专利名称：Dolastatin15的肽衍生物及其用途的制作方法
已知从海洋来源分离的肽类例如dolastatin-10(US4816444)和dolastatin-15(EP-A-398558)显示出有效的细胞生长抑制活性[参见《生化制药》(Biochem．Pharmacolgy)40，1859-64(1990)；J．Natl．Cancer Inst．85，483-88(1993)，这里引作参考]。根据体内实验性肿瘤系统的令人感兴趣的结果，目前进行了这些天然产物的进一步的临床前评估，以开始对癌症患者的临床研究。由于稀少天然来源之实验室纯化方法的艰难性，因此已经通过合成途径来研究这些肽类的替代的获得方法[参见Tetrahedron50，5345-60(1994)；Tetrahedron49，1913-24(1993)；Tetrahedron48，4115-22(1992)，这里引作参考]。
天然产物显示出的缺点是在含水溶剂中溶解性差和结构单元的昂贵，因此已经研究结构修饰[参见Bioorganic & Med．Chem．Lett．4，1947-50(1994)；WO9303054；JP-A-06234790，EP(O．Z．43202)]。
本发明提供新的寡肽及其衍生物，其与dolastatin-10和-15相比提供出人意料的提高的治疗癌症的治疗效力，即使在MDR抗性肿瘤系统中也具有活性，并且在含水溶剂中具有未曾预料的高溶解性。而且，本发明化合物可以按照下面的详细说明方便合成。
本发明化合物包括式Ⅰ的肽A-B-D-E-F-L (Ⅰ)及其生理耐受的酸的盐，其中A，B，D，E，F和L具有下面的意义A
其中RA是氢，可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R1A是可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2A是可以被1-3个氟原子取代的C1-5-烷基或可以被1-3个氟原子取代的C3-5-环烷基，或者B
其中或者T是NH基团，R1B是氢，R2B是C1-6-烷基，C3-6环烷基，甲氧基甲基，1-甲氧基-乙基或1-甲基乙烯基，或R1B和R2B一起是异亚丙基，或者T是氧原子，R1B是氢，和R2B是C1-6-烷基；D
其中RD是氢，可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R1D是氢和
R2D是C1-5-烷基，环丙基，甲氧基甲基，1-甲氧基-乙基或1-甲基乙烯基，或E
其中nE是0，1，或2，R1E是可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2E和R3E各自独立地是氢或甲基，R4E是氢，羟基，甲氧基或乙氧基或氟原子，和R5E是氢或氟原子，或者，如果nE是1，R3E和R4E一起是一个键，或R4E和R5E是双键键合的氧基或者，如果nE是2，R1E和R2E一起是一个键；
其中RE是氢或甲基或乙基，和R1E是氢，可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，或者E是下式残基
其中XE是氧原子或硫原子F
其中nF是0，1，或2，R1F是可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2F和R3F各自独立地是氢或甲基，R4F是氢，羟基，甲氧基或乙氧基或氟原子，和R5F是氢或氟原子，或者，如果nE是1，则R3F和R4F一起是一个键，或
其中R1F是可以被1-3个氟原子取代的C1-3烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2F和R3F各自独立地是氢或甲基，R4F是氢，羟基，甲氧基或乙氧基或氟原子，和R5F是氢或氟原子，或者，如果nE是1，则
R3F和R4F一起是一个键，或F
其中XF是氧或硫FN-甲基甘氨酰，N-乙基甘氨酰或-丙氨酰残基，L取代的或未取代的烷基，羟基氨基，或肟残基。
