专利名称：生长激素和血清白蛋白重组融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组融合蛋白、生长激素(GH)、血清白蛋白和酵母中的蛋白产物。
人血清白蛋白(HSA)是一具有585个氨基酸的蛋白质，它是血清中渗透压的一个重要组成部分，而且起内源和外源配体的载体的作用。目前，临床上所用的HSA是从人的血浆中提取出来的。微生物体内重组HA(rHA)的生产已在EP 330 451和EP 361 991中公开。
白蛋白作为一种载体分子的作用及其惰性性质对它用作一稳定剂和多肽的运载蛋白是必需的特征。白蛋白作为融合蛋白的组份，以稳定其它蛋白质的应用已在WO 93/15199，WO 93/15200和EP 413 622中公开。HSA的N-端片段融合到多肽上去的用途亦已在EP 399 666中公开。融合到所说多肽上去是通过遗传操作的方法，使得编码HSA的DNA或其片段与编码所说多肽的DNA连接。然后，用该融合核苷酸转化或转染合适的宿主，从而使得合适的质粒表达融合多肽。Nomura等在1995年曾尝试在酿酒酵母中表达人的载脂蛋白E成和HSA或HSA的片段的融合蛋白，并利用HSA的前序列直接分泌。发现当和HSA全长融合时导致介质中分泌的融合蛋白量低(最大产量为每升6.3mg)，而与HSA的1到198个氨基酸序列或1至390个氨基酸序列融合时，导致融合蛋白不分泌到介质中。
人生长激素(见Strobl和Thomas 1994年的综述)由191个氨基酸的单肽组成，其内部通过两个二硫键形成交联。每一个hGH分子可与两个hGH受体分子结合以便于信号传导(Cunningham等1991；de Vos等1992)。hGH分子的C-末端与结合第一个受体分子相关，但其N-末端与受体的结合的相关程度是未知的。该激素由下丘脑控制下的前体垂叶腺分泌，它引起体内大范围的生长促进效应。临床上，hGH用于治疗垂体性侏儒病，儿童期慢性肾功能不全，骨折和烧伤。现在用于治疗的hGH的生产方法是从人脑垂体腺中提取，或者在EP 127 305(Genentech)中公开的大肠杆菌(E.Coli)中重组表达，或者为哺乳动物细胞培养中的重组表达(Zeisel等，1992)。
除此之外，hGH已在酵母细胞内表达(Tokunaga等，1995)，此生物体可提供一个EP 60 057(Genentech)中揭示的方法的一种变通形式。Tsiomenko等报道了酵母MFα-1前引导序列在酵母中分泌hGH中的作用。将此前导序列的前端部分(pre-portion)与hGH基因结合导致hGH在外周质和液泡中的积累，而前导序列的前部分(pro-portion)与hGH基因的接合则导致定位于细胞内的非糖基化前体的表达。只有在前导序列两部分均与hGH基因结合，才能使hGH分泌到培养基中。其它的分泌信号(前序列)同样无助于hGH分泌到培养基中，除非用酵母自身的原序列(pro sequence)，说明这种原序列对酵母中hGH的分泌是关键的。
在人体中，hGH以脉冲的形式分泌到血液中，其在循环过程中的半衰期少于20分钟(Haffner等，1994)。该激素的清除主要通过肝和肾中的代谢，成人中的清除速度快于儿童(Kearns等，1991)。hGH不足的治疗一般持续六到二十四个月，其间每星期肌肉注射三次或者每天进行皮下注射。这种频繁的治疗方法是必需的，因为该分子的半衰期短。
Poznansky等1988年通过将hGH和猪源或人源的血清白蛋白(HSA)缀合成一相当大的缀合体(约180KD)的方法延长了猪生长激素的半衰期。利用交联剂戊二醛进行的化学反应，使得平均每两个白蛋白分子和六个生长激素分子缀合。所产生的180KD的缀合体在小鼠中的半衰期达到2到3小时，而没有发生缀合的生长激素在小鼠中的半衰期只有五分钟。活性测定表明缀合体在体外保持全部活性，甚至可能增加了活性，但在体内无活性。
本发明涉及关将一个白蛋白分子，或其变种或片段与一个生长激素分子，或其变种或片段融合，所形成的融合蛋白较未融合的生长激素延长了循环半衰期。为方便起见，只提到人白蛋白(HA)和人生长激素(hGH)，但其它脊椎动物的白蛋白和生长激素均包括在内。优选地，含有HA，或其变种或片段的N-末端部分和hGH，或其变种，或片段的C-末端部分的融合蛋白可使受体结合的所有可能的负效应最小化。或者，含有HA，或其一个变种，或其片段的C-末端部分和hGH，或其一个变种，或其片段的N-末端部分的融合蛋白同样具信号传导的作用。一般地，此多肽只具有一个HA来源的区域和一个GH来源的区域。
另外，本发明中的融合蛋白在其两个融合部分间还具有一个接头肽，以便于融合蛋白两组分间有较大的物理隔离(physical separation)，从而使hGH部分最大可能地与hGH受体结合。接头肽由氨基酸组成使得其是柔韧性或刚性的。
接头序列可通过一种蛋白酶或化学方法切割，以产生生长激素相关的部分。优选地，此蛋白酶可由宿主天然产生，如啤酒糖酵母蛋白酶Kex2或相当的蛋白酶。此后，本发明还进一步提供通过在一合适的宿主中表达编码本发明中多肽的聚核苷酸以制备生长激素，或其变种，或其片段的方法及切割可切割的接头以产生GH-型复合物和从宿主培养基中以更纯的形式获得GH-型复合物的方法。
发现本发明中的多肽在溶液中的稳定性明显高于hGH。后者在溶液中4℃下贮存一个月后迅速失活。现在市售hGH为冻干粉剂。
