用于人治疗的重组抗cd4抗体的制作方法

专利名称：用于人治疗的重组抗cd4抗体的制作方法
技术领域：
本申请是U.S.编号08/476,237的部分延续，后者是1995年1月25日提交的U.S.编号08/397,072的部分延续，后者又是1992年7月10日提交的U.S.编号07/912,292的延续，后者又是Newman等1992年3月23日提交的美国专利申请编号07/856,281的部分延续，后者是1991年7月25日提交的美国专利申请编号07/735,064的部分延续，所有这些申请包括图在此引入作为参考。本发明涉及可用于人治疗的CD4特异的重组抗体和制备这种抗体的方法。
背景技术：
CD4是一种主要表达于T淋巴细胞系的细胞包括大多数胸腺细胞和外周T细胞的一个亚类的表面糖蛋白。某些非淋巴样细胞也表达低水平的CD4，虽然这种不同的细胞分布的功能意义还不清楚。在成熟的T细胞上，CD4通过与表达在抗原递呈细胞上的MHC II类分子相互作用而起辅助识别作用。CD4+T细胞主要构成辅助细胞亚类，该亚类在T细胞依赖的针对病毒、细菌、真菌和寄生虫感染的应答中调节T和B细胞的功能。
在自身免疫疾病的致病机理中，特别是当对自身抗原的耐受阻碍时，CD4+T细胞促成炎症应答，导致关节和组织损伤。这些过程通过造血细胞系中炎症细胞的新生成、抗体、炎症细胞因子和调节因子的生成、以及杀伤细胞的活化而加剧。
类风湿性关节炎(RA)是一种滑膜的炎症疾病，它是自身免疫现象的一种表现，能导致关节的侵蚀、变形和损伤。与多数自身免疫疾病一样，RA的病因还不十分清楚。但是，已知RA的特征是在受影响的关节中激活的CD4+T细胞的水平升高。目前对RA还不能治愈。对RA的一线治疗是用来在短期内缓解RA的症状和提高功能能力。目标为潜在疾病的二线和三线免疫抑制剂和甾类如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、泼尼松龙是用于在更严重病情中给药，而且它们或者仅有轻微的效果或者对长期治疗来说有不可接受的毒性。而且，它们对关节损伤都不能提供保护。
除了RA，CD4+细胞还卷入了其它慢性疾病包括牛皮癣、胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮和炎症性肠道疾病。而且，很可能其它自身免疫疾病也涉及到了CD4表达。
如果T细胞参与了自身免疫疾病的发展和维持，免疫抑制就成为一种重要的治疗策略。可用的免疫抑制药物如环胞酶素A已经成功地用于治疗免疫排斥。但是，它们的毒性副作用使它们对于自身免疫疾病的长期治疗来说不可接受。
在临床治疗中，排除包括CD4+亚类在内的整个T细胞群体，已经通过胸导管引流、全淋巴照射、淋巴去除术等方法获得了成功，并在某些病人中导致临床好转。但是，目前的策略是集中于更具选择性的能阻断有害免疫应答而不导致实质器官毒性和其他主要副作用的药物。能够实现这种可能性的一种途径是用单克隆抗体(单抗，mAbs)使疾病介导T细胞选择性去除或失活。针对CD4的单抗代表一种这样的策略。在自身免疫和移植的动物模型中，在预防性或治疗性给药时，抗CD4单抗能抑制或逆转疾病进程。此外，从用抗CD4单抗对RA、牛皮癣、炎症性肠道疾病和系统性血管炎所做的一些临床试验中获得的初步结果已经提供了潜在治疗效果的初步证据。
抗CD4单抗治疗的基本目标是抑制CD4+细胞的自身损伤活性，特别是在处于自身免疫失调的急性期时。最终治疗目标是形成一种状态，即对于维持潜在疾病的损害抗原(或特殊组织)免疫无应答(无反应)或长期耐受而不降低针对机会感染的正常宿主防御。除RA外，CD4单抗对于治疗其它自身免疫疾病如胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮、牛皮癣、炎症性肠道疾病和多发性硬化也有益处。
由于抗CD4单抗作为免疫药剂的潜在重要性，很多公司和研究组都报道了作为潜在治疗试剂的抗CD4单抗。例如，Centocor报道了一种称作Centara的抗CD4单抗，它是一种针对CD4的嵌合鼠单抗。进一步，Johnson & Johnson/Ortho报道了一种抗CD4单抗OKT-4a，它是一种人源化的鼠单抗。更进一步，Burroughs Wellcome报道了一种抗CD4单抗，它是一种针对CD4的人源化大鼠单抗。并且，Sandoz和MedImmune(与Merck合作)都发展了CD4特异的抗CD4鼠-人源化单抗。更进一步，Becton Dickinson、Immunotech和Boehringer Mannheim都发展了抗CD4单抗。
除了抗CD4单抗，多种免疫调节剂和药物已被公开具有治疗RA的潜在应用能力。这样的免疫调节剂和药物包括，如细胞粘附阻断剂、细胞因子受体阻断剂、免疫毒素和T细胞受体拮抗剂。具体例子包括γ干扰素、抗-ICAM-1(一种阻断白细胞迁移、粘附的鼠抗CD54单抗)、Campath-1H(大鼠-人源化抗CDw52单抗)、IL-1受体、cA2(一种TNFα嵌合抗体)、CDP571(抗TNF单抗)、抗IL-2R(人源化-鼠抗CD25单抗)、SDZ CHH380(鼠-人抗CD7单抗)、DAB486 IL-2(IL-2融合毒素，非特异针对CD4和CD8细胞)、Antril(IL-1RA)、抗TCR(靶为T细胞受体亚类的单抗和蛋白质)和XomaZyme-CD5(鼠抗CD5毒素接合物)。
其它具有治疗自身免疫疾病的潜在应用价值的免疫调节剂和免疫抑制剂还包括雷帕霉素(口服免疫抑制剂)、Therafectin、来氟米物(免疫抑制药物前体)、替尼达帕(细胞因子调节剂/辅助抑制剂)、IMM-125和RS-61443(一种口服免疫抑制剂)。
正如所指出的，已经报道了多种具有潜在治疗价值的抗CD4单克隆抗体。就大多数而言，这些抗体包括鼠单抗、嵌合或鼠-人源化抗CD4单抗。
鼠单克隆抗体在人类疾病的诊断和在用作药物治疗急性和慢性人类疾病的临床试验中具有潜在应用价值，这些疾病包括白血病、淋巴瘤、实质瘤(如结肠、乳房、肝的肿瘤)、AIDS和自身免疫疾病。但是，鼠抗体有不利条件，因为它们经常在宿主中引起对鼠单克隆抗体的免疫抗体应答。
鼠/人嵌合抗体也有报道，这些抗体包含亲本鼠抗体的结合特性和与人恒定区相关的效应功能。见，如Cabilly等，美国专利编号4,816,567；Shoemaker等，美国专利编号4,978,775；Beavers等，美国专利编号4,975,369；和Boss等，美国专利编号4,816,397，所有上述专利在此引入作为参考。一般来说，这些嵌合抗体通过从已存在的鼠杂交瘤中提取DNA制备一个基因组基因文库而构建(Nishman等，《癌症研究》，47卷，999页，(1987))。然后在文库中从展示正确的抗体片段重排图谱的重链和轻链两者中筛选可变区基因。然后将克隆的可变区基因连接到一个含有合适的人重链或轻链恒定区基因的克隆盒的表达载体中。然后将嵌合基因在一个选用的细胞系中表达，一般在一个鼠瘤细胞系中表达。
但是，当这样的嵌合抗体在人类治疗中应用时，它们也导致了一些问题。与鼠单克隆抗体相似，人受体可能产生针对嵌合抗体的抗体。这对于用嵌合抗体进行连续治疗的效果是不利的。
作为对传统的嵌合抗体的发展，一些研究者公开了制备人单克隆抗体的方法，这种人单克隆抗体不会导致这样的问题。见，如Erlich等，《临床化学》(Clinical Chemistry)，34卷，1681页，(1988)；Erlich等，《杂交瘤》(Hybridoma)，7卷，385页，(1988)；Erlich等，《杂交瘤》，6卷，151页，(1988)；和Erlich等，《人抗体杂交瘤》(Human AntibodyHybridomas)，1卷，23页(1990)。这些参考文献也假定非人灵长动物抗体如黑猩猩单克隆抗体在人体中应有很好的耐受性，因为它们的结构与人抗体相似。但是，在人中制备抗体有明显的伦理约束。
由于人抗体在恒河猴体内是非免疫原性的(即不诱导抗体应答)，Erlich等也预计灵长动物抗体在人体内没有免疫原性。Erlich等(同上)指出如果一个灵长动物抗体的恒定区与人免疫球蛋白的恒定区相同或至少其结构与人免疫球蛋白的差别并不大于人抗体之间的差别，在人体中检测抗体就没有必要。因此，他们提出黑猩猩抗体在人类治疗中可能是有用的。
作为对通常在人体中具有抗原性的已知嵌合抗体的改进，相关的申请1995年6月7日提交的美国专利编号08/476,237、1995年1月25日提交的编号08/347,072、1992年7月10日提交的07/912,212、1992年3月23日提交的07/856,281和1991年7月25日提交的07/735,064(均在此引入作为参考)介绍了旧世界猴单克隆抗体和通过重组方法由其衍生的嵌合抗体的制备，这种嵌合抗体含有融合到一个克隆的人、黑猩猩或其它猴的恒定区或其它猴框架区中的一个旧世界猴抗体(如狒狒或猕猴)的可变区。这些申请特别介绍了针对人抗原的这种旧世界猴抗体和由其衍生的嵌合抗体的制备以及将这种嵌合重组抗体作为免疫治疗试剂用于人类疾病治疗的应用。
这些申请基于以下令人惊奇的发现不象黑猩猩，进化上遥远的猴(如狒狒或猕猴(包括爪哇猴和恒河猴))不仅与人有足够的差异来在这些猴体内产生针对人抗原甚至针对相对保守的人抗原如CD4和CD54的抗体，而且与人有足够的相似性，使产生的抗体与人抗体的结构相似，因而当这种猴抗体或由其衍生的重组嵌合抗体引入人体时，不会产生宿主抗-抗体应答。
这些申请指明不象某些以前用于人类治疗的抗体(包括已知的嵌合抗体)，这样的嵌合抗体没有严重的弊端，如1)当治疗慢性疾病必须反复给药时，具有免疫原性和诱导产生人抗-抗体(HAA)应答，2)与人抗体相比相对短的半衰期，以及3)缺乏与人细胞和补体的效应功能。
没有这些弊端对于人类治疗来说是明显有利的。例如，在治疗慢性人类疾病包括自身免疫疾病或任何必须用一种抗体延续给药的疾病时，重复抗体治疗的一个主要障碍是宿主对治疗抗体的应答。HAA应答从一个病人到另一个病人通常是不可预测的。而且，这种应答即便不完全是也主要是针对抗体分子的恒定区，而且一旦其产生，它们经常阻碍或降低使用该抗体或其它有相同同种型的抗体的治疗效果。上述参考申请中介绍的重组嵌合抗体将防止这些问题产生，并允许制备有合适特异性和所需效应功能的抗体，以及用于重组抗体制备。
这些重组抗体一般包括一个来自免疫的猴的抗体可变区的、对于抗原结合来说必需的合适部分，以及来自人或黑猩猩的抗体恒定区。因此，这使其保持了猴单克隆抗体的特异性和高亲和性，以及适当选择的人或黑猩猩恒定区的所需效应功能。
几个相关申请的一个特别的例子是被称为CE9.1的CD4特异的猴/人嵌合抗体，该抗体含有一个在爪哇猴中制备的抗CD4单克隆抗体的重链和轻链可变区以及人免疫球蛋白轻链λ恒定区和人免疫球蛋白重链γ1恒定区。该抗体带有一些T细胞排除活性，但与以前的CD4单克隆抗体相比要低。但是，有必要制备带有更低或没有T细胞排除活性的抗体，因为这将有可能增强它们的治疗潜力。
这些申请进一步介绍了制备这种嵌合抗体的优选载体系统，特别是TCAE 5.2和TCAE 6，它们含有下列结构1)四个串联排列的转录盒a)一个人免疫球蛋白轻链恒定区。在TCAE 5.2中是人免疫球蛋白轻链κ恒定区(Kabat氨基酸编号108-214，同种异型Km 3)，而在TCAE 6中是人免疫球蛋白轻链λ恒定区(Kabat氨基酸编号108-215，基因型Oz负，Mcg负，Ke负同种异型)。
b)一个人免疫球蛋白重链恒定区；在两种构建体中人免疫球蛋白重链都是γ/恒定区(Kabat氨基酸编号114-478，同种型Gm1a，Gm12)。
c)DHFR；含有其自身的真核启动子和聚腺苷酸化区域。和d)NEO，也含有其自身的真核启动子和聚腺苷酸化区域。
2)人免疫球蛋白轻链和重链盒含有免疫球蛋白链分泌所需的合成信号序列。
3)人免疫球蛋白轻链和重链盒含有特殊的DNA接头，能允许免疫球蛋白轻链和重链可变区的插入，并维持其翻译阅读框和不改变免疫球蛋白链中常见的氨基酸。
但是，尽管有前面介绍的内容，在本领域中仍然需要发展CD4特异的、在人体中具有较低的抗原性的、能用于治疗(如类风湿性关节炎等自身免疫疾病的治疗)的抗体。特别是需要制备能显示改进特性如长半衰期和/或基本上缺乏或没有排除活性的抗CD4抗体。
发明目的为了这一目标，本发明的一个目的是提供具有改进特性如长半衰期、在人体中低免疫原性和/或降低的或没有T细胞排除活性的CD4特异的新单克隆和嵌合抗体。更具体地，本发明的一个目的是制备抗CD4的嵌合抗体，这种抗体含有一种CD4特异的旧世界猴免疫球蛋白的抗原识别部分和人或猴恒定区序列，特别是人κ或λ轻链恒定区和人γ1或γ4或与γ4同种型相比效应功能有改变和稳定性增强的突变的γ4人重链恒定区序列。
本发明更具体的目的是提供新的单克隆和嵌合抗体，这种抗体含有与猴或人恒定区序列融合的、优选与人κ或λ轻链恒定区序列和人γ1或γ4恒定区序列或与γ4同种型相比效应功能有改变和稳定性增强的突变的γ4人重链恒定区序列融合的、

图1中显示的特殊的猴抗CD4重链可变区序列和图2中显示的猴抗CD4轻链可变区序列。
本发明的另一目的是提供这种改进的嵌合抗CD4抗体的表达DNA序列，和用于表达这种嵌合抗CD4抗体的载体和宿主细胞。这种载体优选包含本文引入作为参考的申请中的参考表达载体。宿主细胞优选是CHO细胞。
本发明的另一目的是提供在治疗或预防CD4相关的失调特别是自身免疫疾病中使用的药物组合物，它包含与一种药学上可接受的载剂组合的、预防或治疗上有效剂量的本发明的改进嵌合抗CD4抗体。
本发明的另一目的是提供用治疗或预防上有效剂量的本发明的新嵌合抗CD4抗体与一种药学上可接受的载剂组合进行给药，来治疗或预防CD4相关的失调特别是自身免疫疾病和其它需要免疫抑制的疾病的方法。
附图简述图1描述了CE9.1的轻链可变区的氨基酸和DNA序列。
图2描述了CE9.1的重链可变区的氨基酸和DNA序列。
图3描述了CE9.1中含有的人λ可变区和恒定区的氨基酸和DNA序列。
图4描述了编码重链可变区和γ4恒定区序列的DNA和氨基酸序列。
图5描述了编码含有E突变的人重链γ4的DNA和氨基酸序列。
图6描述了编码含有P和E突变的人重链γ4的DNA和氨基酸序列。
图7-1、7-2和8显示了本发明中有用的多种前导序列的核酸序列。
图9显示了CE9.1与新鲜的人PMNCs结合的散布图，其中图A的右上象限显示CE9.1和OKT3双染的淋巴细胞，图B的右上象限显示CE9.1和OKT4双染的群体，图C的右上象限显示没有被CD8和CE9.1双染的细胞，图D对照显示用正常和人IgG染色的细胞。
图10a、10b和10c显示CE9.1的Fc受体结合特性，其中测量显示成纤维细胞与a)γIFN诱导的新鲜单核细胞，其中阴性对照用CE9.1的F(ab’)2片段，b)用和不用γIFN诱导的单核细胞，和c)存在sCD4或不存在抗体，结合的CD4+流式细胞计数直方图的集合。
图11显示CE9.1对人混合淋巴细胞反应的抑制，其中a)新鲜的人PBLs用作应答细胞，丝裂霉素C处理的来自无关供体的刺激细胞用来检测一定浓度范围的CE9.1的抑制特性，抑制用IL-2产生中胸苷整合的量来测量。b)使用黑猩猩应答细胞和无关黑猩猩刺激细胞的MLR，其中一种鼠抗人抗体Leu3用作对照。