如果RL是-(CH2)eL-芳基，则芳基优选苯基或萘基，合适的取代基是卤原子，优选氟，氯或溴，C1-C4-烷基，三氟甲基，C1-C4-烷氧基，三氟甲氧基，亚甲-或亚乙-二氧基，硝基或氰基，C1C4-烷氧羰基，C1-C7-烷基磺酰基，氨基或C1-C7-二烷基氨基，其中烷基残基也可以一起形成杂环。杂芳基优选是5-至6-元环系，其优选含有氮原子，氧原子和／或硫原子，并且可以与苯环稠合，例如咪唑，吡咯，噻吩，呋喃，噻唑，噁唑，吡唑，1，2，4-或1，2，3三唑，噁二唑，噻二唑，异噁唑，异噻唑，吡嗪，哒嗪，嘧啶，吡啶，苯并呋喃，苯并噻吩，苯并咪唑，苯并噻唑，苯并吡喃，吲哚，异吲哚，吲唑或喹啉残基，优选的取代基是C1-C4-烷基，或羟基或苯基。
如果RL2是取代的芳基或甲基芳基，则取代基优选具有下面的意义卤原子，C1-C4-烷基，三氟甲基，C1-C4-烷氧基，三氟甲氧基，亚甲-或亚乙-二氧基，硝基或氰基，C1-C4-烷氧羰基，C1-C7-烷基磺酰基，氨基或C1-C7-二烷基氨基，其中烷基残基也可以一起形成杂环。
如果RL3是取代的芳基或甲基芳基，则取代基优选具有下面的意义卤原子，C1-C4-烷基，三氟甲基，C1-C4-烷氧基，三氟甲氧基，亚甲-或亚乙二氧基，硝基或氰基，C1-C4-烷氧羰基，C1-C7-烷基磺酰基，氨基或C1-C7-二烷基氨基，其中烷基残基也可以一起形成杂环。
本发明另一组化合物包括式Ⅰ肽衍生物，其中
L是下式羟胺残基
其中RL5是氢，直链或支链C1-C8-烷基，其可以被至多6个卤原子优选氟原子取代，或者是C3-C10-环烷基或C1-C4-烷基-C3-C10-环烷基，取代的或未取代的芳基或杂芳基或取代的或未取代的C1-C4-烷基芳基，取代基具有RL中的定义。
RL6具有RL5中的一个定义，其中RL5和RL6两者不都是氢，或者RL5和RL6与氮原子一起形成5-，6-或7-元杂环，及其生理耐受酸的盐。
本发明另一组化合物包括权利要求1要求的式Ⅰ肽衍生物，其中L是式ⅣL肟残基
其中RL5和RL6具有上面的定义，或
RL5和RL6与碳原子一起形成3-至7-元环系，其可以是芳香稠合的，和其生理耐受酸的盐。
优选的环系是
这些例子详细说明但不限制本发明的范围。
式I的肽包括L-氨基酸，但是也可以含有一个或多个D-氨基酸。
新的化合物可以以生理耐受的酸的盐存在，所述酸例如盐酸，柠檬酸，酒石酸，乳酸，磷酸，甲磺酸，乙酸，甲酸，马来酸，富马酸，苹果酸，琥珀酸，丙二酸，硫酸，L-谷氨酸，L-天冬氨酸，丙酮酸，粘酸，苯甲酸，葡糖醛酸，草酸，抗坏血酸和乙酰基甘氨酸。
特别优选的化合物是具有下面定义的残基的化合物RA氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，环丙基，2，2，2-三氟乙基，2-氟乙基；R1A氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，环丙基，2，2，2-三氟乙基，2-氟乙基；R2A氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，异丁基，环丙基，环丁基，2，2，2-三氟乙基，2-氟乙基；T是NH基团和R1B是氢，R2B是环丙基，乙基，异丙基，丁基，叔丁基，仲丁基，甲氧基甲基，1-甲氧基乙基，1-甲基乙烯基；
或者R1B和R2B一起是异亚丙基基团，或T是氧原子和R1B是氢，R2B是甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，异丁基，戊基，己基；RD是氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，环丙基，2，2，2-三氟乙基，2-氟乙基；R1D是氢，R2D是甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，异丁基，戊基，3-甲基丁基，2，3-二甲基丙基，环丙基，环丁基，甲氧基甲基，1-甲氧基乙基，1-甲基乙烯基，或E是下式取代的氮杂环丁烷基，吡咯烷基或哌啶基