合适地，融合多肽是由酵母，微生物，如细菌，人细胞系或酵母以重组分子的形式分泌产生。优选地，此多肽可从宿主中分泌出来。发现将编码hGH的序列融合到编码HA序列的5′-端或3′端，酵母均可以分泌此融合蛋白，而无需一种酵母来源的原序列(pro sequence)。此发现是惊人的，因为其他工作者们发现酵母来源的原序列对酵母有效分泌hGH是必需的。如Hiramitsu等1990年和1991年分别发现微小毛霉(Mucor pusillus)菌株凝乳酶前原引导序列(pre-pro leader)中原序列(pro sequence)的N-端部分是重要的。其他的作者，在用MFα-1信号分泌hGH时，总是包括MFα-1的原序列。此原序列被认为是作为一种分子内的分子伴侣而有助于hGH的折叠过程。本发明显示HA或HA的片段可行使相似的功能。
因而，本发明中的一个具体的实施方案包括酵母中有效地直接分泌编码信号序列的DNA构建体，尤其是酵母来源信号序列(特别是与酵母宿主有同源性的信号序列)，和本发明的第一方面的融合分子，其中信号和成熟的多肽间没有酵母来源的原序列存在。
啤酒糖酵母(S.cerevisiae)转化酶的信号酵母来源信号的优选的实施例子。
不考虑Poznansky等1988年利用化学交联方法连接两个分别制备的那种缀合体。
白蛋白或hGH可以分别是正常HSA/rHA(下文称为“HA”)或hGH的一个变体。在这些“变体”中，包括在保守区域或非保守区域的插入，缺失和取代，但这些变化不能明显改变白蛋白的一个或多个肿胀的(oncotic)有用的配体结合和非免疫原的特征，或在hGH中则是其非免疫原性及可结合并激活hGH受体的能力。特别地，将人白蛋白和人白蛋白片段中天然发生的多态性变体包括在内，如在EP 322 094中公开的那些片段(称为HA(1-n)，其中n指369到419)。白蛋白或生长激素可来自于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，如人、牛、羊、猪、鸡(hen)，或鲑鱼。融合蛋白中的白蛋白和GH部分可分别来自于不同的动物。
“保守性替代物”用指在诸如甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)；缬氨酸(Val)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)；天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)；天冬酰氨(Asn)，谷氨酰氨(Gln)；丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)；赖氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)；和苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)这些组中的替换。只要本领域内认为允许插入和删除是惯常的，这些变体与同一长度的正常HA或hGH具有至少75％的序列同源性(优选地是至少具80％，90％，95％，或99％的同源性)，而且比其它长度的正常HA或hGH更具同源性。概括地说，一HA变体至少具100个氨基酸长度，优选地至少有150个氨基酸长度。此HA变体至少包含或是由HA的一个完整的结构域组成，如结构域1(1-194)，2(195-387)，3(388-585)，1+2(1-387)，2+3(195-585)，或1+3(1-194，+388-585)。每个结构域本身由两个同源亚结构域组成，这些亚结构域称为1-105，120-194，195-291，316-387，388-491，和512-585，包括赖氨酸(Lys)106至谷氨酸(Glu)199，谷氨酸(Glu)292至缬氨酸(Val)315和谷氨酸(Glu)492至丙氨酸(Ala)511区的氨基酸残基的带有柔性的间-亚结构域接头区域。优选地，融合蛋白的HA部分至少包含一个HA的亚结构域，或结构域，或它们的保守性修饰部分。如果此融合蛋白基于亚结构域，部分或全部的毗邻的接头优选地用于连接hGH组成成分。hGH的变体应具有GH活性，一般至少具有十个氨基酸(尽管一些作者发现仅具四个残基时同样具活性)，优选地至少有20个氨基酸，优选地至少有50，100，150，180，或191个氨基酸长，并优选地保留其两个内部二硫键的半胱氨酸(Cys)。
本发明中融合分子的分子量一般低于100KD，如低于90KD，或70KD。因而它们较Poznansky等的180KD的缀合体(见前文)要小得多，而后者体内是无活性的。正常情况下，该融合蛋白的分子量至少有20KD，通常至少有30KD，或50KD。大多数融合蛋白的分子量大小介于60至90KD间。
本发明的第二个主要部分是提供转化酵母以表达本发明中的融合蛋白。
除转化宿主细胞自身外，本发明还考虑在一营养介质中进行这些细胞的培养，优选地单克隆(克隆均一的)培养，或一来自于单克隆培养物的培养。特别是一旦多肽分泌，培养基中同时具有此多肽和这些细胞，或者通过过滤或离心的方法将这些细胞除去。
已知有许多表达系统，包括细菌(如大肠杆菌(E.Coli)，和枯草芽孢杆菌(B.Subtitis))，酵母菌(如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、乳克鲁维氏酵母(K.lactis)、和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris))，丝状真菌(如曲霉菌属(Aspergillus))，植物细胞，动物细胞及昆虫细胞。