图12显示了CE9.1的抗体依赖的细胞毒特性，其中SupT-18靶细胞在存在γ干扰素刺激的效应细胞时裂解，其中4D9是一种鼠抗CD4单克隆抗体IgG2a。
图13显示了C1q在存在和缺乏CE9.1时与SupT1-18结合的流式细胞计数的直方图，共记录了10,000个事件，结果以直方图的形式表示，PRO945是来自具有高抗CD4血清滴度的猴的多克隆抗体，阴性对照是在缺乏CE9.1时C1q加抗C1q抗体。
图14显示了CE9.1的补体依赖的细胞毒试验，其中SupT-18细胞在CE9.1和兔补体存在时裂解，其中4D9是一种IgG2a亚类的鼠抗CD4对照，它能固定补体，其中PRO965是来自具有高抗CD4滴度的爪哇猴血清的抗体多克隆混合物。
图15显示在六只黑猩猩中做的高剂量药学研究，其中所表示的是150-300天的时间范围内的外周血CD4、CD8水平，还显示了表明CD4调节细胞数的CD3-CD8曲线；上面一组组1-监测的黑猩猩计数。箭头表示CE9.1剂量。(2)盐水对照组，中间一组组2-接受10mg/kg CE9.1的黑猩猩(2)。当CD4计数回到基线的30％时重复给药。下面一组组3-接受10mg/kg CE9.1的黑猩猩(2)。当CD4计数回到基线70％时重复给药。
图16描述了获取人γ4恒定区的合适PCR引物。
图17描述了CE9γ4PE重链序列。
图18描述了CE9.1、CE9γ4(G4)、CE9γ4E(G4E)和CE9γPE(G4PE)的非还原型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在分子量约为80 KD处发现(halfmer)半分子。
图19含有SPR过程曲线的聚合和解离期的数据。
图20显示CD4单抗结构在初级MLR中的作用。
图21显示IFN-γ诱导的单核细胞系THP-1与CD4+成纤维细胞转染子的粘附。
图22描述了CE9.1、CE9γ4、CE9γ4E和CE9γ4γK的FcR和CD4-介导的粘附。
图23显示了CE9γ4PE、CE9.1和一种小鼠固定单抗对HuCD4的CDC和ADCC结果。
图24显示了在Sprague-Dawley大鼠中给予1mg/kg的CE9γ4E和CE9γ4PE药物后的血浆浓度。
图25描述了用单抗治疗HuCD4转基因小鼠中卵清蛋白特异的抗体应答的效果。
发明简述本发明提供CD4特异的新型单克隆嵌合抗体，这种抗体含有与所需的猴或人恒定区序列融合的旧世界猴抗CD4单克隆抗体的可变区的抗原结合部分，优选与人γ1、γ4或一个突变的γ4人重链恒定区和人κ或λ轻链恒定区序列融合。这些抗体显示了与传统的抗CD4单克隆抗体相比改进的特性，如对CD4的高亲和性和在人体中有很少或没有免疫原性。γ4变体显示降低的或缺乏效应功能如Fc受体结合活性或补体固定活性，并有很少或没有T细胞排除活性。
获取CD4特异的旧世界猴单克隆抗体和产生CD4特异的旧世界猴单克隆抗体的克隆的方法，可在前面引用的相关专利申请中找到，上述专利申请在此引入作为参考。
一般来说，这包括在一定条件下用人CD4抗原免疫旧世界猴使其产生抗CD4抗体；使负责产生抗CD4抗体的猴细胞永生化，如通过杂交瘤融合、用Herpes papio病毒转化、单个B细胞克隆(也称作“瞬时永生化”)，和制备重组免疫球蛋白的文库。在优选实施方案中，此方法包括从猴的外周血淋巴细胞、脾脏、骨髓或淋巴结中选择一个B细胞；选择一个能产生合适抗体的核心；从永生化细胞系中分离编码该抗体的免疫球蛋白基因；并在一个生产细胞系中(即能产生足够用于人类治疗的抗体的细胞系)表达该基因。正如前面参考申请中定义的，旧世界猴包括狒狒和猕猴(包括恒河猴和爪哇猴)。
正如前面讨论的，在优选的实施方案中，本发明的嵌合抗体将包含与人恒定区融合的、图1和图2中所示的旧世界猴抗CD4抗体的重链可变区和轻链可变区序列。获取这些特异的重链和轻链可变区序列的方法在1990年6月7日提交的美国专利编号08/476,237和1995年1月25日提交的08/397,072以及1992年7月10日提交的07/912,292中有详细的介绍，上述美国专利在此全文引入作为参考。这些申请进一步公开了这些序列的全部核酸和氨基酸序列。
这些重链和轻链可变区序列可与任何所需的人恒定区融合。特别的选择会影响所产生的嵌合抗体的效应功能。人重链恒定区优选包括γ1、γ4或一种在此被称为γ4E的突变γ4恒定区或一种在此被称为γ4PE的突变γ4恒定区。选择γ4是有利的，因为已发现它能导致嵌合抗体缺乏或基本上缺乏T细胞排除活性(相对于γ1 80-100％)。人们相信它是这样，因为γ4恒定区不能结合补体。恒定区还可以进行突变来增强所产生的嵌合抗体的特性，如稳定性和/或消除排除活性。特别的是，上文介绍的γ4区的P和E修饰是γ4在铰链区的修饰，能提供活性增强的稳定性和消除排除活性。而且，预计其它修饰也能提供具有增强特性的嵌合抗体。
本发明的抗CD4嵌合抗体中含有的人轻链恒定区优选是人κ和λ轻链恒定区，更优选是人λ轻链恒定区。编码人γ1、γ4、κ和λ恒定区的氨基酸和DNA序列在本领域中是众所周知的。而且人γ4和E和PE突变体和λ恒定区序列的氨基酸和核酸序列可在图4-6和图3中分别找到。
本发明的实施例包括一个称为CE9.1的特异性嵌合抗CD4单克隆抗体，它包含与人IgG1的恒定区组合的、获自用人sCD4免疫的恒河猴的抗原结合区域(显示在图1和2中)，本发明的实施例还包括由CE9.1衍生的单克隆嵌合抗体，如CE9γ4、CE9γ4λK和CE9γ4E、CE9γ4PE，这些抗体具有与CE9.1相同的抗原结合区域，但已被用一个人IgG4 Fc结合区框架进行了基因工程改变。单克隆抗体CE9γ4E在抗体的铰链区附近含有一个亮氨酸到谷氨酸的突变(L236E)(E修饰)。单克隆抗体CE9γ4PE含有相同的亮氨酸到谷氨酸的突变并加上一个丝氨酸到脯氨酸的突变(S229P)(“E”和“P”修饰)。抗体CE9γ4Kλ与CE9γ4的不同在于其轻链恒定区由一个人κ亚型替换成了λ亚型。
进行这些恒定区转换和突变是因为，已知IgG抗体的生物应答依赖于其羧基端区域即它的同种型的组成。这样，通过用蛋白质工程技术改变抗体的同种型，就有可能修饰一种lgG抗体，更具体地说是本发明的嵌合抗CD4单克隆抗体的生物应答。
这种工程策略的期望结果是抗体Fc部分的同种型转换不会减少CD4抗原与Fab区域结合的亲和性。但是，这在开始时是不知道的。有可能恒定区的改变或其修饰对CD4结合有负面影响。因此，对所得到的抗体进行分析，以确定修饰对抗体特性特别是CD4抗原结合的影响。为测定恒定区转换对抗原结合的影响，可以采用已知的分析方法。特别地，用Scatchard分析和表面胞质基因共振(surface plasmon resonance，SPR)对CD4与CE9.1、CE9γ4、CE9γ4λκ、CE9γ4E和CE9γ4PE之间的相互作用进行了研究。这些分析的结果证明CD4与每个测试抗体的结合是相同的。用SPR发现在25℃时CD4与这些抗体的平衡解离常数都大约是1.0纳摩尔。测量结果进一步证明
1)CD4与这些抗体的结合为双位点独立对等结合模式；和2)抗原结合区域的功能结合特性独立于对抗体Fc部分的结构修饰，包括γ1、γ4或突变的γ4同种型。因此本发明提供了下面的证据IgG1与IgG4之间的同种型转换是制备不减少抗原结合亲和性的工程抗体，更具体地说是抗CD4抗体的有用策略。
而且，正如前面所介绍的，我们还发现用γ4恒定区取代γ1恒定区基本上降低了Fc受体结合、补体固定和T细胞排除活性，并进一步发现E和P修饰分别进一步消除了Fc受体结合活性和T细胞排除活性且能提供增强的抗体稳定性。因此，有理由假设，按照本发明制备的其它嵌合抗体(被工程改造为含有人γ4恒定区或其突变形式)可用改变的Fc效应功能进行选择，即基本上缺乏或完全没有T细胞排除活性，和/或显示增强的稳定性。分析T细胞排除活性、Fc效应功能和抗体稳定性的方法在本领域是众所周知的。
因此，本发明提供特异性的重组抗体，这种抗体是针对人CD4抗原的灵长动物/人嵌合单克隆抗体，它显示改进的特性，如低T细胞排除活性和更高的稳定性。如果具有这些特性，这些重组抗体作为免疫调节剂具有特别的用途，并且对于治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎、牛皮藓、系统性红斑狼疮(SLE)以及非自身免疫病症如移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥、哮喘和HIV尤其有用。本发明的抗体还具有在遗传治疗中作为佐剂的用途。特别地，本发明的抗体可以在一种载体(含有治疗性的DNA)给药前、同时或之后进行给药，以防止或降低针对该载体的体液应答。这些疾病是CD4相关病症的例子。
正如在实施例中更详细介绍的，CE9.1重组抗体是通过将抗原结合的Fv可变区域从爪哇猴移植到人恒定区如IgG1恒定区来制备的。更特别地，CE9.1抗体含有一个人γ1区域和λ恒定区。CE9γ4、CE9γ4λK、CE9γ4E和CE9γ4PE含有γ4恒定区或其一种突变形式以及λ或κ恒定区。所产生的重组抗体的序列与人免疫球蛋白序列没有差别。作为结果，这些抗体以及其它用类似方法制备的CD4抗体在对人进行体内给药时，应显示降低的或没有免疫原性和与针对CD4的相似鼠单克隆抗体或鼠-人嵌合抗体相比较低的血清清除率。
CE9.1抗体与人CD4的1区结合，但不与猕猴CD4结合，该区是一个参与同抗原递呈细胞上MHC II类分子相互作用的区域。实验还证明其它的抗体实例含有与CE9.1相同的抗原结合特性。
体内和体外都发现CE9.1具有潜在的免疫调节活性。有了这些特性，即与其它已知的来源于鼠或啮齿动物的抗人CD4单抗相比具有低免疫原性、低血清清除率和潜在的免疫调节作用，这种抗体以及其它这里介绍的抗体应特别适用于需要免疫抑制的疾病的长期治疗，例如自身免疫失调和慢性炎症疾病如类风湿性关节炎。但是我们期望这些抗体能用于治疗多种其它的疾病，这些疾病的例子有桥本氏甲状腺肿、原发性黏液性水肿、甲状腺毒肿/Graves病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性心炎、Addison’s病、早发性绝经、I型糖尿病、Good pasture’s综合症、重症肌无力、多发性硬化、男性不育、寻常天疱疮、类疱疮、交感性眼炎、晶状体(phacogenic)葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、自发性血小板紫癜、自发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎(HBs Ag阴性)、原因不明的肝硬化、炎症性肠道疾病综合症、Siogren’s综合症、牛皮癣、类风湿性关节炎、皮肤肌炎、硬皮病、混合组织接触疾病、盘形红斑狼疮、系统性血管炎和系统性红斑狼疮(SLE)。
正如上面讨论的，类风湿性关节炎(RA)是一种滑膜的炎症疾病，它包含一种自身免疫现象的症状，会导致关节侵蚀、变形和坏死，与大多数自身免疫疾病的情况相同，RA的病因还不十分清楚，但其特征是受影响的关节中激活的CD4+T淋巴细胞的水平提高。目前，还不能治愈RA，对这种衰弱疾病的治疗仅设计用来提供在短期内缓解症状和提高功能能力。而且，针对潜在疾病的二线和三线免疫抑制剂和甾类化合物如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和泼尼松龙仅用于更严重的病情，并且在用于长期治疗时，通常仅有轻微的效果或显示不可接受的毒性。相反，预计本发明的抗体将适合于延续的和长期给药，只要这些抗体与其它已知的来源于鼠或啮齿类的抗人CD4单抗相比，能显示较低的免疫原性、较长的半衰期和潜在的免疫调节活性。
基本上，本申请中介绍的重组抗CD4单克隆抗体例子或其它按照本发明制备的抗体以及上面参考申请(在此引入作为参考)中介绍的抗体通过阻止或改变CD4+细胞的损害活性将有可能介导治疗活性，特别是在自身免疫失调如类风湿性关节炎的急性期时。这样，用根据本发明的抗体进行给药将导致这样一种状态，即对维持潜在疾病的损害抗原(或特殊组织)的免疫无应答(无反应)或长期耐受，而不降低对抗机会感染的正常宿主防御。除了RA，CD4单克隆抗体应在与上述类似的疾病的治疗中是有益的，并能特别用于治疗胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮、肝硬化、炎症性肠道疾病、多发性硬化、以及其它自身免疫疾病。它们还可用于治疗非自身免疫疾病如白血病、淋巴瘤、移植物抗宿主病、移植排斥、哮喘和HIV。
根据本发明制备的重组抗CD4单克隆抗体通过下面一种或多种机制来介导所需的体内治疗效果i)阻断CD4与MHC II类分子之间的相互作用；ii)下调细胞表面CD4；iii)引起无反应和/或细胞凋亡；iv)CD4细胞排除；或v)诱导对自身抗原耐受。
虽然CD4+细胞的瞬时排除可导致免疫抑制，并有可能导致另外的超活性免疫系统正常化，但抗CD4抗体显示其体内效应的主要机制并不须依赖于T细胞排除。不管怎样，据信抗体与CD4分子结合能通过与T细胞受体结合的抗原引起抗原特异的T细胞无反应或耐受而防止辅助T细胞活化。例如含有一个人γ1区的CE9.1抗体能显示基本的免疫抑制活性。但是它在黑猩猩中仅部分排除T细胞。而且，在人体中的结果表明，与其它目前用于临床试验的单克隆抗体相比，这种抗体导致基本上很少的细胞排除。
同时，在体内实验模型中，通过在移植期给予非排除性的抗CD4抗体已经诱导出了异体移植特异性耐受。耐受状态的维持并不需要一种排除性抗CD4抗体，但的确表现出依赖于抗原的持续存在。基于这些发现，我们期望本发明的重组抗体或其它根据本发明制备的重组抗CD4抗体能适用于自身免疫疾病的治疗。采用抗CD4抗体的简要治疗程序将干扰针对自身抗原的辅助T细胞应答，从而在缺乏普遍免疫抑制的情况下引起长期的临床改善。
以本申请包含的内容为基础，应用众所周知的技术，本领域的技术人员能容易地确定这里公开的重组抗CD4抗体实例以及其它基本上根据本发明制备的抗体的一种安全、可承受的和有效的治疗方案。
正如所指出的，CE9.1是一种抗CD4单克隆抗体，它是一种猕猴/人嵌合抗体，属于IgG1分子，表达于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，与人免疫球蛋白框架区有91％-92％的同源性。因此，这种分子在人体中应表现出降低的免疫原性或甚至没有免疫原性，并应显示与鼠单克隆抗体或鼠/人嵌合抗体相比较长的血清半衰期。这种抗体还应显示与人组织有限的交叉反应。例如，在实验中没有发现这种抗体与非淋巴样组织结合的证据。与预期的一样，这种抗体与外周血和其它器官中的一些但不是全部的淋巴样细胞结合。还发现这种抗体与黑猩猩CD4+T细胞反应，但不与恒河猴、爪哇猴或豚尾猕猴、狒狒、大鼠、小鼠或兔的CD4+T细胞反应。因此，基于这种反应特性，黑猩猩组成了用来证明这种抗体体内药学影响即其作为有效免疫抑制剂的功能能力的相关种。