其中R1E是氢，可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2E和R3E各自独立地是氢或甲基，R4E是氢，羟基，甲氧基或乙氧基或氟原子，和R5E是氢或氟原子，或者E下式取代的氨基环戊基羰基残基
或
其中RE是氢，甲基或乙基，和R1E是可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，F具有E中的定义或者是下式残基
特别优选的下式的肽A-B-D-E-F-L (Ⅰ)是具有下面定义的残基的肽A是
其中RA和R1A具有上面的定义；B是
D是
其中RD具有上面的定义，E是
F具有E中的定义。
残基L优选是式-O-RL残基，其中残基RL优选是C3-C16-烷基，例如戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基，十六烷基，十七烷基，十八烷基，1-甲基乙基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2-甲基丙基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，4-甲基戊基，4，4-二甲基戊基，3-戊基，4-庚基，2，2，2-三氟乙基，1-氟乙基，2，2-二氟乙基，1，3-二氟-2-丙基C3-C10-环烷基，例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环辛基，环壬基，环癸基；甲基-，乙基-或丙基-(C3-C10)-环烷基；甲基金刚烷基；C2-C16-链烯基，例如2-丙烯基，3-丁烯基，2-丁烯基，2-甲基-2-丙烯基，2-戊烯基，3-甲基-2-丙烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，2-甲基-2-丁烯基，3，7-二甲基-2，6-辛二烯基，3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯基，3，7，11，15-四甲基-十六碳-2，6，10，14-四烯基；饱和的杂环，例如
2-甲氧基乙基，-2(2-甲氧基乙氧基)乙基，2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基，2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基｝乙基；RL也优选是下面的残基，例如芳基，甲基芳基，乙基芳基，丙基芳基，其中芳基可以是取代的或未取代的。
芳基优选是下式的苯基或萘基残基
其中合适的取代基TL1和TL2各自独立地是下面的残基(前提是RL不是苯基)
氢，氟，氯，溴，C1-C4-烷基，C1-C4-烷氧基，三氟甲基，三氟甲氧基，亚甲-或亚乙-二氧基，硝基，氰基，C1-C7-烷氧羰基，C1-C7-烷基磺酰基，氨基或C1-C7-二烷基氨基，其中烷基残基也可以一起形成杂环；或甲基杂芳基，乙基杂芳基，丙基杂芳基，其中杂芳基可以是取代的或未取代的。
杂芳基优选是
其中TL3=H，OH，C1-C4-烷基，苯基，直链或支链C1-C5-烷基羰基，C1-10-烷氧基例如
其中TL4=C1-C4-烷基；下式残基
其中TL5=H，C1-C4-烷基，C1-C6-环烷基，
其中TL6具有TL5中的定义，另外是C1-4-酰基，苯甲酰基，叔丁氧基羰基，苄氧基羰基，
其中TL7=CHO，NHCHO，NHNHCHO，或者是下式的残基
其中TL8，TL9=OCH3，OC2H5，SCH3，SC2H5，或者TL8和TL9与它们所连接的碳原子一起形成下式的环系
其中TL4是式-O-(CH2CH2O)hL-CH3的聚乙二醇酯，其中hL是40-90的数。
另一组包括其中L是下式羟胺残基的物质