所需蛋白通过便捷的方式产生，如从插入到宿主染色体或一自游离质粒的编码序列中产生。
转化所需蛋白的编码序列到酵母中去可用通常的方法，如电穿孔。用电穿孔转化酵母的方法已被Becker和Guarente公开，(《酶学方法(MethodsEnzymol)》1990年，第194期第182页)。
成功转化的细胞，即含有本发明中DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定。如，细胞中表达构建体的引入将生长产生所需的多肽。这些细胞经收集并裂解，可用Southern 1975年发表在《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》第98期第503页的方法，或Berent等1985年发表于《生物技术(Biotech)》第三期第208页的方法来检查其DNA中该DNA的存在与否。或者，上清中的蛋白可用抗体进行检测。
有用的酵母质粒载体包括pRS 403-406和pRS 413-416，这些载体一般可从Stratagene Cloning Systerns获得，(Stratagene Cloning systerns，LaJolla，CA92037，USA)。质粒pRS 403，pRS 404，pRS 405和pRS 406为酵母整合型质粒(YIp)，并结合有酵母选择性标记HIS3，TRP1，LEU2和URA3。质粒pRS 413-416为酵母着丝粒质粒(YCp)。
已构建了各种通过互补粘性末端将DNA可操作地连接到载体上去的方法。如，在DNA片段上加上互补的同聚体序列，从而插入到载体DNA中去。然而，载体和DNA片段通过在互补的同聚体尾间形成氢键连结以组成重组DNA分子。
具有一个或多个限制性位点的合成接头提供了将DNA片段连到载体上去的另一种方法。通过限制性内切酶降解的DNA片段用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌(E.Coli)DNA聚合酶I处理，这些酶以它们的3′- 5′核酸外切酶活性除去3′-单链的突出末端，然后用其聚合酶活性补平3′-凹端。
这些活性的联合使用从而产生了具平末端的DNA节段。然后此平末端的节段与摩尔数过量的多的接头分子在可以催化平末端DNA分子连接的酶(如噬菌体T4 DNA连接酶)的存在下温育。因此，反应产物为末端携有同聚体接头序列的DNA节段。然后，将此DNA节段用一合适的限制性酶切割，并连到用酶切并产生和这些DNA节段的相容的末端的表达载体上。
具有各种限制性内切酶识别位点的合成接头已商品化，可通过包括国际生物技术公司(International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，USA)在内的各种途径获得。
若需要，如，制备HA的变体，修饰本发明DNA的一个理想方法可用Saiki等1988年发表在《科学(Science)》第239期第487-491页的聚合酶链式反应(PCR)方法。在此方法中，待酶促扩增的DNA在其两侧分别加上了两个特异的寡核苷酸引物，而引物本身可掺入该扩增的DNA中。所说的特异引物可有限制性内切酶识别位点，可用本领域周知的方法将之克隆到表达载体中去。
本发明中所用的能用于表达融合蛋白的宿主酵母菌示范属为毕赤氏酵母属(Pichia(Hansenula))，酿酒酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母菌属(Kluyverornyces)，念珠菌属(Candida)，圆酵母属(Torulopsis)，有孢圆酵母属(Torulaspora)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，固囊酵母属(Citeromyces)，(Pachysolen)，德巴利酵母属(Debaromyces)，梅奇酵母属(Metschunikowia)，红冬孢属(Rhodosporidium)，无色担子孢子属(Leucosporidium)，葡状子囊菌属(Botryoascus)，锁掷酵母属(Sporidiobolus)，拟内孢霉属(Endomycopsis)，及类似属。优选的属选自酿酒酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，毕赤氏酵母属(Pichia)和有孢圆酵母属(Torulaspora)。其中酿酒酵母属(Saccharomyces spp)属中有酿酒酵母(S.cerevisiae)，S.italius和S.rouxill.。克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces spp.)属中有脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)，乳克鲁维酵母(K.lactis)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)。合适的有孢圆酵母属(Torulaspora)种有戴尔数氏有孢圆酵母(T.delbrueckii)。毕赤氏酵母属(汉逊酵母属)(Pichia(Hansenula)spp.)属中有P.angusta(以前为多形汉逊氏酵母(H.polymorpha))，异常毕赤氏酵母(P.anomala)(以前为异常汉逊氏酵母(H.anomala))和巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)。