CE9.1抗体在黑猩猩中显示可逆转的T细胞排除活性。而且，由于其预期在人血清中有较长的半衰期和降低的潜在有害免疫作用这样一些优点，它可能优于目前的鼠和鼠/嵌合抗CD4单克隆抗体。而且，如果存在人恒定区序列，预期本发明的抗体在人体中给药时将保持人抗体的正常效应功能。事实上，CE9.1抗体和其它参考抗体的效应功能已在几个不同的试验中进行了评价。CE9.1抗体被发现在混合淋巴细胞反应(MLR)中显示抑制活性，显示微弱的C1q结合，但不显示补体介导的细胞毒活性。还发现它显示抗体依赖的补体细胞毒活性(ADDC)和与FcR结合。还在黑猩猩体内对CE9.1抗体进行了评价，发现给药导致了CD4细胞的部分排除和CD4受体的调节。
用不同剂量的CE9.1抗体对黑猩猩进行了给药。更具体地说，在一只黑猩猩中间隔7-14天对剂量为0.1、0.3、1、5和10毫克/每公斤的效果进行了研究。没有观察到毒性的临床证据。剂量为毫克/公斤或更大在给药24小时后导致循环CD4+细胞减少了80-95％。在给予1毫克/公斤的剂量7天后，没有观察到明显的CD4+细胞减少。在给予5毫克/公斤的剂量7天后，循环CD4+的数目回复到基线的约40％，并在14天后回复到基线的约60％。在给予10毫克/公斤的剂量后，在处理后第7天循环CD4+细胞的数目没有回复，在给药42天后，仅回复到基线的40％。其它病理学参数没有发现改变。
CE9.1抗体在人体中也进行了检测。例如，CE9.1抗体的活性已在类风湿性关节炎病人中进行的单剂量逐渐增加的1期试验中进行了评价。这些结果非常有希望。具体地说，大约一半接受给药的病人在他们的关节触痛点显示至少30％的改善，有害事件轮廓非常良性。而且，正如上文所讨论的，尽管最初假定CE9.1是排除性的，但事实上这种抗体在单次给药时仅显示部分和短暂的排除作用。这种抗体的部分非排除本性将是有益的，因为在许多动物研究中已有报道，CD4+T细胞排除对于CD4单克隆抗体的效果来说明显不是必需的。(见Carteron等，“在用针对L3 T4的单克隆抗体给药时，免疫耐受的诱导不依赖于L3T4+细胞”，《基础免疫学杂志》(Underlying Journal of Immunology)，140卷，713-716页(1988)；Carteron等，“F(ab’)2抗CD4和完整的抗CD4单克隆抗体在Lupus-ProneNZB/NZW小鼠的肾中抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞和BT T细胞的积聚”，《临床免疫学和免疫病理学》(Clinical Immunology Immunopathology)，56卷，373-383页，(1990)。)。这样这种抗体可以像一种典型的受体拮抗剂起作用，通过i)阻断CD4与其对应的受体MHC II之间的相互作用；或ii)引起细胞表面的CD4的调节。在这些情况下，需要CD4受体参与的CD4+T细胞应答将被减弱或阻断。本发明的CE9.1抗体在人体中明显显示很少的排除活性这一事实是有利的，因为这可提高安全性，可以避免必须频繁地监测CD4+细胞的数目，并且还可以提高效果。
CE9.1被设计用来在体内通过Fc受体和补体结合机制减少CD4细胞的数目。在黑猩猩中所做的研究表明，CE9.1导致CD4细胞的部分排除，并且初步的结果表明与其它已知的CD4单抗相比，它在人体中的细胞排除降低了很多。然而，仍然需要制备没有排除活性的抗体。
使用“非排除性”CD4单抗应是进步的，因为i)CD4细胞排除作用对于CD4单抗的作用来说是不需要的；ii)缺乏CD4细胞排除将增强其安全性；iii)较高的安全性能使单抗在疾病过程的较早期即可使用；iv)缺乏CD4细胞排除将增进效果；和v)缺乏CD4细胞排除将避免或减少频繁监测CD4细胞数目的必要性，因而增加了便利性和降低整个治疗的费用。
这也被下列事实支持，在许多动物模型中已经显示，CD4+T细胞排除对于CD4单抗的作用来说是不需要的。因此，一种非排除型CD4单抗可以像一种典型的受体拮抗剂起作用，通过i)阻断CD4与其对应的受体MHC II之间的相互作用，ii)引起CD4从细胞表面调节，或
iii)引起T细胞无反应和/或细胞凋亡。
这样，需要CD4受体参与的CD4+T细胞应答将被改变或阻断。
一般来说，由强或高亲和性的抗原驱动的T细胞应答看起来不依赖于CD4-辅助-受体功能，因而不会被CD4单抗有效阻断。相反地，针对弱抗原(例如自身抗原)的T细胞应答需要CD4-辅助-受体功能，因而能被CD4单抗抑制。在正常情况下，强自身反应T细胞(有针对自身抗原的高亲和性TCRs的T细胞)在胸腺中通过“克隆排除”而被去除，从而不会出现在外周中。相反，驱动自身免疫应答的T细胞据信是已经避开了正常外周耐受机制的弱自身反应细胞。这样的细胞在产生完全的应答时依赖于辅助受体如CD4的参与。因此，阻断辅助受体将剥夺这些T细胞的重要的辅助信号功能，这将导致部分活化或无反应性。而且正如上面指出的，还进一步需要制备具有更高稳定性(长的体内半衰期)的CD4特异的嵌合抗体。
为实现这一目的，合成了各种含有γ4人恒定区的嵌合抗体。选择这一区域是因为它明显不与人补体或FCγ1受体结合。因此，假定含有这一恒定区的嵌合抗体将缺乏或基本上缺乏T细胞排除活性。还制备了几种含有已知的γ4恒定区修饰的嵌合抗体。特别地，有几种含有Duncan等，《自然》，332卷，563-564页，(1988)和Winter等，WO88/07089(1988)，介绍的“E”修饰，这种修饰已被公开能降低补体和FCγ1受体结合活性。这一修饰包含236(Kabat编号248)位的亮氨酸至谷氨酸的改变来去除任何残留的Fc受体结合活性。另外，几种嵌合抗体含有Angal等，《分子免疫学》(Mol.Immunol.)，30卷，105-8，(1993)公开的“P”修饰。包含229(Kabat编号241)位的丝氨酸至脯氨酸的改变的这一修饰，通过使重链间的二硫键稳定来增强其稳定性(血清半衰期)，并已有报道相对于缺乏这种修饰的嵌合IgG4抗体，它能改善组织分布。
更具体地说，发展CE9γ4的原理是去除补体固定活性和降低FcR结合活性。这种抗体与CE9.1的差别在于，它含有人γ4恒定区(不是γ1)。但是，虽然需要这一点，结果却不是常规的或可以预期的。事实上，发明人发现，含有未修饰的γ9的嵌合抗体与γ2抗体具有相同的Fc受体结合活性。相反，制备CE9γ4λK的原理是增加γ4结构的产生。这种抗体与CE9.1的差别在于，它含有人κ轻链而不是λ。用一种测量抗体与刺激的单核细胞和单核细胞系结合的Fc受体结合分析来体外评价CE9γ4，结果显示CE9γ4仍然含有显著的Fc受体结合活性。而且，在这个分析系统中，CE9γ4的结合与CE9.1(γ1)没有区别。因此，制备CE9γE的原理是在含有未修饰γ4的嵌合抗体的基础上完全去除任何残留的FcR结合活性。CE9γ4E含有在一个位点有修饰(E修饰)的γ4恒定区。最后，制备CE9γ4PE的原理是在含有未修饰的γ4或在一个位点含有突变(E修饰)的嵌合抗体的基础上增加稳定性。这种抗体含有在两个位点有修饰(P和E修饰)的γ4恒定区。
正如所讨论的，人γ4恒定区被选择用作同种型来去除效应功能，即与人Fcγ受体或C1q的反应性和缺乏体内CD4+细胞排除活性。这四种侯选抗体在CHO细胞中进行选择和表达。
在这些侯选单克隆抗体中有两种即CE9γ4E和CE9γ4PE被选来做更深入的研究。正如所指出的，这两种抗体都在CH2区含有一个谷氨酸取代来消除残留的与γ4恒定区相关的FcR结合活性。此外，CE9γ4PE在铰链区含有一个脯氨酸取代，目的是增加重链二硫键相互作用的稳定性。
这些抗体被发现在对CD4的亲和性、分子量、热变性的稳定性、MLR的抑制、缺乏FcR结合和缺乏ADCC和CDC活性方面没有区别。因此这两种抗体都可显示没有FcR和补体效应功能的高亲和性CD4单抗的体外标准。
CE9.1和CE9γ4PE的特性在表1中进行了比较。我们的目的是赋予嵌合抗体降低的Fc受体结合活性，使其与Fc受体的结合低于含有1个γ1的嵌合抗体，优选与之比较至少有30至80％的降低，更优选至少有50至80％的降低，最优选的是完全去除。但是未修饰的γ4嵌合抗体的结果证明，所需的结果不是可以预期的。
表1CE9.1和CE9γ4PE的效应功能的比较活性 CE9.1 CE9γ4PE体外MLR有 有C1q结合弱 无CDC无 无ADCC 有 无FcR结合有 无体内(黑猩猩)CD4细胞排除 部分 无CD4受体调节有 有体内(HuCD4+转基因小鼠)CD4细胞排除 部分 无CD4受体调节 有 有ADCC＝抗体依赖的细胞毒CDC补体介导的细胞毒FcR Fc受体MLR混合淋巴细胞反应因此，这些结果证明可根据本发明制备能结合CD4的嵌合抗体，通过选择特殊的恒定区序列从而缺乏某些效应功能。
在将所举的嵌合抗CD4抗体的例子或其它根据本发明制备的嵌合抗体作为免疫抑制剂或CD4调节剂用于治疗自身免疫失调包括如类风湿性关节炎时，这种抗体可以单独给药或与其它适合治疗特定疾病的化合物组合给药。例如，本发明的抗体可与其它蛋白质如针对TNFα的单克隆抗体可溶性受体蛋白、针对IL2受体的单克隆抗体、拮抗CD40/gp39相互作用的单克隆抗体和受体融合蛋白、和拮抗B7/CD28相互作用的单克隆抗体中的CTLA 4-Ig组合给药。而且，在治疗类风湿性关节炎时，本发明的抗体还可与其它药剂如雷帕霉素、来氟米物、替尼达帕、RS-61433(Mycophenolate Mofetil)、Surenyl(透明质酸钠)、抗-TCR(Vβ17)多肽疫苗、Anerva X(抗MHC疫苗)、和体外蛋白A免疫吸附剂或其组合物组合给药。此外，本发明的抗体还可与根据本发明制备的或本领域众所周知的其它人CD4特异的抗体组合给药。这可导致协作效果，例如如果这些抗体与CD4蛋白的不同表位结合。
下面的实施例用来进一步介绍本发明。
实施例1CD4特异的猴/人嵌合抗体的克隆和表达下面是本发明的方法和抗体的一个特例。
猴永生化B细胞系的制备使用一种标准佐剂，用150-300ug可溶性CD4(sCD4)或取自CD4阳性细胞系SupT1的细胞膜(1×108细胞)对一只成年爪哇猴(White Sands新墨西哥灵长动物中心)经肌肉进行多点免疫。每隔2-3周重复免疫共进行6次。在一只大腿的腹股沟区域注射100ug的sCD4对猴进行加强免疫，一周后从同一大腿手术取出引流(draining)淋巴结。用剪切组织并用无菌DMEM培养基清洗的方法从淋巴结中分离淋巴细胞。将细胞悬液通过一个尼龙网筛并用1000×g离心10分钟收集。
在Tris-氯化铵缓冲液(16mM，pH7.5)中悬浮约1×108淋巴细胞，并在37℃保温5分钟以裂解红细胞。离心收集淋巴细胞并重新悬浮于L-亮氨酸甲酯(LME)中，在37℃保温45分钟。LME处理的细胞通过一个尼龙网筛过滤并离心。加入1ml胎牛血清，在无血清RPMI中悬浮细胞并洗涤两次。将细胞计数并与等量的K6H6/B5异种杂交瘤混入一个单独的50ml锥型离心管中，该异种杂交瘤细胞已预先在无血清培养基中洗涤两次。将细胞小心悬浮于1ml50％的PEG(聚乙二醇)中，在1分钟时间内缓慢加入并轻轻搅拌。然后在5分钟内加入20ml无血清培养基将细胞重新悬浮，小心混合以稀释PEG。用无血清培养基洗涤两次后将细胞按5×105/0.1ml的浓度重新悬浮于含有20％胎牛血清和庆大霉素的RPMI培养基中，按每孔0.1ml加于96孔微量组织培养板。在每孔中加入等体积的HAT培养基(0.1ml)，在筛选前让杂合子生长14-17天。
筛选用干产生抗CD4抗体的融合细胞杂合子确定抗CD4特异性的试验如下按每孔100ng的浓度用重组sCD4包被ELISA板，用含有1％牛血清白蛋白的PBS封闭。从每孔中取出50ul等份的杂交瘤上清，与sCD4包被的板一起温育60分钟。用与125I标记的羊抗人或羊抗猴Ig一起温育60分钟来检测结合。用蒸馏水洗涤四次后，用伽马计数器对小孔进行计数。阳性孔进行重复试验，并将这些孔的杂交瘤细胞亚克隆三次，第一次每孔5个细胞，后两次每孔1个细胞。在此阶段筛选能与细胞表面CD4结合的抗sCD4阳性克隆。这可通过抑制一种名为1F3的抗CD4鼠单抗与CD4阳性细胞系supT1结合来进行。简单地说即通过在96孔板中将不同量的猴抗CD4和10ug的125I标记的1F3与3×105的supT1细胞/孔共温育来进行。在室温(约20-25℃)温育1小时后，将细胞真空转移至玻璃纤维滤膜上，经过用PBS充分洗涤后，用伽马计数器对滤膜计数来测定猴杂交瘤上清对1F3与supT1细胞结合的抑制。
选择到了一个候选克隆，该克隆能产生对1F3显示强烈抑制作用的抗体。使用人同种型鉴定试剂对该克隆进行同种型鉴定，发现该克隆为含有一条λ轻链的IgG2。将此细胞系培养至大量以克隆其免疫球蛋白基因。
从猴永生化B细胞系中克隆重链和轻链可变区基因使用异硫氰酸胍法从1×107猴永生化B细胞中提取总RNA。采用oligo-dT寡核苷酸引物和逆转录酶用十分之一的总RNA来制备单链cDNA。用十分之一量的单链cDNA进行PCR反应。共进行六个PCR反应，每个包含六种含有一个Sal I限制酶切位点的5’VH家族特异的寡核苷酸引物中的一种和含有一个Nhe I位点的IgG3’恒定区寡核苷酸，两种引物均示于图7-1。同样地，进行五个PCR反应，使用五种含有一个Bgl II位点的λ前导序列寡核苷酸引物中的一种和含有一个Avr II位点的3’λ恒定区引物。反应条件如上所述。每个PCR反应重复三次。每个重链和轻链扩增反应的产物走1.2％琼脂糖凝胶。VH4重链引物(5’-ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT3’)和λ引物(5’-ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC3’)在琼脂糖凝胶电泳中获得强带。这些反应的产物被用于克隆到载体TCAE 6中，该载体含有人IgG1和人λ恒定区序列。
将两种可变区基因克隆到表达载体TCAE6中是按顺序进行的。首先，重链PCR产物和载体TCAE6用限制酶Sal I和Nhe I消化，产物用酚/氯仿抽提，并过SEPHADEX G-25自旋柱。PCR产物在有T4连接酶存在下与切割后的载体在14℃连接过夜。大约500ng总量的DNA在10ul体积中进行连接，插入片断/载体的分子比为10∶1。连接物用于转化XL-1 Blue感受态细胞(Stratagene)，并将转化细胞铺于含有50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板。挑取氨苄青霉素抗性菌的菌落，并培养5ml微培养物。用标准的碱裂解法从这些培养物中分别提取质粒DNA，用限制酶Sal I和Nhe I切割，酶切产物走1.2％琼脂糖凝胶。带有约450bp插入片断的质粒用作随后克隆轻链可变区的模板。轻链PCR反应的产物与含有重链插入片断的质粒用限制酶Bgl II和Avr II切割，然后连接在一起。质粒微培养物用Bgl II和AvrII切割进行筛选。具有约400-450 bp插入片断的消化产物被记录为阳性。大量培养含有Sal I/Nhe I和Bgl II/Avr II两种插入片断的质粒用于DNA测序。
串联嵌合抗体表达载体TCAE5.2和TCAE6都衍生自载体CLDN，该载体本身是载体RLDN10b(《科学》(Science)253卷，77-79页，(1991))的一个衍生物。RLDN10b又是表达载体TND(《DNA》第7卷，651-661页，(1988))的一个衍生物。