其中RL5优选是氢，甲基，乙基，丙基，丁基，叔丁基，戊基，己基，庚基，辛基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2-甲基乙基，2-甲基丙基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，4-甲基戊基，4，4-二甲基戊基，2，2，2-三氟乙基，1-氟乙基，2，2-二氟乙基，C3 8-环烷基，例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环辛基，环壬基，环癸基；甲基-，乙基-，丙基-，丁基-C3-10-环烷基，R1中定义的取代的或未取代的芳基或杂芳基或C1-4-烷基-芳基或-杂芳基；和
RL6是Z甲基，乙基，丙基，丁基，叔丁基，戊基，己基，庚基，辛基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2-甲基乙基，2-甲基丙基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，4-甲基戊基，4，4-二甲基戊基，2，2，2-三氟乙基，1-氟乙基，2，2-二氟乙基，C3-8-环烷基，例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环辛基，环壬基，环癸基；甲基-，乙基-，丙基-，丁基-C3-10-环烷基，或RL5-N-RL6形成下式环系
另一组优选的化合物包括下式肟酯
其中RL5和RL6具有上面的定义，或
形成下式环系
总的来说，C1-4-烷基是甲基，乙基，丙基，2-甲基乙基，丁基，叔丁基，3-甲基丙基；C1-4-烷氧基是甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，叔丁氧基，2-甲基乙氧基，3-甲基丙氧基；C1-4-烷基磺酰基是SO2CH3，-SO2C2H5，-SO2C3H7，-SO2C4H9，-SO2C5H11，-SO2C6H13，-SO2C7H15；其中烷基可以形成一个共有杂环的C1-7-二烷基氨基是
C3-8-环烷基是环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环辛基。
新的化合物可以通过肽化学已知的方法制备。因此该肽可以从氨基酸按序列合成或者连接合适的小的肽片段。在序列合成中，从C末端起始，肽链一步步每次加长一个氨基酸。在片段偶联中，可以将不同长度的片段连接在一起，这些片段可以从氨基酸按序列合成或者其自身通过片段偶联。
序列合成和片段偶联都需要通过形成酰胺，酯或羟胺键来连接各单元。为此，酶促方法和化学方法是合适的。
形成酰胺键的化学方法详细描述于M_eller，《有机化学方法》(Methoden der organischen Chemie)Vol．XV／2，pp1-364，ThiemeVerlag，Stuttgaat，1974；Stewart，Young，《固相肽合成》(SolidPhase Peptide Synthesis)，pp31-34，71-82，Pierce ChemicalCompany，Rockford，1984；Bodanszky，Klausner，Ondetti，《肽合成》(Peptide Synthesis)，pp85-128，John Wiley&Sons，纽约，1976；和其它有关肽化学的著作。