转化酿酒酵母的方法已在EP 251 744，EP 258 067和WO 90/01063中概括地介绍了，所有这些均以参考文献形式并入本发明。
酿酒酵母中合适的启动子包括与PGK1基因，GAL1或GAL10基因，CYC1，PH05，TRP1，ADH1，ADH2基因，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，已糖激酶(hexokinase)，丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase)，果糖磷酸激酶(phosphofructokinase)，丙糖磷酸异构酶(triose phosphate isomerase)，磷酸葡糖异构酶(phosphoglucoseisomerase)，葡糖激酶(glucokinase)，α-配对因子外激素(α-mating factorpheromone)，a-配对因子外激素(a-mating factor pheromone)的基因有关的启动子，PRB1启动子，GUT2启动子，GPD1启动子，杂合启动子(包括5′-调控区部分与其它启动子的5′-调控区部分杂合，或与上游激活位点(如EP-A-258 067中的启动子)杂合的启动子)。
在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中用的便捷的调控启动子为nmt基因中的硫胺素阻遏型启动子(该启动子已被Maundrell在1990年的《生物化学杂志J.Biol.chem.》第265期第10857-10864中述及)和葡糖阻遏型fbp1基因的启动子(已被Hoffman和Winstion在1990年的《遗传学Genetics》第124期第807-816页中述及)。
转化Pichia以表达外源基因的方法已在如Cregg等1993年，及各种phillips专利(如US 4 857 467，以参考文献形式并入本发明)中描述，Pichia表达试剂盒已商品化，可从Invitrogen BV，Leek，Netherlands和InvitrogenCorp.，San Diego，California获得。合适的启动子包括AOX1和AOX2。
Gleeson等1986年发表于《微生物遗传学杂志》(J.Gen.Microbiol)第132期第3459-3465页的方法中包括Hansenula载体和转化的信息，合适的启动子为MOX1和FMD1；而EP 361991，Fleer等(1991)及其他一些来自于Phone-Poulenc Rorer报道则告诉人们如何在克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces spp.)中表达外源蛋白，其中合适的启动子为PGK1。
转录终止信号优选地为一真核基因的3′-侧序序列，该序列中包括合适的转录终止信号和多聚腺苷酸信号。合适的3′-侧序序列为如那些天然连接在所用的表达控制序列上的基因，即相当于启动子。或者，在优选地用酿酒酵母ADH1基因终止信号时，它们可以是不同的。
所需的融合蛋白可与一分泌型前导序列一起起始表达，该前导序列可以是任何在所选择的酵母有效的前导序列。酿酒酵母中有用的前导序列包括来自于EP-A-387 319中的配对因子α多肽(MFα-1)和杂合引导序列。这些引导序列(或信号)在成熟的白蛋白释放到周围介质中去之前即被酵母切割。而且该前导序列包括JP 62-096086(授权为91/036516)中公开的酿酒酵母转化酶(SUC2)；酸性磷酸酶(PH05)；MFα-1，β-葡聚糖酶(BGL2)和致死毒素的前序列；S.diastaticus的葡糖淀粉酶II；S.carlsbergensis的o-半乳糖苷酶(MEL1)；K.lactis中的致死毒素；和念珠菌(Candida)的葡糖淀粉酶。
本发明中的融合蛋白或其配方可通过任何传统的方法，包括非经胃肠道(如皮下或肌肉)注射或静脉输注的方法给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。
本发明中的融合蛋白可单独使用，而优选地则为与一个或多个可接受的载体一起成药物制剂的形式使用。该载体必需在与融合蛋白相容且不能对受体自身有害的意义上说是“可接受的”。典型的载体为水或盐水，它们需是无菌的，且无致热原。此制剂需是非免疫原性的；包括佐剂的疫苗型制剂不考虑。
该制剂可以单元剂量的便捷形式存在，并可通过任何药物学领域已知的方法制备。这些方法包括将融合蛋白与具有一种或多种辅助成份的载体接合到一块的步骤。概括地说，将活性成分和液相载体或细分固相载体或其两者紧密均匀结合以制备该制剂，然后，如果需要的话，将产品成形。
