朋和,长田重一,M·S·寇,M·巴斯克斯申请人:持田制药株式会社,财团法人大阪生物科学研究所