特别优选的方法是叠氮方法，对称和混合酸酐方法，原位产生或生成活性酯，使用氨基酸的尿烷保护的N-羧酸酸酐，和使用偶联剂(活化剂)生成酰胺键，偶联剂具体是二环己基碳化二亚胺(DCC)，二异丙基碳化二亚胺(DIC)，1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)，正丙烷膦酸酸酐(PPA)，N，N-双(2-氧代-3-噁唑烷基)-酰氨基-磷酰氯(BOP-Cl)，溴-三-吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐(PyBrop)，二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)，Castro试剂(BOP，PyBrop)，O-苯并三唑基-N，N，N’，N’-四甲基尿鎓盐(HBTU)，二乙基磷酰基氢氰酸酯(DEPCN)，2，5-二苯基-2，3-二氢-3-氧代-4-羟基噻吩二氧化物(Steglich试剂；HOTDO)和1，1’-羰基二咪唑(CDI)，7-氮杂苯并三唑基-N，N，N’，N’-四甲基尿鎓盐(HATU描述于THL Vol．35，No．33，5981-5984)，偶联剂可以单独使用或者与添加剂结合使用，添加剂例如N，N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)，N-羟基-苯并三唑(HOBt)，1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)，N-羟基苯并三嗪(HOOBt)，N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)或2-羟基吡啶。
酯键或羟胺键的形成可以通过在偶联剂和一种碱的存在下将合适的氨基酸或肽衍生物与羟基-或羟基氨基化合物偶联来实现。给出已经描述的形成酰胺键的方法和偶联剂的特别优选的方案。合适的碱是有机胺，例如N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)，吡啶，N-甲基吗啉，三乙胺。
尽管正常情况下在酶促肽合成中可能无需保护基团，但是形成酰胺键中没有涉及的反应基团的可逆保护作用对于化学合成中的两种反应物来说是必需的。对于化学肽合成来说优选三种常规保护基团技术苄基氧基羰基(Z)，叔丁氧基羰基(Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)技术。每种情况的特征是位于加长链单元的α氨基上的保护基团。氨基酸保护基团的详细综述参见Mueller，《有机化学方法》(Methoden der organischenChemie)Vol．XV／1，pp20-906，Thieme Verlag，Stuttgaat，1974。用于合成肽链的单元可以在溶液或悬浮液中反应，或者通过类似于Merrifield在J．Amer．Chem．Soc．85(1963)2149中描述的方法反应。特别优选的方法是其中使用Z，Boc，或Fmoc保护基团技术，所述Merrifield技术中反应物的一种与不溶性聚合物(下文中也称作树脂)载体键合进行肽序列合成或通过片段偶联的方法。该方法一般是使用Boc或Fmoc保护基团技术把序列合成的肽固定在聚合物载体上，增长的肽链共价连接在不溶性树脂颗粒的C末端(参见
图1和2)。该方法使得可能通过过滤除去试剂和副产物，因此不需要中间体的重结晶。
被保护氨基酸可以与任何合适的聚合物连接，只要其在使用的溶剂中是不溶性的而且具有稳定的物理形式使容易过滤。聚合物必须包含一个功能基团，第一个保护氨基酸通过共价键能与该功能基团紧密结合。适于该目的有很多聚合物，例如纤维素，聚乙烯醇，聚甲基丙烯酸酯，磺化的聚苯乙烯，氯甲基化的苯乙烯／二乙烯苯共聚物(Merrifield树脂)，4-甲基二苯甲基胺树脂(BHA-树脂)，苯基乙酰氨基甲基树脂(Pam-树脂)，对-苄基氧-苄基-醇树脂，二苯甲基胺树脂(BHA-树脂)，4-(羟基甲基)苯甲酰基氧基-甲基-树脂，Breipohl等的树脂(Tetrahedron Letters 28(1987)565；BACHEM提供)，4-(2，4-二甲氧基苯基氨基甲基)苯氧基-树脂(Novabiochem提供)或邻-氯代三苯甲基-树脂(Biohellas提供)。