适合于非经胃肠道途径使用的制剂包括含水的或不含水的无菌注射液，该液含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和溶解物，使药物的渗透性与待施用受体血液中的渗透性相等；含水的和不含水的无菌悬浮液(包括悬浮剂和增稠剂)。该制剂可存在于单元剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓿瓶和小管中，在冻干(冻干法)条件下贮存，使用前即加入无菌液态载体，如注射用水。临时性注射液和悬浮液可通过无菌粉剂制备。
优选的单元剂量制备是那些包括有活性成分的日用剂量或单元，日用亚剂量或其适当的小份。
本发明中的融合蛋白用于治疗任何表现出生长激素缺乏的情况，如孤立性生长激素缺乏症(isolated growth hormone deficiency)，全垂体功能减弱(Panhypopituitarism)，颅骨内照射后(following cranial irradiation)(如，在治疗白血病或脑肿瘤中)，先天性卵巢发育不全(Turner′s-syndrome)，唐氏先天愚症(Down′s Syndrome)，子宫生长障碍(intrauterine growth retardation)，自发性生长缺陷(idiopathic growth deficiency)，慢性肾衰竭(chronic renal faiure)，软骨发育不全(achondroplasia)，雌性不孕(female infertility)和各种分解代谢紊乱。它们也可用于刺激生长，和(或)增加家畜(如牛、羊、山羊及猪)的瘦肉的比重。
该融合蛋白可与胰岛素样生长因子I(IGF-1)一起给药。
使用剂量可通过融合蛋白的效价相对于hGH的效价计算出，此时考虑融合蛋白相对于天然hGH延长的半衰期。生长激素的典型用量为每星期0.3至30.0IU/kg，如0.9至12.0IU/kg/星期，如果一年三个或七个分包剂量施用或更多。在由全长HA和全长GH融合的融合蛋白中，按照单位的相当剂量意味着使用较大重量的制剂，但施用制剂的频率可降低，如一星期两次，一星期一次或更少。
本发明优选的实施例将通过实施例和参考附图进行描述。其中
图1示编码成熟的hGH的人生长激素cDNA序列；图2示pHGH1的限制性酶切图；图3示pBST(+)的限制性酶切图和多接头的DNA序列；图4示pHGH12的构建；图5示pHGH16的构建；图6示HSAcDNA序列，特别是编码成熟蛋白的区域；图7示pHGH14的构建；图8示pHGH38的构建；图9示pHGH31的构建；图10示pHGH58或pHGH59的构建(实施例7)；图11为一具间隔区的融合蛋白的构建方案；图12药物动力学研究结果以显示小鼠静脉注射125I标记的rHA-hGH较之于hGH的清除率。所示数据为每组中的两只小鼠的数据，包括总放射活性和可通过TCA沉淀的放射活性，即其与蛋白有关而不是与游离125I有关。所计算出的hGH的清除半衰期约六分钟，而rHA-hGH融合蛋白的清除半衰期则达六十分钟，见实施例3。·-hGH(总数)■-hGH(TCA沉淀数)-rHA-hGH(总数)▲-rHA-hGH(TCA沉淀数)。
所有标准的重组DNA过程见Sambrook等1989年的叙述，不同情况时将注明。编码HSA的DNA序列来自于EP 201 239公开的cDNA。实施例1hGH cDNA的克隆。
hGH的cDNA通过PCR扩增的方法从人垂体腺cDNA文库中获得(目录号为HL1097V，(Clontech Laboratories，Inc)。两个适于hGH cDNA扩增的寡核苷酸引物HGH1和HGH2用应用生物系统380B(Applied Biosystems380B)寡核苷酸合成仪合成。
HGH15′-CCCAAGAATTCCCTTATCCAGGC-3′HGH25′-GGGAAGCTTAGAAGCCACAGGATCCCTCCACAG-3′HGH1和HGH2与hGH cDNA序列相应部分分别有两个和三个核苷酸的区别(图1，Martial等，1979)，从而，PCR扩增后，在cDNA的5′-端引入一个EcoRI位点，3′-端引入一个BamHI位点。此外，HGH2中在紧接着hGH序列下游存在一个Hind III位点。
用Perkin-ELmer-Cetus Thermal Cycler 9600扩增仪和Perkin-Elmer cetus PCR试剂盒进行PCR扩增是用分离于cDNA文库的噬菌体粒子(phage particles)的单链DNA模板进行的，模板来源如下加入10μl噬菌体裂解缓冲液(含280μg/ml.蛋白酶K的TE缓冲液)以裂解10μl噬菌体粒子，55℃温育15分钟后，85℃15分钟。冰上培育1分钟后，14,000rpm离心3分钟以沉淀噬菌体碎片。PCR反应混合液含6μl此DNA模板，0.1μM每种引物的浓度和均为200μM的每种脱氧核糖核苷酸。共进行30个PCR循环，94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，每经一个循环将延伸时间增加1秒。通过凝胶电泳分析反应物显示一预期大小(589个碱基)的单一产物。