RLDN10b与载体TND的不同如下二氢叶酸还原酶(DHFR)转录盒(启动子、cDNA、和聚腺苷酸化区域)被置于组织纤溶酶激活物盒(t-PA表达盒)和新霉素磷酸转移酶(NEO)盒之间，这样所有三个盒串联式排列并且转录方向相同。此外，CLDN中DHFR基因的启动子被鼠β球蛋白主要启动子(《分子细胞生物学》(Mol.Cell Biol.)，第3卷，1246-54页(1983))取代，t-PA cDNA被一个多接头取代。所有这三个真核转录盒(表达，DHFR，NEO)都可用限制内切酶Not I消化的方法从细菌质粒DNA(pUC9衍生物)中分离。
CLDN与RLDN10b不同，因为多接头前面的Rous LTR已被人巨细胞病毒即时早期基因启动子增强子取代(《细胞》(Cell)，41卷，521页，(1985))。
表达载体TCAE 5.2和TCAE 6与CLDN的不同之处在于1)它们含有四个(而不是三个)串联排列的转录盒a)一个经聚合酶链反应扩增cDNA获得的人免疫球蛋白轻链恒定区。在TCAE 5.2中是人免疫球蛋白轻链κ恒定区(Kabat氨基酸编号108-214，同种异型Km3)，而在TCAE 6中是人免疫球蛋白轻链λ恒定区(Kabat氨基酸编号108-215，基因型Oz负，Mcg负，Ke负同种异型)。
b)一个人免疫球蛋白重链恒定区；在两种构建体中人免疫球蛋白重链都是γ1恒定区(Kabat氨基酸编号114-478，同种异型Gm1a，gm1z)，它是经聚合酶链反应扩增cDNA获得的。
c)DHFR，含有其自身的真核启动子和聚腺苷酸化区域。
d)NEO，也含有其自身的真核启动子和聚腺苷酸化区域。
2)人免疫球蛋白轻链和重链盒含有免疫球蛋白链分泌所需的合成信号序列。
3)人免疫球蛋白轻链和重链盒含有特殊的DNA接头，能允许免疫球蛋白轻链和重链可变区的插入，维持其翻译阅读框并且不改变免疫球蛋白链中常见的氨基酸。上述改变合并起来就导致了载体TCAE5.2和TCAE 6的构建。从抗CD4异种杂交瘤细胞系E9.1将免疫球蛋白重链和轻链可变区基因克隆到TCAE6中就产生了已在ATCC保藏的构建体，这种已经保藏并编码含有爪哇猴免疫球蛋白重链可变区和爪哇猴免疫球蛋白轻链可变区(其序列分别示于图1和图2)的CE9.1抗体的构建体，克隆自抗CD4杂交瘤细胞系E9.1。重链恒定区属于人源的γ1同种型和Gm1a，Gm1z同种异型。λ轻链恒定区也是人源的，属于Oz负，mcg负基因型，和Ke负同种异型。这些免疫球蛋白基因克隆到哺乳动物表达载体TCAE6(已在上文引用的申请中介绍，在此引入作为参考)中，当该载体电转化到哺乳动物细胞系CHO时，就产生一种人/猴抗CD4嵌合抗体。这里介绍的DNA构建体已经用于转化细菌菌株XL-1 Blue，在抗生素氨苄青霉素中进行了选择，并已经以在含有15％甘油的无菌LB培养基中的细菌细胞悬液形式进行了保藏。
DNA测序从100ml培养物中制备质粒DNA。将其(1体积)用2.5M氯化钠和20％聚乙二醇的混合物(6体积)在冰上沉淀15分钟进一步纯化。10,000×g离心20分钟后，沉淀用70％乙醇洗涤，再次离心并在真空离心蒸发浓缩器(Savant)中干燥。DNA沉淀用去离子水重新悬浮，并使其浓度为150-250ug/ml。测序用5ug双链DNA按照Sanger的技术进行。所使用的测序引物与表达载体中轻链或重链插入片断上游和下游的序列同源。插入片断由5’至3’和3’至5’两个方向进行测序。将均产生于单独的PCR反应的两个抗CD4轻链克隆和两个抗CD4重链克隆并列测序，以确定在PCR反应中是否引入了任何核苷酸改变。发现所选择的两条重链和两条轻链克隆在其全长范围内都是相同的，这证明在扩增过程中没有引入错误。抗CD4重链和轻链的序列显示于图1和图2。
猴/人抗CD4嵌合抗体的表达表达载体TCAE 5.2和TCAE 6不仅能用于细胞系Sp2/0和CHO中的稳定整合表达，而且由于其含有SV40起点，它们也可以在细胞系COS中的瞬时表达。COS细胞表达按下述方法进行COS细胞在转染前一天接种，使其在第二天达到50-70％汇合。移去培养基，细胞用转染缓冲液(TB-140mM NaCl，25mM Tris，5mM KCl，0.5mM Na2HPO4，1mM MgCl2，1mM CaCl2)洗涤两次。在每皿中将30ug氯化铯纯化的含有抗CD4猴/人嵌合免疫球蛋白重链和轻链的TCAE 6质粒与3ml DEAE葡聚糖(1mg/ml溶于TB中)混合。将DNA与细胞一起在37℃温育1小时。移去DNA溶液，改用3ml 20％甘油1.5-2.5分钟，然后用TB洗涤细胞两次。将细胞在5ml含有100uM氯喹的新鲜培养基中37℃温育3-5小时，然后将其用培养基洗涤两次，并用普通DMEM温育72小时。用一种ELISA为基础的技术检测转染的COS细胞的上清(100ul)在不同的稀释度时抗体的存在。在标准的ELISA条件下，用羊抗人λ抗体包被96孔试验板，并将过氧化物酶标记的羊抗人IgG用作检测抗体。发现COS细胞产生10至40ng/ml的猴/人嵌合抗体。将较大体积的上清浓缩10倍，并在直接结合放射免疫测定中用于CD4阳性的SupT1细胞。亲代猴全抗体和无关的人免疫球蛋白分别用作阳性和阴性对照。猴抗CD4抗体和猴/人嵌合抗CD4抗体还用来抑制一种高亲和力的鼠抗CD4(1F3)抗体的结合。这些结果证明该猴/人重组抗体(ATCCNo.69030)不仅能结合CD4阳性细胞，而且还能以与猴全抗体或1F3自身大致相同的浓度抑制1F3与CD4阳性细胞的结合。
实施例2本实施例涉及CE9.1的体外功能特性，包括其在混合淋巴细胞反应中对T细胞增殖和IL-2产生的影响、其Fc受体和补体结合特性、以及其介导ADCC和CDC应答的能力。此外，还分析了其在体内对CD4受体调节和外周血中淋巴样细胞亚类的影响。分析内容如下。在本实施例中应用了下述材料和方法(Anderson等，“一种灵长动物化抗人CD4单抗的体外和体内特征单抗在黑猩猩中引起CD4受体调节但不引起CD4T细胞排除”)。
材料与方法PRIMATIZEDTM抗CD4抗体的分子构建与表达按照前述方法(Newman，R.A.等，“用于人类疾病免疫治疗的重组抗体的灵长动物化一种抗人CD4的猕猴/人嵌合抗体.”《生物技术学》(Biotechnology)，第10卷，1455页(1992))，从来自一只用sCD4免疫的猴的异种杂交瘤中，PCR扩增和克隆免疫球蛋白的可变区基因。重链和轻链可变区基因以串联排列的形式插入一个盒式表达载体TCAE 6，并在稳定整合到DHFR-CHO细胞(Newman，上文)后以IgG1λ的形式表达。在甲氨蝶呤的量不断增加的情况下进行三轮扩增，使细胞系发展，达到经过8天后产生超过750ug/ml的抗体表达水平。制备了一个在悬浮培养中生长的生产细胞系，并在接种到一个中空纤维反应器前逐步放大(Evans等，“应用中空纤维生物反应器大规模生产鼠单克隆抗体”《生物技术》(Bio Techniques)，第6卷，第8期，762页(1988))。
将培养物上清以125ml/min的速率由反应器通过一个Prosep A柱(300ml，Bioprocessing Inc.)来纯化单抗CE9.1，该柱在使用前用pH7.2的磷酸缓冲盐水平衡。用PBS洗涤柱直至建立一条基线，结合的抗体用5倍柱体积的0.2M的乙酸/0.1M甘氨酸缓冲液(pH4.0)洗脱。回收率为90％左右。将洗脱液调至pH5.5，并通过一个Q-Sepharose柱(Pharmacia)。结合在柱上的CE9.1用25mM Tris-HCl(pH8.5)洗涤。抗体用含有100mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH6.5)洗脱，并用USP可注射普通盐水去过滤浓缩(Millipore Pellicon)。最后将CE9.1滤过一个0.04um Nylon66 NDP滤器(Pall Filtration)。
结合特异性CE9.1与CD4+SupT-18细胞的结合96孔U底微孔板(Corning)用含有0.2％牛血清白蛋白和0.1％叠氮化钠的PBS在冰上预封闭1小时。将预先用同样的缓冲液洗涤的SupT-18细胞(1×105)与不同浓度的CE9.1(2.4pg/ml-10ug/ml)在冰上保温30分钟。将细胞洗涤两次，并与第二层抗体(FITC-标记的羊抗小鼠Ig)在冰上保温30分钟。将细胞洗涤两次，重新悬浮在固定缓冲液(含2％甲醛的PBS)中，用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson)分析。
结合特异性用CE9.1与人外周血白细胞的结合的流动进行分析用标准的Ficoll/Hypaque离心技术(BoyumA.“分离血液白细胞、粒细胞和淋巴细胞”，《组织抗原》(Tissue Antigens)，第4卷，269页，(1974))从人外周血中分离单核细胞。移取含有外周血单核细胞(PMNC)的中间层，用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)洗涤并计数。将5×106细胞与20ul的CE9.1(25ug/ml)在4℃保温30分钟。然后用HBSS洗涤细胞，并与20ul的羊抗人IGG-FITC(Fisher Scientific)保温。再在冰上保温30分钟后，在一台使用自动补偿和用校正珠预先校正的Becton Dickinson FACScan仪上对细胞进行分析。存活的淋巴细胞数用前对右角度的光散射来测定，总淋巴细胞数用控制所有其他事件的方法获得。接着的荧光测量反映的只是关住的淋巴细胞事件。用于双染细胞的定量和随后对黑猩猩血液的研究的单抗包括抗人CD3(Leu-4-FITC；Becton Dickinson)；荧光素结合的抗人CDS(Leu-2a-FITC；Becton Dickinson)；藻红蛋白结合的抗人CD8(Leu-2a-PE；BectonDickinson)；藻红蛋白结合的抗人CD20(Leu-16-PE；Becton Dickinson)；荧光素结合的羊抗人IgG F(ab’)2(Cappel)；和藻红蛋白结合的鼠抗CD4(OKT4，Ortho Pharmaceuticals)。
人组织交叉反应评价了CE9.1对正常人组织的交叉反应。应用亲和素-生物素免疫过氧化物酶技术在来自32个不同组织的冷冻切片上对生物素化的CE9.1进行检测(Wilchek，M等，“生物分析应用中的亲和素-生物素复合物”《生物化学年鉴》(Anal.Biochem.)，171卷1期，(1983))。SupT1(CD4+)用作阳性对照细胞系，SB细胞(CD4-)用作阴性对照细胞系。一种无关的生物素化的鼠/人(IgG1)嵌合抗体用作阴性抗体对照。
对于多数组织，三个独立的样品进行了检测，与CE9.1的反应用0至3+的尺度来记录。在有些组织中，组织内不同的结构分开进行记录。例如，在肝脏中，肝细胞、胆管和枯否氏细胞独立进行记录。
种属特异性用CE9.1对几种普通实验室灵长动物和非灵长动物的外周血进行筛选，来鉴定可能的CD4阳性T细胞的交叉反应。这些动物包括黑猩猩、狒狒、恒河猴、爪哇猴和豚尾猕猴、大鼠、小鼠、兔和狗。通过在4℃进行离心(1500rpm 5分钟)从1-5ml全血中分离血细胞，并重新悬浮于等体积的PBS中进行洗涤。再重复该过程一次，并将细胞重新悬浮于等体积的胎牛血清中。将取自每种动物的200毫升细胞悬液与20ul CE9.1(25mg/mL)置于一个15mL的锥形离心管中。将抗体与细胞混合，置于冰上30分钟，然后用HBSS充分洗涤。然后加入20ul羊抗人IgG-FITC(Fisher Scientific)，并将样品混合。再在冰上保温30分钟后，从冰上取出样品，加入10mL预先加热至37℃的裂解缓冲液(0.01M的碳酸氢钾，pH7.4，含有0.16M的氯化铵和0.1M的EDTA钠)。样品在室温保温15分钟。随后1500rpm离心5分钟。标记的细胞沉淀在含有1％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的HBSS(pH7.4)中另外洗涤两次。将标记细胞通过重新悬浮在固定缓冲液(含有1.0％甲醛的0.5M氯化钠，用0.22um滤膜过滤)中进行固定。按上述方法用一台Becton Dickinson FACScan仪器对样品进行分析。
体外功能试验单向和三向混合淋巴细胞反应将人或黑猩猩的T细胞(1.3×105)在含有或不含有CE9.1的情况下与丝裂霉素C处理的分别来源于无关的人或黑猩猩供体的PBMCs(6.0×104)在平底微孔中培养7天。在培养的最后18小时，按每孔1uCi加入氚化的胸苷。将微孔板离心，细胞沉淀用HBSS洗涤，然后用液闪计数器进行计数。每个样品重复分析三次。
人MLRs使用三种独立的无关供体作为刺激和应答细胞混合物来进行。采用此方案是为了使来自棕红层血的HLA不明的随机样品中好的应答产生的机会最大。在此方案中，所有供体血液都不用丝裂霉素C处理或进行照射。
用THP-1细胞粘附实验来测定CE9.1的Fc受体结合活性本实验依赖于两种细胞系通过一种抗CD4抗体的桥接，这两种细胞系一种表达CD4，另一种表达Fc受体。所用的表达CD4的配偶物是粘附的用人CD4转染的小鼠成纤维细胞系DAP(DAP/CD4)。携带Fc受体的细胞是THP-1。将DAP/CD4细胞置于96孔平底板(100ul/孔；25,000细胞/孔)中使其粘附过夜。THP-1细胞重新悬浮在50mL RPMI培养基中(1×106细胞/mL)并加入50U/mL的γIFN在37℃诱导24小时。
按下述方法使γIFN诱导的THP-1细胞荷载calcine acetomethoxyester(CAM，Molecular Probes)；细胞用加样缓冲液(含有钙、镁和0.1％牛血清白蛋白的Dulbecco’s PBS)洗涤，并按5×106细胞/mL重新悬浮于10mL的相同缓冲液中。CAM(1mg/mL溶于DMSO中)用加样缓冲液稀释(1∶50)。并按1∶1 v/v加于THP-1细胞悬液中。在室温下保温20分钟后，在每4mL细胞/CAM混合物中加入25 mL新鲜的加样缓冲液，并继续在室温保温40分钟。然后将细胞用加样缓冲液洗涤两次，并按8×106细胞/mL重新悬浮。将CE9.1用PBS(不含钙，镁或BSA)系列稀释后加于含有CD4+DAP细胞的孔中，并在室温保温5分钟。然后加入50ul CAM荷载的THP-1细胞悬液，并将板置于暗处室温下保温1小时。对不含DAP细胞的对照孔也进行分析。保温后，孔用PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，在每孔中加入100ul的PBS，然后加入10ul 20％的Triton X-100。置于振荡器上10-15秒后，用一台Fluoroscan(MTX Lab systems InC.)进行读板。