适于在溶液中合成肽的溶剂是所有在反应条件下呈惰性的溶剂，特别是水，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，乙腈，二氯甲烷(DCM)，1，4-二噁烷，四氢呋喃(THF)，N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，以及这些溶剂的混合物。聚合物载体上的肽合成可以在所有惰性有机溶剂中进行，在这些溶剂中使用的氨基酸衍生物是溶解的。但是，优选的溶剂另外具有溶胀树脂的性质，这样的溶剂例如DMF，DCM，NMP，乙腈和DMSO，以及这些溶剂的混合物。合成完成后，肽从聚合物载体上裂解下来。文献中公开了从各种类型树脂上裂解下来的条件。最常使用的裂解反应是酸-和钯-催化，特别是在液体无水氟化氢，无水三氟甲磺酸，稀释的或浓的三氟乙酸中的裂解，在弱碱例如吗啉存在下在THF或THF-DCM混合物中钯催化裂解，或在乙酸／二氯甲烷／三氟乙醇混合物中的裂解。根据选择的保护基团，在裂解条件下可以保留或裂解。当要进行一些衍生化反应时，肽的部分去保护也是有价值的。N-末端二烷基化的肽可以通过在溶液中或者在聚合物载体上合适的N，N-二烷基氨基酸的偶联，或者通过在DMF／1％乙酸中用NaCNBH3和合适的醛对树脂结合的肽的还原性烷基化作用来制备。
本发明化合物可以通过对哺乳动物给予该化合物用来抑制或治疗实体瘤(例如肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，膀胱癌，直肠癌，或子宫内膜癌)或血液癌(例如白血病，淋巴组织瘤)。给药可以是任何常规药学方法，优选肿瘤科药剂学方法包括口服和肠胃外给药，肠胃外给药指皮下，静脉内，肌内和腹膜内给药。本发明化合物可以单独给药或者以含有式I化合物和一种适于期望的给药途径的药学上可接受载体的药物组合物形式给药。这样的药物组合物可以是混合产物，即也可以含有其它治疗活性成分。
对哺乳动物给药的剂量含有肿瘤抑制有效量的活性成分，该剂量取决于常规因素，包括所使用的具体化合物的生物活性；给药途径；受者的年龄，健康状况和体重；症状的性质和程度；治疗的次数；辅助治疗和所期效果。典型的日剂量是口服时每千克体重大约0．05-250毫克，肠胃外给药时每千克体重大约0．05-100毫克。
新的化合物可以以常规的固体或液体药学给药形式给药，例如未包衣的或(膜)包衣的片剂，胶囊，粉末剂，颗粒剂，栓剂，或溶液。用常规方法制备这些制剂。为此目的，活性物质可以与常规药学助剂一起加工，所述助剂例如片剂粘合剂，填充剂，防腐剂，片剂崩解剂，流动调节剂，增塑剂，湿润剂，分散剂，乳化剂，溶剂，缓释组合物，抗氧化剂，和／或抛射气体(参考H．Sucker等《药学技术》(PharmazeutischeTechnologie)，Thieme-Verlag，Stuttgart，1978)。这种方法获得的给药形式一般含有1-90％重量的活性物质。
下面的实施例是为了详细说明本发明。实施例中用已知的三字母码缩写蛋白质氨基酸。其它定义是TFA=三氟乙酸，Ac=乙酸，Bu=丁基，Et=乙基，Me=甲基，Bzl=苄基。
A．方法概述Ⅰ．权利要求1要求的肽或者通过上述使用标准的Z-和Boc-方法的经典溶液方法合成，或者通过在APPLIED BIOSYSTEMS提供的完全自动化的431A型合成仪上的固相合成的标准方法来合成。该仪器对于Boc和Fmoc保护基团技术使用不同的合成循环。
a)对于Boc保护基团技术的合成循环1．DCM中30％三氟乙酸 1×3分钟2．DCM中50％三氟乙酸 1×1分钟3．DCM洗涤 5×1分钟4．DCM中5％二异丙基乙基胺 1×1分钟5．NMP中5％二异丙基乙基胺 1×1分钟