PCR扩增产物用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promego Corp)进行纯化，然后用EcoRI和Hind III酶切。进一步通过凝胶电泳纯化EcoRI-HindIII酶切片段后，将它们克隆到一用EcoRI和Hind III酶解的PUC 19(GIBCOBRL)质粒上，形成pHGH1(图2)。EcoRI-Hind III区的DNA测序结果表明此PCR产物在序列上是和hGH序列相同(Martial等，1979)，只是在其5′-端和3′-端分别加入了一个EcoRI位点和BamHI位点。实施例2hGH cDNA的表达噬菌粒pBluescribe(+)(Stratagene)的多接头序列通过在EcoRI和HindIII位点间插入由两个长75-mer的寡核苷酸退火形成的寡核苷酸接头被取代并形成pBST(+)(图3)。新的多接头中含有一个唯一的NotI位点(多接头区的全序列见图3)。
含有PRB1启动子，编码HSA/MFα-1杂合前导序列的DNA，编码HSA的DNA，和ADH1终止子的pAYE 309(EP 431 880)的NotI HSA表达盒转化到pBST(+)上以形成pHA1(图4)。用Hind III酶切将HSA的编码序列从该质粒上移去，再重连以形成pHA2(图4)。
实施例1中述及的hGH cDNA的克隆提供了缺乏原hGH序列和成熟hGH序列的前8个碱基对(bp)的hGH编码区。为构建酵母中分泌hGH的表达质粒，在克隆的hGH序列的5′-端如下加上一酵母启动子，信号肽和该hGH序列的前8个碱基对将pHA1的Hind III-SfaNI的片段通过两合成的寡核苷酸HGH3和HGH4加到pHBH1的EcoR1-Hind III片段的5′-端HGH35′-GATAAGATTCCCAAC-3′HGH45′-AATTGTTGGGAATCTTT-3′将如此形成的Hind III片段克隆到Hind III酶切的pHA2上构成pHGH2(图4)，从而将hGH cDNA置于PRB1启动子和HSA/MFα-1融合前导序列(WO 90/01063)的下游区。包含在pHGH2中的NotI表达盒克隆到NotI酶切的pSAC35(Sleep等，1990)中形成pHGH12(图4)，其中NotI表达盒包括hGH cDNA下游的ADH1终止子。此质粒含有整个2μm质粒，从而具有复制功能和可用于筛选转化体的LEU2基因。
将pHGH12通过转化引入到酿酒酵母DH1(Sleep等，1990)中，单个的转化体在10ml YEPD(1％w/v酵母提取物，2％w/v蛋白胨，2％w/v葡聚糖)中，30℃生长三天。离心该细胞后，上清通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，发现含有期望大小的蛋白质，蛋白质印迹(Westernblots)显示该蛋白可被抗hGH抗血清(Sigma，Poole，UK)识别。实施例3HSA-hGH融合蛋白的克隆和表达为了将HSAcDNA融合到hGH cDNA的5′-端，由两个寡核苷酸HGH7和HGH8将pHA1 Hind III-Bsu 36I片段(含有HSA cDNA的大部分)和pHGH1的EcoR1-Hind III片段连接HGH75′-TTAGGCTTTTCCCAAC-3′HGH85′-AATTGTTGGGAATAAGCC-3′将如此形成的Hind III片段克隆到用Hind III酶切的pHA2中形成pHGH10(图5)，此质粒NotI的表达盒克隆到Not1酶切的pSAC35中形成pHGH16(图5)。
pHGH 16用于转化到酿酒酵母DB1中，培养的上清用实施例2中的方法分析。观察到一分子量大小约88KD的主带，相当于HA和hGH结合后的大小。用抗HSA和抗hGH抗血清(Sigma)进行的Western印迹证实了融合蛋白中两个组成部分的存在。
从培养上清液中先后用阳离子交换层析，阴离子交换层析和凝胶渗透层析法纯化该融合蛋白。通过其N-端的氨基酸序列分析证明了预期的白蛋白序列的存在。
体外生长激素活性测定(Ealey等，1995)显示该融合蛋白具有全部的hGH活性，但与hGH标准相比其效价降低了。在一垂体摘除的小鼠体重增加模型(基本按照European Pharmacopoeia(1987，monograph 556)描述的方法)中，当每天使用相同活性单位数量(以上述体外测定为基础)时，融合蛋白分子较hGH具更高的效价。进一步实验，即每四天用融合蛋白给药一次，表明它与每天都使用hGH类似地具全部生长反应。药物动力学实验(即对小鼠给药125I标记的蛋白)表明融合蛋白的循环半衰期较hGH约增加了十倍(图12)。
用编码酿酒酵母转化酶(SUC2)前导序列的DNA替代杂合前导序列以构建一相似的质粒，从而编码的引导序列和与HSA序列接头如下MLLQAFLFLLAGFAAKISA ↓ DAHKS......
转化酶前导序列 HSA在转化到酿酒酵母DB1中后，该质粒控制表达和分泌融合蛋白的程度与用pHGH16的相似。融合蛋白的N-端分析显示了前导序列从成熟蛋白中精确和有效的切割。实施例4 hGH-HSA融合蛋白的克隆和表达为了将hGH cDNA融合到HSAcDNA的5′-端(图6)，首先通过定点突变改变HSA cDNA以在编码区的5′-端附近引入一个EcoNI位点。已通过Kunkel等(1987年)方法用由pHA1制备的单链DNA模板和一合成的寡核苷酸LEU4LEU45′-GAGATGCACACCTGAGTGAGG-3′完成。用此寡核苷酸的定点突变是指改变HSA cDNA的编码区以使Lys4变为Leu 4(K4L)。然而，这种改变在hGH cDNA的5′-端随后连到突变pHA1后即修复了。此连接是由两个寡核苷酸HGH5和HGH6将pHGH2的NotI-BamHI片段连在突变pHA1的EcoNI-NotI片段上。