用激活的单核细胞结合实验来测定CE9.1的Fc受体结合活性除以下不同外，Fc受体实验按上面THP-1细胞中的介绍来进行。采用标准的Ficoll/hypaque和Percoll梯度分离方法，从新鲜的外周血中制备单核细胞。按上面的方法用γIFN刺激单核细胞，但时间为48小时。用刺激的单核细胞将板包被24小时。并且在此实验中，CD4+细胞系SupT-18细胞按前面的介绍荷载了CAM。然后按前述方法将SupT-18加入用刺激的单核细胞包被的板中。在此实验中主要的差别在于CD4+细胞系用CAM荷载并加入至板上携带FcR的细胞中。在前面使用THP-1细胞的实验中，次序是反过来的。
与FcγRII转染的小鼠成纤维细胞结合一种已用人FCRH转染的小鼠成纤维细胞系(CDW32-L)获自ATCC。通过在存在和缺乏sCD4的情况下与抗体温育，来测定与CE9.1的直接结合。CE9.1的结合通过与结合有辣根过氧化物酶的羊抗人Ig抗体(Southern Biotech)温育来检测。CE9.1的Fab片断用酶消化的方法来制备，并用作阴性对照。将CE9.1(及Fab片断)在存在sCD4的情况下与细胞预温育所获得的吸收值从缺乏sCD4时的抗体获得的吸收值中减去。
ADCC实验(SupT1细胞的裂解)收集新鲜的肝素处理的人血液样品，并在Ficoll/Hypaque上用标准离心程序分离外周血单核细胞。棕红层中的红细胞用氯化铵缓冲液裂解，细胞在Hank’s平衡盐溶液中洗涤两次。外周血淋巴细胞(PBLs)用每mLRPMI/10％胎牛血清(FCS)10个单位的IL-2在37℃，5％CO2的条件下刺激24小时，24小时后将PBLs重新悬浮于RPMI/5％FCS。
SupT1-18细胞(1×106)通过与100uCi51Cr在37℃，5％CO2的条件下温育1小时的方法进行标记。细胞用RPMI/5％FCS洗涤两次，在每孔中加入1×104细胞。将三份CE9.1抗体用RPMI/5％FCS按1∶2系列稀释，等份加于含有SupT1-18的孔中，作三个重复，在37℃、5％CO2的条件下保温30分钟。100ul的1％Triton X-100和100ul的培养基分别用作最大和本底释放对照。将IL-2刺激的PBLs(8×105细胞)加入孔中。板用900rpm离心3分钟，并在37℃、5％CO2下温育16小时。收集每孔的上清，用伽马计数器对放射活性量进行计数。本实验重复三次。按下面的公式确定裂解细胞的百分比
C1q结合实验C1q实验使用SupT1-18CD4阳性细胞系的每mL4×106的悬液来进行。CE9.1与对照亲和纯化的猴抗CD4抗体(50ul)以20ug/mL的相同浓度加于2×105CD4阳性靶细胞中。细胞悬液和抗体在冰上保温1小时，然后用含1％BSA的PBS洗涤两次。在每管中加入50ul的人C1q(10ug/mL)，冰上保温1小时。将每管洗涤两次，然后与1∶15稀释的兔抗人C1qFITC(50ul)保温1小时(1小时，冰上，暗处)。细胞再洗涤两次，并在0.5mL的1％甲醛/PBS中固定。用一台Becton Dickinson FACScan流式细胞仪对细胞进行分析，使用Consort 30软件进行数据获取和分析。补体介导的细胞毒实验SupT1-18细胞(1×106)通过与100uCi51Cr在37℃、5％CO2的条件下温育1小时的方法进行标记。细胞用RPMI/5％FCS洗涤两次，并在每孔加入1×104细胞。CE9.1和对照抗CD4抗体用RPMI/5％FCS按1∶2系列稀释，将50ul的等份加于含有SupT1-18的孔中，作三个重复。100ul 1％的Triton X-100或100ul的培养基加入孔中分别用来测量51Cr最大和本底释放。在37℃、5％CO2保温90分钟后，在孔中加入1∶5稀释的兔补体(Cappel)。将板再在37℃、5％CO2保温90分钟，然后在900rpm离心3分钟。收集每孔上清，用伽马计数器对放射活性量进行计数。本实验重复三次。按下面的公式确定裂解细胞的百分比
黑猩猩体内研究将6只黑猩猩分成三组，每组两只I组(盐水对照)；II组(10.0mg/kg的CE9.1抗体)；III组(10.0mg/kg的CE9.1抗体)。如果30天后II组动物的CD4+T细胞计数回复到基线的30％，用10.0mg/kg的CE9.1对它们再次处理。如果30天后III组动物的CD4+T细胞计数回复到基线的70％，用10.0mg/kg的CE9.1对它们再次处理。如果30天后这些数值没有达到，就每隔两星期测量该组动物的CD3+，CD4+，CD8+T细胞值，直到CD4+T细胞值达到该组相应的目标值。此时再静脉内给予动物10.0mg/kg的CE9.1抗体，直至最多三个剂量。
全部白细胞计数、淋巴细胞和粒细胞值，和CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞亚群数目的基线测定，在紧接着给药前的第-6天、第0天及在给药后的24小时和第14天进行。在本研究中对黑猩猩进行三个处理循环，每次给药剂量为10.0mg/kg。结果单抗CE9.1的结合特异性用SPR对CE9.1与可溶性CD4所做的亲和性测定显示其Kd为1.0nM(Brigham-Burke等，North American BIAsymposium 1995(出版中))。没有发现与CD4-细胞系的结合，并且抑制研究证明与CD4+细胞的结合可被可溶性CD4以化学计量的方式完全抑制。
为测定CE9.1反应的特异性，其与新鲜分离的人外周血单核细胞的结合用双色流式细胞分析进行了测定。图9显示约2/3的CD3+细胞结合CE9.1。在淋巴样细胞亚群中，所有结合OKT4的细胞也都为CE9.1阳性，而CD8+细胞全都是阴性。一些CD3-细胞也显示与CE9.1反应，尽管这种反应的本质还不十分清楚。
进行了免疫组化分析来测定CE9.1的组织反应性，这些组织包括32种不同的正常人淋巴样和非淋巴样组织。非淋巴样组织包括主要的器官，脑、心脏、骨骼肌、皮肤、肝脏、肾、腺体和生殖组织。这些分析显示，除了淋巴样来源的组织，包括淋巴结、脾脏、扁桃体和外周血(未显示数据)外，不与其它的组织发生交叉反应。限制于淋巴样聚集部位的着色也在大肠，肺，食管和皮肤中观察到。CE9.1对人混合淋巴细胞反应的抑制CE9.1对T细胞应答的作用用人混合淋巴细胞反应即IL-2产生或增殖应答来评价。CE9.1阻断增殖和IL-2产生的IC50均为10-30ng/mL，产生80％抑制的水平为60ng/mL(图10)。CE9.1的Fc受体结合活性以CD4和Fc受体为基础的细胞-细胞粘附实验被发展来测定CE9.1与单核细胞上Fc受体反应性。在一种实验方案中，单核细胞用percoll梯度离心法从新鲜的外周血单核细胞中分离，接种到微孔板中，用γIFN刺激48小时。48小时后，荷载有染料的CD4+SupT1细胞在存在或缺乏CE9.1的情况下加入到激活的粘附单核细胞中。在本粘附实验的第二种实验方案中，单核的、非粘附细胞系THP-1用γIFN刺激。24小时后，将此激活的THP-1细胞荷载上一种标记染料，在存在或缺乏CE9.1的情况下加入到事先(24小时前)铺于微孔板中的、粘附的、CD4+成纤维细胞转染子中。在两种方案中，细胞-细胞粘附依赖于单抗与一种细胞上的CD4和另一种细胞上的Fc受体的结合。
图10a、10b和10c列出的基于γIFN激活的新鲜单核细胞和CD4+SupT1 T细胞的数据显示，CE9.1以剂量依赖的方式介导细胞-细胞粘附，ED50大约为20ng/mL。粘附可被sCD4完全阻断，并且不能由CE9.1的F(ab’)2片段介导。没有被γIFN激活的单核细胞不能与CE9.1结合(图10b)。用基于THP-1和CD4+成纤维细胞的实验也获得了相似的数据(未列出数据)。CE9.1与一种转染有人FCγRII受体的鼠成纤维细胞系的直接结合也被观察到(未列出数据)。依赖于抗体的细胞介导的细胞毒(ADCC)在ADCC实验中用作靶细胞的放射性标记的SupT1细胞显示在存在CE9.1时能特异性地被效应细胞裂解。在约6ug/mL时达到最大细胞毒，总的特异性裂解为50％左右(图12)。一种IgG2a同种型的鼠抗CD4抗体(4D9)被用作阳性对照。这种抗体的作用与CE9.1的作用非常相似，具有相同水平的总的细胞裂解率。因此，CE9.1在与效应细胞上的Fc受体结合和介导对CD4+靶细胞系的杀伤时，非常有效。CE9.1介导的补体固定按前述方法(材料与方法)，用流式细胞仪测定C1q的结合。如图13所示，尽管CE9.1含有一条γ1亚型的人重链恒定区，但它仅表现很弱的C1q结合(图13)。亲和纯化的猴抗CD4血清抗体能有效地介导C1q结合，这表明CE9.1缺乏C1q结合活性是此抗体的一个特性。CE9.1缺乏C1q结合活性反映在不能固定补体上(图14)。从猴血清中亲和纯化的抗CD4抗体和一种IgG2a鼠单克隆抗体都能在相同的浓度范围内产生显著的裂解。CE9.1的种间交叉反应性来自不同种的淋巴细胞的流式细胞仪分析显示，仅有黑猩猩和人的细胞能和CE9.1强烈结合。其它种属中只有狒狒显示能与CE9.1有弱的反应(比人低10倍)。人和黑猩猩的淋巴细胞与单抗的反应同样良好(表2)。这反映在CE9.1抗体可对黑猩猩混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖和IL-2生成产生相当的抑制(未列出数据)。
表2
6只黑猩猩中的体内研究基于在单独一只黑猩猩的剂量不断增加的实验中CD4细胞排除的缺乏，对四只黑猩猩给予10mg/kg的剂量(对照组的另外两只动物接受盐水)。按材料与方法中所述，两个剂量组在研究的第0天都给予10mg/kg。图15总结了这些动物中CD4和CD8计数受到的影响。可以发现表达CD4受体的细胞在给予抗体后立即减少。CD4计数的减少仅短暂见于每次给予抗体后。在盐水对照组没有发现相同的CD4计数改变。尽管观察到在每日的基础上有变化，CD8计数在处理过程中不受影响(左手部分，空心圆圈)。通过对CD3+-CD8+群体的检查，观察到了CD4数量不那么剧烈的下降。这一数据表明CD3+CD8-T细胞群体的出现，这可能是CD4抗原调节的结果。在此阶段，调节的精确机制还不清楚，但可能包括作为其它淋巴样细胞和单核细胞上表达的Fc受体交联结果的CD4分子的内在化和脱落。对图15中细胞数量的比较显示，虽然主要的影响是由于CD4受体的调节，但一些CD4+细胞排除可能发生。在多数情况下，调节结果在抗体给药后紧接着出现，能持续7-10天，随后，CD4表达回复到略低于基线的水平。
相对于基线时间点，总的CD4计数仍下降了10-50％，但当终止处理后，又回到正常范围。黑猩猩继续了长达150天(组1和2)或300天(组3)的一段时间。组2的动物的CD4计数在最后处理后的第80天恢复正常，而组3的动物在同一时间范围内回复到基线20％的水平。
实施例3本实施例介绍了用于在哺乳动物细胞中生产CE9γPE的DNA表达载体的遗传构建，CE9γPE是含有一种整合有P和E变化的γ4同种型的猴/人嵌合抗CD4抗体。DNA表达载体的构建人γ4重链基因用PCR从细胞系TPIT10.4(获自S.Morrison，UCLA)中分离，所用的引物为5’IDEC引物#479和3’IDEC引物#462(见图16)，这两条引物分别含有Nhe I和BamH I位点。对人γ4的完整克隆片断进行测序，发现其与Kabat等介绍的相同(NIH Publication Fifth Edition No.91-3242，U.S.Dept.of Health and Human Services(1991))(见图17)。将NheI/BamHI克隆到表达载体Anex2中。将完整的免疫球蛋白轻链和重链基因以一个Bgl II和SacI的片断从该质粒转移到另一表达质粒中，此质粒被称为NEOSPLA3F中的抗CD4(G4，L，Oz-)。
使用PCR诱变来改变γ4恒定区中的#229和#236氨基酸。PCR采用分别含有Nhe I和BspH I限制酶切位点的5’引物GE212(Midland)和3’IDEC引物#698(见图16)。将此片断用三步连接克隆到抗CD4(G4，L，Oz-)质粒中，后一质粒被称为NEOSPLA3F中的抗CD4(G4(PE)，L Oz-)。
实施例4在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达质粒的整合与抗体产生克隆的选择CHO细胞(DG44)(Urlaub等，《体细胞分子遗传》(Som.Cell Mol.Genet.).16卷，555-566页，(1986))培养于含有50uM次黄嘌呤和8uM胸苷(GIBCO/BRL，CHO media)的CHO-S-SFM II培养基(GIBCO/BRL，CHO media)中。此培养基被称为加HT的CHO培养基。
使用一台BTX 600电转化装置(BTX，San Diego，CA)，在0.4mL一次性样品池中，用4×106细胞和5 ug的质粒DNA[NEOSPLA3F中的抗CD4(γ4(PE)，Lamda，OZ-)]进行5次电转化。在电转化前，质粒用Pac I限制酶切以将在哺乳动物细胞中表达的基因与质粒中用于在细菌中生长的部分分开。电转化的条件为230伏特、400微法、13欧姆。每次的电转化物铺于单独一个96孔皿中(约40,000细胞/孔)。在电转化随后的两天中及此后需要时，在皿中加入CHO培养基+HT，培养基中还含有400ug/mL活性化合物的G418(Geneticin，GIBCO)，直至集落长出。用针对人抗体的ELISA分析汇合集落的上清中嵌合免疫球蛋白的存在。在5块板(一共480孔)上长出了28个G418抗性集落。表达抗体最多的G418抗性集落，5C1在电转化后30天汇合。Souhtern印迹分析显示克隆5C1是一个单拷贝的整合子(未显示数据)。在一个125mL的转杯中按105细胞/mL接种的4天培养中，此克隆每28小时增殖一倍，并且其抗体产生率为0.5pg/细胞/天(0.9mg/L)。扩增对克隆5C1进行放大，并以106细胞/板至3×104细胞/板的不同浓度加于装有CHO培养基+5ng甲氨蝶呤(MTX，Sigma(+)Amethoperin)的96孔皿中。20天后，克隆5C1-5B9在3×105细胞/板上开始汇合(在此板上96孔中有49孔生长)。将此克隆放大。在一个T150中按105细胞/mL接种的4天培养中，此克隆每35.5小时增殖一倍，并且其抗体产生率为15.3pg/细胞/天(18mg/L)。对克隆5C1-5B9进行放大，并以100细胞/板至3×104细胞/板的不同浓度铺于装有CHO培养基+50nM氨甲蝶呤的96孔皿中。36天后，克隆5C1-5B9 50C1在105细胞/板上变为约60％汇合(在此板上96孔中有50孔生长)。将此克隆放大。用于CE9γ4PE亲代种子贮存物(PSS)的I期供应的细胞库冷冻克隆5C1-5B9-50C1的50nM MTX PSS。将细胞培养于含有CHO培养基加50nM MTX的500ml转杯中。在冷冻时，培养物已达到1.1×106细胞/ml的密度，存活率为96％，倍增时间为29.3小时。抗体产量用夹心ELISA测定为大约27pg/细胞/天。将细胞从培养基中离心出来，以在95％JRH Biosciences胎牛血清和5％Sigma这种普通主混合物中2.0×107细胞/ml的密度装于小瓶中，将1ml含有细胞的冷冻培养基装瓶冷冻。小瓶在-70℃冷冻，并在第二天置于液氮罐内。
将一个50nM MTX PSS小瓶解冻，接种到一个含有CHO培养基加50nM MTX的100ml转瓶中。三天后将此转瓶中的培养物以2×105细胞/ml分装到2个125ml转瓶中；一个转瓶中含有CHO培养基加50nM MTX，另一个转瓶仅含CHO培养基。
三天后，从仅含CHO培养基的转瓶中取出细胞和培养基15ml进行冷冻，并送至Tektagen进行支原体检测。有和无MTX的产物都持续8周。从Taktagen得到的结果显示CHO中的抗CD4(γ4(PE)，Lambda，OZ-)NEOSPLA3F；克隆5C1-5B9-50C1亲代种子贮存物不含支原体。将10只装有50nM NM PSS的小管转入液氮保存。主细胞库(MCB)将两只克隆5C1-5B9-50C1的50mM MTX PSS小管解冻，接种到含有CHO培养基加50nM MTX的100ml转瓶中。逐渐增大转瓶对培养进行扩大6天，直至其达到2000ml体积，密度为9.5×105，存活率为98％。从培养基中离心出细胞，并重新悬浮在95％JRH Biosciences胎牛血清和5％Sigma Hybrimax DMSO中，使其密度为2.0×107细胞/ml。将冷冻培养基中的细胞悬液等份(10ml)装入80个称为MCB G4PE50-M-A的小冷冻管中。将这些冷冻管在-70℃冷冻。24小时后，将细胞库转入液氮中保存。
实施例5CD4单抗的稳定性用SDS-PAGE(还原型和非还原型)、IEF、反向HPLC、大小排阻层析(SEC)和ELISA在5℃、40℃和散射光的条件下对CE9γ4PE和CE9γ4E溶液的物理和化学稳定性进行了三个月的监测。用RP-HPLC和非还原型SDS-PAGE所做的初步检测提示CE9γ4E包括两个主要的种类，即非还原的全分子和一个非共价结合分子，后者在分析条件下断开成两个相同的单位，称为“半分子”。有趣的是，用SEC、IEF、SDS-PAGE(还原型)和ELISA没有观察到这两种单抗在生物分析谱上的较大差别。用RP-HPLC或SDS-PAGE(非还原型)检测到的CE9γ4PE中“半分子”的量都少于1％。图18显示了CE9γ4PE和CE9γ4E溶液中单体和“半分子”的SDS-PAGE(非还原型)分析。CE9γ4E中“半分子”的量在三个月中在任何检测条件下相对于最初的检测保持恒定。CE9γ4PE中“半分子”含量在所有的检测条件下都保持低于2％。在5℃和40℃没有观察到CE9γ4E和CE9γ4PE在稳定性上的较大差别。在散射光下贮存的CE9γ4E溶液的稳定性略低于CE9γ4PE。数据提示CE9γ4E中的“半分子”对全部分子的整体稳定性没有明显的影响。没有观察到CE9γ4PE和CE9γ4E在物理稳定性上的较大差异。用表面胞质基因其振来测定CD4单抗的亲和性和化学计量学可溶性CD4与固定的单抗结合的化学计量学可用在BIAcore(Pharmacia)上的饱和结合实验来测定。按照O’Shannessey等，《分析生物化学》(Anal.Biochem.)，212卷，467-468页(1993)的介绍，用速率方程的合并形式直接对SPR过程的结合和解离相的数据(图19)进行分析。结合数据以摩尔CD4/摩尔单抗的表述形式概要列于表3中。从此数据可以看出，在所有场合，结合的化学计量学都大于1.5∶1。如果BIAcore是一个固相相互作用系统以及固定过程是随机的，这些结果提示每个单抗的两个抗原结合位点都是有功能的。这样，CD4结合的化学计量学对所有单抗来说都是相同的，并接近于理论值2.0。此外，亲和性测量显示，对所有单抗复合物来说亲和性都是相同的，即大约1.0nM。
表3用表面胞质基因共振来测定亲和性和化学计量学
实施例6CE9γ4PE的体外生物学评价概要比较了CE9.1、CE9γ4PE和其它γ4衍生物的由Fab区(MLR)和Fc区(Fc受体结合、ADCC和CDC)介导的活性。在这些单抗中Fab依赖的活性(MLR)没有差别，但它们在Fc受体结合特性上不同。未修饰的γ4衍生物CE9γ4显示非常强的Fc受体结合，而在CEγ4E和CEγ4PE中的E突变消除了这种结合活性和ADCC活性。单抗对混合淋巴细胞反应(MLR)的影响进行一个三向混合淋巴细胞反应(MLR)实验来测定单抗结构对异种抗原驱动的T细胞增殖和EL-2产生的影响。MLRs依赖于CD4+T细胞的存在，并且大部分应答依赖于CD4受体通过其与抗原递呈细胞上的MHCII类分子相互作用的参与。MLR应答是体内移植排斥方面的体外相关事件。对其它药学试剂来说，MLR也被免疫抑制试剂如环孢菌素A所阻断。
所有的单抗结构在阻断MLR的能力方面是相同的，这可从T细胞增殖和IL-2产生二者看出(图20和表4)。因此，将CE9.1的V区移植到人λ4结构中以及在铰链区和CH2区的“P & E”替换不会影响单抗在体外阻断CD4依赖的T细胞应答的能力。
表4单抗对MLR的影响—概要
结论所有单抗在MLR的抑制中是相同的。单抗的Fc受体结合特性测定Fc受体结合实验的证实CE9γ4PE是被设计用来去除FcR结合活性的。为测定这种活性，以FcR和CD4介导的经单抗搭桥的细胞粘附为基础发展了一个实验。本实验测量单抗同时与CD4和FcR的结合功能，作为体内FcR和单抗介导的CD4细胞排除的体外相关事件。
图21证明CE9.1在粘附实验中促进表达FcR的单核细胞(IFN-γ-诱导的THP-1细胞)与CD4+成纤维细胞(CD4转染的成纤维细胞系)的结合。结合依赖于单抗CE9.1的Fc区，因为经过修剪的F(ab’)2不能促进结合。结合还需要CE9.1的抗原识别位点，因为当其被sCD4占据时会阻断细胞-细胞粘附。测定单抗的Fc受体结合活性评价了单抗CE9.1(IgG1)、CE9γ4(IgG4)、CE9γ4λK(IgG4λK杂合子)、CE9γ4E(IgG4，E突变体)和CE9γ4PE(IgG4，PE突变体)同时与细胞表面CD4和FcR结合的能力。
正如所希望的，CE9.1在本实验中有良好的结合活性。令人惊奇的是，IgG4结构体CE9γ4和CE9γ4λK残留着足够的FcR亲和活性，在本实验中无法将它们与CE9.1区别。在本实验中，仅当“E”替换被引入CE9γ4E和CE9γ4PE中时，活性才会丧失(见图22)。CE9γ4PE的体外C1q结合特性在其多种功能组分中，补体系统含有与特定种类的抗体以导致细胞裂解和破坏的方式相互作用的能力。人IgG1抗体一般具有结合C1q和排除携带其具有特异性的表面抗原的靶细胞的能力。其他的人同种型如IgG4表现出较低的C1q结合能力，因此不能排除靶细胞。对CE9γ4PE的γ4结构所做的工程操作在理论上将会达到防止补体固定的目的，并允许抗体与CD4靶细胞结合以消除潜在的破坏性副作用。
使用经典方法，即在存在兔补体的条件下补体介导的铬标记CD4+SupT1细胞的细胞裂解，来比较CE9γ4PE和CE9.1的CDC效应特性。在这些研究中，一种鼠补体固定单抗于HuCD4、4D9(IgG2a)用作阳性对照。CE9.1和CE9γ4PE都不能有效固定兔补体(图23)。我们早就注意到CE9.1与C1q结合很差，因而不能固定人补体。这些结果显示两种结构都不能通过补体效应机制促进细胞裂解。CE9γ4PE的体外ADCC效应特性能通过FcR与单抗结合，具有细胞毒潜力的细胞能介导针对抗体包被的靶细胞的ADCC。表达CD4分子的人T辅助细胞能被单抗CE9.1识别，从而激发携带FcR的杀伤细胞、粒细胞和/或巨噬细胞的溶细胞攻击。进行CE9γ4PE工程操作的目的是去除单抗与FcR结合的能力，从而消除辅助细胞介导CD4靶细胞排除的能力，而使单抗保留免疫抑制活性。
使用经典的细胞介导的铬标记CD4+SupT1细胞的细胞裂解方法，来比较CE9γ4PE和CE9.1的ADDC效应特性。鼠CD4单抗4D9(IgG2a，K)被选用作阳性对照。效应细胞是获自棕红层的人外周血白细胞。图12显示了4D9和CE9.1两种单抗介导CD4+细胞特异性裂解的能力。在同样条件下，CE9γ4PE的效果非常低。
这些结果显示CE9γ4PE不能通过FcR或补体机制介导细胞裂解。
实施例7CE9γ4E和CE9γ4PE的PK比较分析两种主要λ4单抗CE9γ4E和CE9γ4PE的比较药代动力学用雄性Sprague-Dawley大鼠进行研究。CE9γ4E或CE9γ4PE以静脉药剂的形式按1mg/kg进行给药(每组四只动物)，给药4周后采取血样。血浆CE9γ4E和CE9γ4PE浓度用sCD4/抗人IgG夹心ELISA进行测定，该ELISA设计不仅能证实循环人IgG的存在，还能结合重组人可溶性CD4。
在给予1mg/kg静脉药剂的CD4单抗后，CE9γ4E的血浆浓度以三阶段的模式下降，而CE9γ4PE的血浆浓度以两阶段的模式下降(图24)。为了进行比较，而且由于没有足够的数据来充分描述CE9γ4E的末尾阶段，所有的血浆浓度-时间图谱都按两阶段模式进行分析。受试动物间发现有小的差异。占优势的第二阶段t1/2在CE9γ4E是大约4天，在CE9γ4PE是大约9天，并在血浆浓度-时间曲线下面的总面积中分别占67％和93％。CE9γ4PE的表观血浆清除率很低(6.4ml/hr/kg)，大约是CE9γ4E清除率(1.0ml/hr/kg)的一半。因此，PE突变型γ4单抗，CE9γ4PE在大鼠中与其它人源化γ1单抗的药代动力学特征相似。
功能性完整的CE9γ4PE在大鼠中的长循环半衰期提示CE9γ4PE在对人给药后可能在一个长的时期内有效。
这些结果证实，PE突变型的CE9γ4PE比CE9γ4E突变体在大鼠中具有低2倍的血浆清除率和较长的半衰期。
表5在对Sprague-Dawley大鼠按1mg/kg的静脉药剂给药后CE9γ4E和CE9γ4PE的药代动力学参数(均值±SD)
药代动力学参数的简写CL＝总的血浆清除率；AUC0-inf血浆浓度对时间曲线下面的总面积；MRT＝平均保留时间；T1/2-1＝初始阶段的表观半衰期；T1/2-2＝第二阶段的表观半衰期；％AUC2＝在第二阶段血浆浓度对时间曲线下面面积的百分比；VSS＝稳定状态时的分布体积。基于这些结果，CE9γ4PE应适于治疗用途，例如通过静脉给药。而且，其它给药途径也可能是适合的。
实施例8HuCD4+转基因小鼠中的体内药学研究HuCD4转基因鼠的描述引言CE9.1和CE9γ4PE的高度种属特异性使体内效果的评价复杂化。对于CE9.1，药物学应答在黑猩猩中可以方便地通过剂量依赖的CD4+细胞排除进行监测。预期在CE9γ4PE中缺乏这种活性，这促使我们采用其它的方法来评价效果。特别地，在HuCD4转基因小鼠中研究效果。在此系统中所作的研究在下面介绍。HuCD4+转基因小鼠在研制于UCSF的HuCD4转基因小鼠(Killeen等，EMBO J.，12卷，1547-53页，(1993))中，内源的MuCD4基因用同源重组的方法破坏，一个人CD4小转移基因被引入并接受MuCD4启动子的调节。在这些现已经过杂交变为纯合子的小鼠中，HuCD4取代了MuCD4。HuCD4恢复了胸腺中的阳性和阴性选择，导致产生单阳性的外周CD4+或CD8+T细胞，其水平与在正常小鼠中发现的相当。而且，与MuCD4敲除亲体相比，成熟HuCD4T细胞的特性被证明类似其在正常小鼠中的对应细胞(1)在体内，血清IgG的水平恢复到正常水平，且(2)这些动物在体外NMR中显示适当的MHC依赖的应答。
由于在最初的敲除实验和转基因实验中需要使用不同株系的胚胎干细胞和小鼠，这些小鼠的遗传背景有些复杂。最初的敲除/转基因小鼠随后进行育种以获得MHC位点的纯合子，现用的小鼠在SB位点为H-2dd单元型。
结果已经显示，在这些HuCD4小鼠中获得了对一种异种抗原卵清蛋白良好的应答，并且最初的研究已经证明了CE9γ4PE的体内活性。CE9γ4PE在HuCD4转基因小鼠中的初步估价获取了12只HuCD4(H-2dd)转基因小鼠，并用于CE9γ4PE与1F3(鼠抗人CD4)及GK1.5的比较。小鼠在第-2，-1和0天腹膜内给予1mg的抗体，在最后一次给药的第二天用OVA免疫3小时。两周后处死小鼠，对血清和细胞进行功能活性的评估。OVA特异的抗体应答见图25。正如所预期的，针对鼠CD4的单抗(GK1.5)对体液应答没有影响，而两种针对HuCD4的单抗阻断此应答。CE9γ4PE在这两种单抗中更为强烈。
所有组的小鼠都对Con A和LS产生应答，但在对卵清蛋白的应答和在MLR中有一些差异，这可能是因为这批动物包含雄性和雌性，并且鼠龄不同。
MuCD4-/-(CD4敲除)小鼠和HuCD4+/+(转基因小鼠)以CE9.1、CE9γ4PE或盐水处理。研究共进行28天，在第1、3、7、14和28天取样。用取自这些小鼠的脾细胞做三色流式细胞分析追踪CD4+和CD8+T细胞的命运。为了检测T细胞的水平，使用了下列抗体CD3-PE、OKT4-FITC、CD8-TC。为了追踪T细胞和B细胞在这些小鼠中的命运，使用了下列抗体CD3-PE、CD2-FITC、CD45-TC。为了追踪CE9.1或CE9γ4PE包被的细胞的命运，使用了下列单抗系列OKT4-PE、Leu3a-FITC、CD3-TC。
数据显示在用CE9.1和CE9γ4PE处理的转基因小鼠(HuCD4+/+)中，所有的CD4+细胞在第1天被抗原包被。包被持续数天并在第28天不再能检测到。在用CE9.1处理的小鼠中，被处理的CD4+细胞的总数明显减少，即使在第28天也是如此。相反，在用CE9γ4PE处理的小鼠中，CD4+细胞总数没有显示减少。两种抗体都显示了CD4受体调节的证据。虽然在用CE9.1处理的小鼠中CD8+细胞的百分比有相应的增加，但没有证据表明它们的绝对数字明显地受到处理的影响。在用CE9γ4PE处理的小鼠中，CD8+细胞的数量也同样不受影响。在使用这两种抗体的所有实验中，B细胞的数量保持恒定。黑猩猩中的体内研究在输注了剂量不断增加的CE9γ4PE直至15mg/kg后，检测六只黑猩猩中CD4+T细胞排除和/或CD4受体从细胞表面的调节。在开始研究前三周和二周从每只黑猩猩中采取外周血样以建立CD4+T细胞的基线水平。除了CD4+细胞，对CD3+细胞和CD8+细胞的水平也用流式细胞术进行测量。单抗OKT4能与CD4分子的一个不同部位结合且不与CE9γ4PE的结合竞争，将此抗体用作对照。从总CD3+数中减去CD8+数可以计算出CD4+T细胞的理论值。将此值与用OKT4测量的CD4+数目比较，可以将CD4受体的调节与CD4+细胞排除区分开来。
在开始研究时，每只黑猩猩接受一次盐水静脉输注。在输注后立即以及此后第3和第14天采取血样。将CE9γ4PE(0.05mg/kg)输注到每只黑猩猩体内，并于第3天和第14天采取血样。监测CD4+细胞，并且如果它们处于正常范围内时，给予下一剂量水平的CE9γ4PE。总的来说，每只黑猩猩接受如下方案处理盐水、0.05mg/kg的CE9γ4PE、1.5mg/kg的CE9γ4PE、盐水、15mg/kg的CE9γ4PE。
在输注盐水或0.05mg/kg的CE9γ4PE后，没有发现对CD4水平产生影响。在1.5mg/kg水平，虽然没有发现CD4+细胞排除，但观察到CD4+细胞包被和CD4受体从细胞表面的暂时及部分调节。在15mg/kg的CE9γ4PE时，虽然在所有动物中观察到明显的调节，但没有在任何一只动物中观察到CD4+细胞排除。调节效果是暂时的，在14-21天内恢复到基线。没有在任何一只动物中观察到有害影响。直至给药两天后，可以在细胞表面和血清中检测到CE9γ4PE。