HGH55′-GATCCTGTGGCTTCGATGCACACAAGA-3′HGH65′-CTCTTGTGTGCATCGAAGCCACAG-3′形成的NotI片段克隆到NotI酶切的pSAC 35上以构成pHGH14(图7)。用实施例2中的方法将pHGH14转化到酿酒酵母DB1中，并分析培养上清。观察到一分子量大小约为88KD的主带，其与hGH和HA结合后的大小相当。利用抗-HSA和抗-hGH抗血清进行的Western印迹实验证实了此融合蛋白的两个组成部分的存在。
培养上清液中的融合蛋白先后用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶渗透层析法纯化。通过其N-端的氨基酸序列分析证明了预期的hGH序列的存在。
体外研究表明此融合蛋白保留有hGH的活性，但其效价明显低于实施例3中的含有全长HA(1-585)N-端部分和hGH C-端部分的融合蛋白。实施例5与HSA结构域融合的hGH的表达质粒的构建。
hGH分子与HA的前两个结构域(1至387个氨基酸残基)融合形成融合多肽。由寡核苷酸HGH11和HGH12将pHA1的Hind III-SapI片段(该片段具有HA结构域1和2的大部分编码序列、)连到pHGH1的EcoRI-HindIII片段上形成hGH的N-端融合。
HGH115′-TGTGGAAGAGCCTCAGAATTTATTCCCAAC-3′HGH125′-AATTGTTGGGAATAAATTCTGAGGCTCTTCC-3′如此形成的Hind III片段克隆到Hind III酶切的pHA2上形成pHGH37(图8)，并将该质粒的NotI表达盒免隆到NotI-酶切的pSAC 35中。形成的质粒pHGH38(图8)具有一表达盒，当转化到酿酒酵母DB1中后可将融合多肽直接分泌到上清液中。利用抗-HSA和抗hGH抗血清进行的Western印迹证实融合蛋白中两组成部分的存在。
从培养上清液中先后通过阳离子交换层析和凝胶渗透层析方法纯化该融合蛋白。纯化蛋白体外研究显示其循环半衰期长于hGH，与实施例3中具有全长HA(1-585)N-端部分和hGH C-端部分的融合蛋白循环半衰期相似。体外研究显示该融合蛋白保留有hGH的活性。
利用相似于上面详述的方法，将具有HA第一个结构域(第1至194个氨基酸残基)的N-端部分和hGH C-端部分的融合蛋白克隆到酿酒酵母DB1中并在其中表达。用抗HSA和抗hGH抗血清对上清液进行Western印迹分析，证明了融合蛋白中两组成部分的存在。实施例6通过在HSA和hGH间加入切割位点表达hGH。
在HA-hGH融合蛋白间引入一可被Kex2蛋白酶识别的多肽序列可分泌hGH。利用两寡核苷酸HGH14和HGH15将一编码丝氨酸(Ser)-亮氨酸(Leu)-天冬氨酸(Asp)-赖氨酸(Lys)-精氨酸(Arg)的序列引入。
HGH145′-TTAGGCTTAAGCTTGGATAAAAGATTCCCAAC-3′HGH155′-AATTGTTGGGAATCTTTTATCCAAGCTTAAGCC-3′这些用于将pHA1的Hind III-Bsu 36I片段接到pHGH1的EcoRI-Hind III片段上，然后克隆到Hind III酶切的pHA2中形成pHGH25(图9)。将此质粒的NotI表达盒克隆到NotI酶切的pSAC35中形成pHGH31(图9)。将pHGH31转化到酿酒酵母DB1中，SDS-PAGE分析培养上清液，发现其分泌两种主要成分。此两种成分的分子量分别约为与(全长)HA相当的66KD，相当于(全长)hGH的22KD，显示体外可用Kex2蛋白酶或一相似活性蛋白酶切割此融合蛋白。用抗HSA和抗hGH抗血清进行的Western印迹证明了此两种分离成分的存在。对hGH部分的N-端序列分析证明从HA部分的精确和有效的切割。
培养上清液先后通过阴离子交换层析和凝胶渗透层析以纯化hGH部分。此纯化的hGH的体外研究表明该蛋白具有活性并具全部的效价。
利用相似的策略，将含有HA第一个结构域(第1至194个氨基酸残基)，或者含有HA前两个结构域(第1至387个氨基酸残基)，并接有可被Kex2P蛋白酶识别的序列及hGH cDNA的融合蛋白克隆到酿酒酵母DB1中并表达。对培养上清液用抗HSA和抗hGH抗血清进行的Western印迹证明了此两种独立成分的存在。实施例7HSA和hGH通过一柔性接头序列的融合通过寡核苷酸HGH 16，HGH 17，HGH 18，HGH 19的克隆，在HSA和hGH的融合蛋白间引入柔性接头，该接头含有[甘氨酸(Gly)-甘氨酸(Gly)-甘氨酸(Gly)-甘氨酸(Gly)-丝氨酸(Ser)]n重复单元(其中n可以是2或3)。
HGH165′-TTAGGCTTAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGTGGATCTTTCCAAC-3′HGH175′-AATTGTTGGGAAAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACCTAAGCC-3′HGH185′-TTAGGCTTAGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTGGTGGCGGTGGATCCTTCCCAAC-3′HGH195′-AATTGTTGGGAAGGATCCACCGCCACCAGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCTAAGCC-3′HGH 16和HGH 17间的退火导致n＝2，而HGH 18和HGH 19间的退火则导致n＝3。退火后，双链寡核苷酸和来自于pHGH1的EcoRI-Bsu36I片段克隆到Bsu36I酶切的pHGH10中形成pHGH56(此时n＝2)和pHGH57(此时n＝3)(图10)。相应地，将这些质粒的NotI表达盒克隆到NotI酶切的pSAC35中分别形成pHGH58和pHGH59。