CE9γ4PE被设计为一种非排除抗体，并且在任何一种动物中都不会观察到排除作用，即使在相对高剂量的15mg/kg时也是如此。CE9γ4PE在黑猩猩的血清中是稳定的，在循环中可保留至21天。应用按照上面介绍的方法或用相当的技术生产的抗体可用亲和层析和大小排阻层析的组合进行纯化，用于生物功能实验中的鉴定。这些实验包括特异性和结合亲和性以及与所表达的同种型相关的效应功能如ADCC或补体固定的测定。这样的抗体可用作被动的或主动的治疗试剂，用于治疗多种涉及CD4表达和T细胞的人类疾病，包括B细胞淋巴瘤、感染性疾病包括AIDS、自身免疫和炎症性疾病、以及移植。这些抗体既可以以其天然形式使用，也可作为抗体/螯合物、抗体/药物或抗体/毒素复合物的一部分进行使用。另外，完整的抗体或抗体片断(Fab2，Fab，Fv)可以作为造影试剂或作为潜在的疫苗或免疫原用于主动免疫治疗来产生抗独特型应答。
采用本领域的普通技术人员熟知的标准技术，可以确定能产生治疗效果的抗体用量。抗体一般以标准的技术在一种药学上可以接受的缓冲液中提供，并且可以通过任何所需的途径给药。由于本发明的抗体的功效以及人对它们的耐受，因此可以用这些抗体重复给药来治疗一个人体内的多种疾病或疾病状态。
本发明的抗CD4重组抗体(或其片段)也能用于诱导免疫调节，例如诱导一个人或动物免疫系统的抑制。因此本发明涉及一种方法，即通过给予有此需要的一个人或其他动物有效的无毒剂量的本发明的抗体来在这个人或动物中预防性或治疗性地诱导免疫调节。
本发明的复合物诱导免疫调节的能力可以用用于此目的的标准实验进行证明，例如，一种混合淋巴细胞反应实验或一种用胸苷摄取进行测量的T细胞增殖抑制实验。
本发明的抗体能用于诱导免疫抑制这一事实意味着它们能用于治疗或预防对移植器官或组织(如肾脏，心脏，肺，骨髓，皮肤，角膜等)的抗性或排斥；治疗和预防自身免疫、炎症、增生或过度增生疾病和免疫介导疾病的皮肤表现(如类风湿性关节炎、红斑狼疮、系统性红斑狼疮、桥本氏甲状腺肿、多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病、葡萄膜炎、肾病综合症、牛皮癣、异位性皮炎、接触性皮炎和更进一步的湿疹性皮炎、皮脂溢性皮炎、扁平苔癣、天疱疮、大水泡性大疱疮、大泡性表皮松解、荨麻疹、血管水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜伊红细胞增多、簇状脱发等)；治疗可逆的阻塞性呼吸道疾病、肠炎和过敏(例如腹部疾病、直肠炎、嗜伊红细胞增多性胃肠炎、着色性荨麻疹、局部性回肠炎和溃疡性结肠炎)以及与食物有关的过敏(如偏头疼、鼻炎和湿疹)。而且，本发明的抗体还有潜在的用途用于治疗需要免疫调节的非免疫性疾病，例如移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥、哮喘、HIV、白血病、淋巴瘤及其他。
本领域的技术人员应能够通过常规实验确定，为了诱导免疫抑制，抗体有效的无毒剂量是多少。但是一般来说，一个有效剂量在每天每公斤体重大约0.05至100毫克的范围内。
本发明的抗体(或其片段)还可用于治疗哺乳动物的肿瘤。更具体地，它们可用于减少肿瘤的大小、抑制肿瘤生长和/或延长荷瘤动物的生存时间。相应地，本发明也涉及这样一种方法，即通过给予一个人或其他动物有效的无毒剂量的抗体来治疗这个人或动物的肿瘤。本领域的技术人员应能够通过常规实验确定，为了治疗恶性肿瘤，抗体有效的无毒剂量是多少。但是一般来说，一个有效剂量预计在每天每公斤体重大约0.05至100毫克的范围内。
本发明的抗体可以按照前面所述的治疗方法以足够产生治疗或预防效果的剂量对人或其它动物进行给药。本发明的这种抗体能够以根据已知技术将本发明的抗体与一种传统的药学上可以接受的载剂或稀释剂混合而制备的传统药剂形式对这样的人或其它动物进行给药。本领域的技术人员应当理解药学上可接受的载剂或稀释剂的形式和性质取决于与其组合的活性成分的量、给药途径和其它众所周知的变量。
本发明的抗体(或其片段)的给药途径可以是经口的、非肠道的、吸入或局部给药。非肠道一词用于此处包括静脉、肌肉内、皮下、直肠、阴道或腹膜给药。一般优选采用皮下和肌肉内这两种非肠道给药形式。
在应用本发明的复合物预防性或治疗性地诱导免疫抑制或治疗恶性肿瘤时，非肠道和经口给药的日常剂量一般在每天每公斤体重大约0.05至100mg的范围内，但优选0.5至10mg。
本发明的抗体也可通过吸入进行给药。通过“吸入”的意思是鼻腔和口吸入进行给药。用于这种给药方式的合适药剂形式，例如气雾剂配剂或有标尺的药剂吸入器，可以用传统技术制备。所用本发明的复合物的优选剂量一般在大约10至100毫克的范围内。
本发明的抗体也可以局部进行给药。局部给药的意思是非全身性给药，包括将本发明的抗体(或其片段)复合物外用于表皮、口腔、及将此抗体滴入耳、眼和鼻，以及其它不能显著进入血循环的部位。全身性给药的意思是经口、静脉、腹膜和肌肉给药。当然，为达到治疗或预防效果所需抗体的量随所选用的抗体、所治疗疾病的本质和严重程度、接受治疗的动物的不同而不同，并最终由医生来决定。本发明的抗体的适当局部剂量一般在每天每公斤体重大约1至100毫克的范围内。配剂尽管一种抗体或其片段可以单独给药，但优选以一种药物配剂的形式提供。对于局部给药，活性成分可以为0.001％至10％w/w，如配剂重量的1％至2％，虽然可以达到10％w/w，但优选不超过5％w/w，且更优选为配剂的0.1％至1％w/w。
本发明的局部配剂包括一种活性成分和一种或多种可接受的载剂以及可选用的任何其它药物成分。载剂必须是“可接受”的，其含义是与配剂的其它成分相匹配，并且对其接受者无害。
适合于局部给药的配剂包括适合于穿过皮肤到达需要治疗的部位的液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、乳剂、药膏或糊剂，以及适合于眼、耳或鼻给药的滴剂。
根据本发明的滴剂可包含无菌的水或油溶液或悬液，并可通过在一种杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他合适的防腐剂的合适水溶液中溶解活性成分来制备，并优选含有一种表面活性剂。然后将所得到的溶液过滤澄清，转入一个合适的容器，然后封口并高压或在90°-100℃保温半小时进行灭菌。或者，可将溶液过滤除菌后用无菌操作技术转至容器。适合包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的例子有硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用于制备一种油溶液的合适溶剂包括甘油、稀释的酒精和丙二醇。
根据本发明的洗剂包括适合应用于皮肤或眼的洗剂。一种眼用洗剂包含一种可含有一种杀菌剂的无菌水溶液，并可用类似于制备滴剂的方法制备。应用于皮肤的洗剂和搽剂也可包含一种快速干燥和冷却皮肤的药剂，如甘油或诸如蓖麻油或花生油的油。
根据本发明的乳剂、药膏或糊剂是用于外用的活性成分的半固体配剂。它们可通过在合适机器帮助下将精细分散或粉末形式的活性成分，单独或在一种水性或非水性液体的溶液或悬液中，与一种油脂或非油脂基质混合来制备。基质可包括碳氢化合物如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、一种金属皂；一种粘胶；一种自然来源的油如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物、或一种脂肪酸如硬脂酸或油酸，以及一种醇如丙二醇或聚乙二醇。配剂可含有任何合适的表面活性剂，如一种阴离子型、阳离子型或非离子型表面活性剂如脱水山梨醇酯或其聚氧乙烯衍生物等。还可以包含悬浮试剂如自然胶、纤维素衍生物或无机材料如硅质硅石(Silicaceous silicas)以及其它成分如羊毛脂。
本领域的技术人员会认识到，本发明的抗体或其片段的个体剂量的最佳量和间隔时间应取决于所治疗疾病的本质和程度、给药的形式、途径和部位、以及所治疗的特定动物，这种最佳量可用传统技术来确定。本领域的技术人员还会认识到治疗的最佳过程，即在限定的天数内本发明的抗体或其片段的给药次数，可以由本领域的技术人员用治疗确定实验的传统过程来确定。
不需要进一步阐述，可以相信本领域的技术人员能够使用前面的介绍最大限度地应用本发明。因此，下面的解释仅为说明性的实施例，而不是以任何方式对对本发明范围进行限制。
胶囊组合物本发明的一种胶囊形式的药物组合物按如下方法制备将50mg粉末状的本发明的一种抗体或其片段、100mg的乳糖、32mg的滑石和8mg的硬脂酸镁装入一个标准的双层硬明胶胶囊。
注射用非肠道组合物本发明的一种适合于注射给药形式的药物组合物按如下方法制备将本发明的一种抗体或其片段按1.5％的重量搅拌溶于含10％体积丙二醇的水中，溶液过滤除菌。
药膏组合物本发明的抗体或其片段1.0克。
白色软石蜡至100.0克。
将本发明的抗体或其片段分散在小体积的载剂中，制成一种光滑的、均质的产物。然后将此分散物装入可折叠的金属管中。
局部乳剂组合物本发明的抗体或其片段1.0克。
Polawax GP 200 20.0克。
脱水羊毛脂2.0克。
白色蜂蜡2.5克。
羟基苯甲酸甲酯0.1克。
蒸馏水至100.0克。
将polawax、蜂蜡和羊毛脂在60℃一起加热。加入羟基苯甲酸甲酯溶液，并高速搅拌使其均一。然后将温度降至50℃。接着加入本发明的抗体或其片段，并使其完全分散，低速搅拌使组合物冷却。
局部洗剂组合物本发明的抗体或其片段1.0克。
脱水山梨醇单月桂酸酯0.6克。Polysorbate 200.6克。
鲸蜡硬脂醇(Cetostearyl Alcohol)1.2克。甘油6.0克。
羟基苯甲酸甲酯0.2克。
纯净水B.P.至100.00ml。(B.P.＝British Pharmacopeia)将羟基苯甲酸甲酯和甘油在75℃溶于70ml水中。将脱水山梨醇单月桂酸酯、Polysorbate 20和鲸蜡硬脂醇一起在75℃融化，并加入到水溶液中。将所得到的乳浊液混匀，连续搅拌使其冷却，将本发明的抗体或其片段用剩余的水制成悬液加入其中。将整个悬液搅拌至均一。
眼用滴剂组合物本发明的抗体或其片段0.5克。
羟基苯甲酸甲酯0.01克。
羟基苯甲酸丙酯0.04克。
纯净水B.P.至100.00ml。
将羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯在75°溶于70ml纯净水中，并使所获得的溶液冷却。然后加入本发明的抗体或其片段，将溶液滤过一个滤膜(0.022um孔径)进行除菌，并无菌装入一个合适的无菌容器中。
用于吸入给药的组合物对于一个容积为15-20ml的气雾剂容器将10mg本发明的抗体或其片段与0.2％-0.5％的润滑剂如polysorbate 85或油酸混合，并将此混合物分散于一种推进剂如氟利昂中，优选分散于1，2二氯四氟乙烷和二氟氯甲烷的组合物中，并将其置于一个既适合于鼻吸入给药又适合于口吸入的气雾剂容器中。用于装在一个容积为15-20ml的气雾剂容器中吸入给药的组合物将10mg本发明的抗体或其片段溶于乙醇(6-8ml)中，加入0.1-0.2％的润滑剂，如polysorbate 85或油酸；并分散于一种推进剂如氟利昂中，优选分散于1，2二氯四氟乙烷和二氟氯甲烷的组合物中，并将其置于一个适合于鼻吸入给药或适合于口吸入的气雾剂容器中。
本发明的抗体和药物组合物特别适用于非肠道给药，即皮下、肌肉或静脉。用于非肠道给药的组合物通常包括本发明的抗体或其片段的一种溶液或其溶解在一种可接受的载剂中的混合物，优选溶解在一种水性载剂中。可以使用多种水载剂，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘油等等。这些溶液为无菌的，且一般不含颗粒性物质。这些溶液可用常规的众所周知的灭菌技术进行灭菌。当需要接近生理环境时，组合物可含有药学上可接受的辅助物质，如pH调节试剂和缓冲试剂等等。在这样的药物配剂中，本发明的抗体或其片段的浓度可有很大变化，即重量从少于约0.5％，一般或至少约1％，到多至15％或20％，并根据所选用的特定给药模式，主要基于流体体积、黏度等进行选择。
因此，本发明的一种用于肌肉注射的药用组合物可以制备成包含1mL无菌的缓冲水和50mg本发明的抗体或其片段的组合物。与此类似，本发明的用于静脉输注的药用组合物可制备成含有250mL无菌Ringer’s溶液和150mg本发明的抗体或其片段的组合物。用来制备非肠道给药组合物的实际方法是众所周知的或对于本领域的技术人员来说是清楚的，并且在例如《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Science)，15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania中有更详细的介绍，在此引入作为参考。
本发明的抗体(或其片段)可以冷冻干燥用于保藏，并在使用前用合适的载剂重配。这种技术对传统的免疫球蛋白是有效的，本领域熟知的冷冻干燥技术和重配技术都可以使用。
根据所预期的结果，本发明的药用组合物可进行给药用于预防和/或治疗。在应用于治疗时，对已经患有某种疾病的病人以足够治愈或至少部分缓解该疾病或其症状的剂量的组合物进行给药。在用于预防时，用含有本发明的抗体或其混合物的组合物对还没有处于某种疾病状态的病人进行给药以增强该病人的抵抗力。
本发明的药用组合物可由主治医生选择剂量水平和模式进行单独或复合给药。在任何情况下，本发明的药用组合物都应提供足够有效治疗病人剂量的改变抗体(或其片段)。
还应当指出，本发明的抗体可用于设计和合成能在与抗体相同的治疗中使用的肽或非肽类化合物(模拟物)。见例如Saragovi等，《科学》(Science)，253卷，792-795页，(1991)。保藏表达CE9.1的XL1 Blue菌株、TCAE6中的抗CD4已经在ATCC进行了保藏，保藏号为69030。保藏日期为1992年7月9日。
申请人及其受让人知道如果这些培养物在以此授权的专利到期、最后一次索取该培养物后5年或保藏30年之前的任一最长的期限之内死亡，他们有义务将培养物更新，并有义务在该专利的出版物中通告该保藏，在上述期限之内公众应可无条件地获得该保藏物。在此之前，该保藏物根据37C.F.R.14部分和35U.S.C.112部分应可为专利局长获得。
其它内容见后面的权利要求书。
序列表(1)一般信息(i)申请人Hanna，NabilNewman，Roland A.
Reff，Mitchell E.(ii)发明名称用于人治疗的重组抗CD4抗体(iii)序列数59(iv)通讯地址(A)联系人BURNS，DOANE，SWECKER & MATHIS(B)街道699 Prince Street(C)城市Alexandria(D)州VA(E)国家USA(F)邮政编码22314-3187(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，#1.30版(vi)现申请数据(A)申请号US 08/523,894(B)申请日06-SEP-1995(C)分类号(viii)代理人/事务所信息(A) 姓名Teskin，Robin L.
(B)登记号35,030(C)参考/摘要号012712-165(ix)电讯信息(A)电话703-836-6620(B)电传703-836-2021(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度420碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)生物体猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段CE9.1的轻链可变区(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置4..420(ix)特征(A)名称/关键mat-peptide(B)位置61..420(xi)序列表述SEQ ID NO1GAC ATG AAA CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCC CCC AGA 48Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg-19 -15 -10 -5TGG GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG GCG GGC CCA GGA CTG GTG 96Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ala Gly Pro Gly Leu Val1 5 10AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC 144Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser15 20 25ATC AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG 192Ile Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys30 35 40GGA CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT 240Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn45 50 55 60TAC AAT CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACG TCC 288Tyr Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser65 70 75AAG AAC CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG 336Lys Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr80 85 90GCC GTC TAT TAC TGT GCG AGT AAT ATA TTG AAA TAT CTT CAC TGG TTA 384Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu95 100 105TTA TAC TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC 420Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser110 115 120(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度139个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑构型线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列表述SEQ ID NO2Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp-19 -15 -10 -5Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ala Gly Pro Gly Leu Val Lys1 5 10Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile15 20 25Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly30 35 40 45Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr50 55 60Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys65 70 75Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala80 85 90Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu95 100 105Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser110 115 120(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度387碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)生物体猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段CE9.1的重链可变区(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置4..387(ix)特征(A)名称/关键mat-peptide(B)位置61..387(xi)序列表述SEQ ID NO3ACC ATG GCC TGG GCT CTG CTG CTC CTC GGC CTC CTT GCT CAC TTT ACA48Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ala His Phe Thr-19 -15 -10 -5GAC TCT GCG GCC TCC TAT GAG TTG AGT CAG CCT CGC TCA GTG TCC GTG96Asp Ser Ala Ala Ser Tyr Glu Leu Ser Gln Pro Arg Ser Val Ser Val1 5 10TCC CCA GGA CAG ACG GCC GGG TTC ACC TGT GGG GGA GAC AAC GTT GGA 144Ser Pro Gly Gln Thr Ala Gly Phe Thr Cys Gly Gly Asp Asn Val Gly15 20 25AGG AAA AGT GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG 192Arg Lys Ser Val Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Pro Gln Ala Pro Val30 35 40CTG GTC ATC TAT GCT GAC AGC GAA CGG CCC TCA GGG ATC CCT GCG CGA 240Leu Val Ile Tyr Ala Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg45 50 55 60TTC TCT GGC TCC AAC TCA GGG AAC ACC GCC ACC CTG ACC ATC AGC GGG 288Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly65 70 75GTC GAG GCC GGG GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG GTG TGG GAC AGT 336Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser80 85 90ACT GCT GAT CAT TGG GTC TTC GGC GGA GGG ACC CGG CTG ACC GTC CTA 384Thr Ala Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu95 100 105GGT 387Gly(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度128个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑构型线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列表述SEQ ID NO4Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ala His Phe Thr Asp-19 -15 -10 -5Ser Ala Ala Ser Tyr Glu Leu Ser Gln Pro Arg Ser Val Ser Val Ser1 5 10Pro Gly Gln Thr Ala Gly Phe Thr Cys Gly Gly Asp Asn Val Gly Arg15 20 25Lys Ser Val Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Pro Gln Ala Pro Val Leu30 35 40 45Val Ile Tyr Ala Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val65 70 75Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Thr80 85 90Ala Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly95 100 105(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度702碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)生物体Homo sapiens(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段CE9.1中的λ可变区和恒定区(ix)特征(A)名称/关键CDS
(B)位置1..702(ix)特征(A)名称/关键mat-peptide(B)位置1..702(xi)序列表述SEQ ID NO5ATG GCC TGG GCT CTG CTG CTC CTC GGC CTC CTT GCT CAC TTT ACA GAC 48Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ala His Phe Thr Asp1 5 10 15TCT GCG GCC TCC TAT GAG TTG AGT CAG CCT CGC TCA GTG TCC GTG TCC 96Ser Ala Ala Ser Tyr Glu Leu Ser Gln Pro Arg Ser Val Ser Val Ser20 25 30CCA GGA CAG ACG GCC GGG TTC ACC TGT GGG GGA GAC AAC GTT GGA AGG 144Pro Gly Gln Thr Ala Gly Phe Thr Cys Gly Gly Asp Asn Val Gly Arg35 40 45AAA AGT GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG CTG 192Lys Ser Val Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Pro Gln Ala Pro Val Leu50 55 60GTC ATC TAT GCT GAC AGC GAA CGG CCC TCA GGG ATC CCT GCG CGA TTC 240Val Ile Tyr Ala Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe65 70 75 80TCT GGC TCC AAC TCA GGG AAC ACC GCC ACC CTG ACC ATC AGC GGG GTC 288Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val85 90 95GAG GCC GGG GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG GTG TGG GAC AGT ACT 336Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 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Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Leu Gly Lys*465(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度1404碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)生物体Homo sapiens(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有E突变的γ4重链(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..1404(ix)特征(A)名称/关键mat-peptide(B)位置1..1404(xi)序列表述SEO ID NO9ATG AAA CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCC CCC AGA TGG48Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG96Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys20 25 30CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC ATC 144Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile35 40 45AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG GGA 192Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly50 55 60CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT TAC240Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr65 70 75 80AAT CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACG TCC AAG288Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys85 90 95AAC CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG 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35 40 45Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly50 55 60Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr65 70 75 80Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys85 90 95Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala100 105 110Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu145 150 155 160Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195 200 205Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn210 215 220Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser225 230 235 240Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Leu Gly Lys*465(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度1404碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)生物体Homo sapiens(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有P和E突变的γ4重链(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..1404(ix)特征(A)名称/关键mat-peptide(B)位置1..1404(xi)序列表述SEO ID NO11ATG AAA CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCC CCC AGA TGG48Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15GTC TTG TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG96Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys20 25 30CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC AGT GTC TCT GGT GGC TCC ATC 144Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile35 40 45AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG GGA 192Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Phe Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly50 55 60CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC AGT GGT GGG GGC ACC AAT TAC 240Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr65 70 75 80AAT CCC TCC CTC AAC AAT CGA GTC TCC ATT TCA ATA GAC ACG TCC AAG 288Asn Pro Ser Leu Asn Asn Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys85 90 95AAC CTC TTC TCC CTG AAA CTG AGG TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCC 336Asn Leu Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala100 105 110GTC TAT TAC TGT GCG AGT AAT ATA TTG AAA TAT CTT CAC TGG TTA TTA 384Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Leu His Trp Leu Leu115 120 125TAC TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCT AGC ACC AAG 432Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140GGG CCA TCC GTC TTC CCC CTG GCG CCC TGC TCC AGG AGC ACC TCC GAG 480Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu145 150 155 160AGC ACA GCC GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG 528Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165170 175GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC 576Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG 624Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195 200 205GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACG AAG ACC TAC ACC TGC AAC 672Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn210 215 220GTA GAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AGA GTT GAG TCC 720Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser225 230 235 240AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCA TGC CCA GCA CCT GAG TTC GAG GGG 768Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly245 250 255GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT CTC ATG 816Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACG TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAG 864Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln275 280 285GAA GAC CCC GAG GTC CAG TTC AAC TGG TAG GTG GAT GGC GTG GAG GTG 912Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACG TAC 960His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAC GGC1008Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GGC GTC CCG TCC TCC ATC1056Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340 345 350GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAG CCA CAG GTG1104Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365TAG ACC CTG CCC CCA TCC CAG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC1152Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG1200Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC1248Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AGG CTA ACC GTG1296Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 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Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu145 150 155 160Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195200 205Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn210 215 220Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser225 230 235 240Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Leu Gly Lys*465(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH1前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO13ACTAAGTCGA CATGGACTGG ACCTGG 26(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征
(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH2前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO14ACTAAGTCGA CATGGACATA CTTTGTTCCA C31(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH3前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO15ACTAAGTCGA CATGGAGTTT GGGCTGAG C 29(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH4前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO16ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCT T 31(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH5前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO17ACTAAGTCGA CATGGGGTCA ACCGCCATCC T 31(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH6前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO18ACTAAGTCGA CATGTCTGTC TCCTTCCTCA T 31(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Mlu I位点的VH1前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO19GGCAGCAGCY ACGCGTGCCC ACTCCGAGGT30(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置
(A)染色体/片段含有Mlu I位点的VH2前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO20GACCGTCCCG ACGCGTGTYT TGTCCCAGGT30(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Mlu I位点的VH3前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO21GCTATTTTCA CGCGTGTCCA GTGTGAG 27(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Mlu I位点的VH4前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO22GCGGCTCCCA CGCGTGTCCT GTCCCAG 27(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Mlu I位点的VH5前导序列(xi)序列表述SEQ ID NO23GGCTGTTCTC ACGCGTGTCT GTGCCGAGGT30(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Xho I位点的VH1、3a、5引物(xi)序列表述SEQ ID NO24CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG 23(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度23碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Xho I位点的VH2引物(xi)序列表述SEQ ID NO25CAGGTCAACT TACTCGAGTC TGG 23(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Xho I位点的VH3b引物(xi)序列表述SEQ ID NO26GAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG 23(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Xho I位点的VH4引物(xi)序列表述SEQ ID NO27CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 23(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Xho I位点的VH6引物(xi)序列表述SEQ ID NO28CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG 23(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(vi)原始来源
(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Nhe I位点的IgG1-4引物(xi)序列表述SEQ ID NO29GGCGGATGCG CTAGCTGAGG AGACGG26(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度38碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Bgl II位点的κ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO30ATCACAGATC TCTCACCATG GTGTTGCAGA CCCAGGTC 38(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度37碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Bgl II位点的κ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO31ATCACAGATC TCTCACCATG GRGWCCCCWG CKCAGCT37(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度41碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Bgl II位点的κ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO32ATCACAGATC TCTCACCATG GACATGAGGG TCCCCGCTCA G 41(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度41碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有BglII位点的κ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO33ATCACAGATC TCTCACCATG GACACVAGGG CCCCCACTCA G 41(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Bgl II位点的λ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO34ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGGCTC TGCTGCTCC 39(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Bgl II位点的λ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO35ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGGCTC CACTACTTC 39(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Bgl II位点的λ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO36ATCACAGATC TCTCACCATG ACCTGCTCCC CTCTCCTCC 39(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Bgl II位点的λ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO37ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGACTC CTCTCTTTC 39(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)长度38碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(vi)原始来源
(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Bgl II位点的λ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO38ATCACAGATC TCTCACCATG ACTTGGACCC CACTCCTC 38(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Kpn 1和BsiW 1位点的κ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO39CCGTTTGATT TCCAGCTTGG TACCTCCACC GAACGT 36(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Kpn 1和BsiW 1位点的κ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO40TGCAGCATCC GTACGTTTGA TTTCCAGCTT30(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Hind III和Kpn 1位点的κ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO41ACCTAGGACG GTAAGCTTGG TACCTCCGCC30(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Kpn 1位点的λ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO42ACCTAGGACG GTCASSTTGG TACCTCCGCC GAACAC36(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(vi)原始来源(A)生物体人或猴(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段含有Avr II位点的λ轻链引物(xi)序列表述SEQ ID NO43CTTGGGCTGA CCTAGGACGG TCAGCCG 27(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH1重链可变区(xi)序列表述SEQ ID NO44CCATGGACTG GACCTGG 17(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH2重链可变区(xi)序列表述SEQ ID NO45ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH3重链可变区(xi)序列表述SEQ ID NO46CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH4重链可变区(xi)序列表述SEQ ID NO47ATGAAACACC TGTGGTTCTT 20(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH5重链可变区(xi)序列表述SEQ ID NO48ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链无(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段VH6重链可变区(xi)序列表述SEQ ID NO49ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT 20(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)长度16碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段IgM重链恒定区(xi)序列表述SEQ ID NO50TTGGGGCGGA TGCACT 16(2)SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段IgG1-4重链恒定区(xi)序列表述SEQ ID NO51GATGGGCCCT TGGTGGA 17(2)SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段κ轻链可变区(xi)序列表述SEQ ID NO52GATGACCCAG TCTCCAKCCT C21(2)SEQ ID NO53的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段λ轻链可变区(xi)序列表述SEQ ID NO53CTCAYTYRCT GCMCAGGGTC C 22(2)SEQ ID NO54的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(viii)基因组中的位置(A))染色体/片段κ轻链恒定区(xi)序列表述SEQ ID NO54AAGACAGATG GTGCAGCCA19(2)SEQ ID NO55的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iv)反义链有(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段λ轻链恒定区(xi)序列表述SEQ ID NO55GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20(2)SEQ ID NO56的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段人γ4恒定区的PCR引物(xi)序列表述SEQ ID NO56GGGGGGATCC TCATTTACCC AGAGACAGGG30(2)SEQ ID NO57的信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段人γ4恒定区的PCR引物(xi)序列表述SEQ ID NO57GGGGGCTAGC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT C 31(2)SEQ ID NO58的信息(i)序列特征(A)长度96碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段人γ4的PCR诱变(xi)序列表述SEQ ID NO58CCGGGAGATC ATGAGAGTGT CCTTGGGTTT TGGGGGGAAC AGGAAGACTG ATGGTCCCCC 60CTCGAACTCA GGTGCTGGGC ATGGTGGGCA TGGGGG 96(2)SEQ ID NO59的信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段人γ4的PCR诱变(xi)序列表述SEQ ID NO59TCCTCAGCTA GCACCAAGGG GCCATCC 2权利要求
1.一种人CD4特异的嵌合抗体，它包含针对人CD4制备的一种旧世界猴单克隆抗体的重链和轻链可变区序列及人的重链和轻链恒定区序列。
2.权利要求1的嵌合抗体，其中人的重链恒定区序列选自γ1同种型、γ4同种型或236位亮氨酸取代谷氨酸和/或229位丝氨酸取代脯氨酸的突变的γ4同种型。
3.权利要求1的嵌合抗体，其中所说的重链和轻链可变区抗原结合序列表述于图1和图2。
4.缺乏或显示比γ1嵌合抗体降低的Fc受体结合活性、补体固定能力、改变的药代动力学模式、和/或体内T细胞排除活性的权利要求1的嵌合抗体。
5.改变或调节CD4相关的免疫功能包括在T细胞中诱导无反应和凋亡的权利要求1的嵌合抗体。
6.一种选自CE9.1、CE9γ4、CE9γ4λK、CE9γ4E和CE9γ4PE的抗CD4嵌合抗体。
7.一种编码根据权利要求1的嵌合抗体的重组DNA。
8.一种编码根据权利要求2的嵌合抗体的重组DNA。
9.一种编码根据权利要求3的嵌合抗体的重组DNA。
10.一种编码根据权利要求4的嵌合抗体的重组DNA。
11.一种编码和提供表达根据权利要求6的嵌合抗体的重组DNA。
12.一种制备CD4特异的嵌合抗体的方法，包括在一种重组宿主细胞中表达权利要求7的重组DNA。
13.一种制备CD4特异的嵌合抗体的方法，包括在一种重组宿主细胞中表达权利要求8的重组DNA。
14.一种制备CD4特异的嵌合抗体的方法，包括在一种重组宿主细胞中表达权利要求9的重组DNA。
15.一种制备CD4特异的嵌合抗体的方法，包括在一种重组宿主细胞中表达权利要求10的重组DNA。
16.一种制备CD4特异的嵌合抗体的方法，包括在一种重组宿主细胞中表达权利要求11的重组DNA。
17.一种治疗或预防CD4相关疾病的方法，包括用一种治疗或预防上有效剂量的根据权利要求1的嵌合抗体进行给药。
18.一种治疗或预防CD4相关疾病的方法，包括用一种治疗或预防上有效剂量的根据权利要求2的嵌合抗体进行给药。
19.一种治疗或预防CD4相关疾病的方法，包括用一种治疗或预防上有效剂量的根据权利要求3的嵌合抗体进行给药。
20.一种治疗或预防CD4相关疾病的方法，包括用一种治疗或预防上有效剂量的根据权利要求4的嵌合抗体进行给药。
21.一种治疗或预防CD4相关疾病的方法，包括用一种治疗或预防上有效剂量的根据权利要求6的嵌合抗体进行给药。
22.权利要求16的方法，其中所说的CD4相关疾病是一种自身免疫失调。
23.权利要求17的方法，其中所说的CD4相关疾病是一种自身免疫失调。
24.权利要求18的方法，其中所说的CD4相关疾病是一种自身免疫失调。
25.权利要求19的方法，其中所说的CD4相关疾病是一种自身免疫失调。
26.权利要求20的方法，其中所说的CD4相关疾病是一种自身免疫失调。
27.权利要求21的方法，其中所说的自身免疫失调是类风湿性关节炎。
28.权利要求22的方法，其中所说的自身免疫失调是类风湿性关节炎。
29.权利要求23的方法，其中所说的自身免疫失调是类风湿性关节炎。
30.权利要求24的方法，其中所说的自身免疫失调是类风湿性关节炎。
31.权利要求25的方法，其中所说的自身免疫失调是类风湿性关节炎。
32.权利要求17的方法，其中所说的疾病是一种选自白血病、淋巴瘤、移植物抗宿主疾病、哮喘、移植排斥和HIV感染的非自身免疫失调。
33.权利要求18的方法，其中所说的疾病是一种选自白血病、淋巴瘤、移植物抗宿主疾病、哮喘、移植排斥和HIV感染的非自身免疫失调。
34.权利要求19的方法，其中所说的疾病是一种选自白血病、淋巴瘤、移植物抗宿主疾病、哮喘、移植排斥和HIV感染的非自身免疫失调。
35.权利要求21的方法，其中所说的疾病是一种选自白血病、淋巴瘤、移植物抗宿主疾病、哮喘、移植排斥和HIV感染的非自身免疫失调。
36.权利要求17的方法，其中所说的疾病由CD4+细胞介导或有CD4+细胞参与。
全文摘要
本发明介绍了人CD4抗原特异的嵌合抗体、编码它们的DNA、含有它们的药物组合物及其作为治疗试剂的应用。这些嵌合抗体含有旧世界猴的可变区序列和人恒定区序列,优选含有人γ1、γ4或其突变形式。这些抗体具有所需的治疗特性,包括低免疫原性、降低的(或缺乏)T细胞排除活性、对人CD4的高亲和力和增强的稳定性(体内半衰期)。
文档编号C07K16/00GK1200737SQ96197943
公开日1998年12月2日 申请日期1996年9月5日 优先权日1995年9月6日
发明者N·汉纳, R·A·纽曼, M·E·雷夫 申请人:艾德药品公司