如图11中所示，形成pHGH56和pHGH57的寡核苷酸克隆的接头序列中引入了一BamHI位点。因而可通过将来自于pHGH56的Hind III-BamHI片段连到来自于pHGH57的BamHI-Hind III片段上(使n＝1)，或将来自于pHGH57的Hind III-BamHI片段连到来自于pHGH56的BamHI-HindIII片段上(使n＝2)以构建接头序列，此接头序列中n＝1和n＝4。这些片段如实施例2中描述的那样克隆到pHA2的Hind III位点中，分别形成pHGH60(n＝1)和pHGH61(n＝4)[见图11]。来自于pHGH60和pHGH61的NotI表达盒克隆到NotI酶切的pSAC35中分别形成pHGH62和pHGH63。
用pHGH58，pHGH59，pHGH62和pHGH63转化酿酒酵母形成可将融合多肽分泌到上清液中的转化子。
利用抗HSA和抗hGH抗血清进行的Western印迹试验证明融合蛋白中两组成部分的存在。
培养上清先后通过阳离子交换层析，阴离子交换层析和凝胶渗透层析以纯化融合蛋白。氨基酸序列分析此蛋白N-端证明了预期的白蛋白序列的存在。通过电喷射质谱学(electrospray mass spectrometry)分析此纯化的蛋白证明与实施例3中描述的HSA-hGH融合蛋白相比，此蛋白质量如预期那样增加了315D(n＝1)，630D(n＝2)，945D(n＝3)和1260D(n＝4)。体外实验中此纯化蛋白具有活性。
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权利要求
1.一种由一个通过肽键连接在一起的氨基酸连续区域组成的多肽，包括与生长激素(GH)的一相同长度区至少具75％序列同源性的至少十个氨基酸的第一区和与血清白蛋白一相同长度区域至少具有75％序列同源性的至少十个氨基酸的第二区。
2.根据权利要求1的多肽，其中每个所述的第一区和第二区分别与所述长度的GH及白蛋白至少具有95％的序列同源性。
3.根据权利要求2的一个多肽，其中每一个所述的第一区和第二区至少具50个氨基酸长。
4.根据任一前述权利要求的多肽，其中第一区由GH的C-末端的不间断氨基酸，或其保守性修饰产物组成，而此多肽结合并激活的GH受体。
5.根据权利要求4的一个多肽，其中第一区为191个氨基酸长。
6.根据任一前述权利要求的一个多肽，其中的白蛋白和/或生长激素是人源的。
7.根据任一前述权利要求的一个多肽，其中第二区具有至少一个白蛋白的不间断结构域，或其保守性修饰产物。
8.根据权利要求7的一个多肽，其中第二区含有人白蛋白的1-105，120-194，195-291，316-387，388-491，512-585，1-194，195-387，388-585，1-387，或195-585的不间断氨基酸，或其保守性修饰产物。
9.根据任一前述权利要求的一个多肽，其中此多肽的N-末端含有所说的第一区，而C-末端含有所说的第二区。
10.根据权利要求1-8任一的多肽，其中该多肽的N-末端含有所说的第二区，而C-末端含有所说的第一区。
11.根据任一前述权利要求的一个多肽，含有所说第一区和第二区，任选地在此多肽的任一端再加入氨基酸或其它化合物。
12.一种微生物培养基，它含有转化的细胞和根据任一前述权利要求的多肽。
13.一种微生物培养基，具有根据权利要求1至11中任一的多肽。
14.一种编码根据权利要求1至11中任一的多肽的多聚核苷酸。
15.一种微生物宿主，具有便于宿主中表达的根据权利要求14的多聚核苷酸。
16.根据权利要求15的一个宿主，其中多肽由宿主分泌。
17.用于获得根据权利要求1至11中任一的多肽的方法，包括培养一种根据权利要求15或16的宿主及纯化该多肽。
18.一种药物制剂，含有根据权利要求1至11中任一的多肽及药物可接受的载体。
19.一种治疗患有可用生长激素治疗的疾病的病人的方法，该方法包括给病人施用缓解所说的病情的，不足以产生毒性量的根据权利要求1至11中任一的多肽。
20.一种提高动物体内瘦肉/肥肉的生长比率使之超过正常值的方法，包括对动物施用有效量的根据权利要求1至11中任一的多肽。
21.一种生产生长激素的方法，包括在一种微生物宿主内，优选地在酵母中，表达根据权利要求14的一个多核苷酸，此编码的多肽因而在所述的第一区和第二区间有一个位点，此位点可被宿主中的一种酶所切割，或被任何其它的酶，或化学方法切割。
全文摘要
在酵母中良好分泌的白蛋白和生长激素的融合蛋白,或两者变种的融合蛋白,并增加了血清和贮存的稳定性。
文档编号C07K14/61GK1207131SQ9619946
公开日1999年2月3日 申请日期1996年12月19日 优先权日1995年12月30日
发明者戴维·J·巴兰斯 申请人:达尔塔生物技术有限公司