6．NMP洗涤 5×1分钟7．加入预先活化的保护氨基酸(用1当量DCC和1当量HOBt的NMP／DCM溶液活化)；肽偶联(第一部分)1×30分钟8．向反应混合物中加入DMSO直到其含有20％体积DMSO9．肽偶联(第二部分) 1×16分钟10．向反应混合物中加入3．8当量的二异丙基乙基胺11．肽偶联(第三部分)1×7分钟12．DCM洗涤 3×1分钟13．如果转化不完全，则重复偶联(回到5．)14．10％乙酸酐，DCM中5％二异丙基乙基胺 1×2分钟15．DCM中10％乙酸酐 1×4分钟16．DCM洗涤 4×1分钟17．返回 1．BOP-Cl和PyBrop用作N-甲基氨基酸之后的氨基酸的偶联剂。反应时间相应增加。在溶液合成中，分别或者使用Boc-保护的氨基酸NCAs(N-叔丁氧羰基-氨基酸-N-羧基酸酐)，或Z-保护的氨基酸NCAs(N-苄氧羰基-氨基酸-N-羧基酸酐)，对于这种类型的偶联是最有利的。
b)对于Fmoc保护基团技术的合成循环1．DMF洗涤1×1分钟2．DMF中20％哌啶 1×4分钟3．DMF中20％哌啶 1×16分钟4．DMF洗涤5×1分钟5．加入预先活化的保护氨基酸(用1当量TBTU和1．5当量DIPEA的DMF溶液活化)；肽偶联(第一部分) 1×61分钟6．DMF洗涤 3×1分钟7．如果转化不完全，则重复偶联(回到5．)8．DMF中的10％乙酸酐 1×8分钟9．DMF洗涤 3×1分钟10．返回2．
BOP-Cl和PyBrop用作N-甲基氨基酸之后的氨基酸的偶联剂。反应时间相应增加。
Ⅱ．N-末端还原性烷基化按照AⅠa或AⅠb制备的肽-树脂在N-末端去保护(AⅠb中步骤2-4或AⅠa中步骤1-6)，然后加入3当量NaCNBH3与3倍摩尔过量的醛或酮在DMF／1％乙酸中反应。反应完全后(Kaiser试验阴性)，用水，异丙醇，DMF，和二氯甲烷将树脂洗涤几次。
Ⅲ．按照Ⅰa和Ⅱ获得的肽-树脂的后处理肽-树脂减压干燥并转移到TEFLON HF仪(PENINSULA提供)的反应器中。在硫醇，优选乙烷-二硫醇(0．5ml／g树脂)去除吲哚甲酰基团的含有色氨酸肽的情况下加入清除剂，优选苯甲醚(1ml／克树脂)，之后用液氮冷却的同时冷凝氟化氢(10ml／g树脂)。使混合物升至0℃并在该温度下搅拌45分钟。然后减压除去氟化氢，残余物用乙酸乙酯洗涤去除残留的清除剂。肽用30％浓度的乙酸萃取并过滤，冻干滤液。
Ⅳ．按照Ⅰb和Ⅱ获得的肽-树脂的后处理减压干燥肽-树脂后根据氨基酸组成使其进行下面的裂解步骤之一(Wade，Tregear，Howard Florey Fmoc Workshop Manual，Melbourne1985)。
将在合适的TFA混合物中的肽-树脂的悬浮液在室温下搅拌给定时间后过滤树脂并用TFA和DCM洗涤。浓缩滤液和洗涤液，通过加入乙醚来沉淀肽。在冰浴中冷却后过滤沉淀，溶解于30％乙酸并冻干。
Ⅴ．当使用邻-氯代三苯甲基-树脂(Biohellas提供)时，将乙酸／三氟乙醇／二氯甲烷混合物(1∶1∶3)中肽-树脂的悬浮液在室温下搅拌1小时。然后抽滤过滤树脂并用裂解溶液充分洗涤。合并的滤液真空浓缩并用水处理。过滤或离心去除沉淀的固体，用乙醚洗涤并减压干燥。
图1聚合物载体上Boc保护基团技术
Boc=叔丁氧羰基保护基团PG=侧链保护基团R=氨基酸侧链图2聚合物载体上Fmoc保护基团技术
Fmoc=9-芴基甲基氧基羰基保护基团PG=侧链保护基团R=氨基酸侧链Ⅵ．生成酯键或羟基氨基键一种合适的氨基酸或肽衍生物溶解于THF，DMF或这两种溶剂的混合物中。冷却到-20℃和-10℃之间后加入1．5当量EDCI和1．5当量DMAP，搅拌大约1小时后加入1．5当量羟基-或羟基氨基化合物。反应物在大约0℃搅拌2小时后在室温下搅拌大约24小时。反应完全后将混合物倒入饱和的氯化钠溶液中并用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取几次。合并有机相并蒸发。
Ⅶ肽的纯化和鉴定通过凝胶色谱进行纯化(SEPHADEX G-10，G-15／10％HOAc，SEPHADEXLH20／MeOH)，接着进行或不进行中压色谱(MPLC)(固定相HD-SILC-18，20-45微米，100埃；流动相梯度A=0．1％TFA／MeOH，B=0．1％THF／水)进行。
所得产物纯度通过分析HPLC测定(固定相100 2．1mm VYDAC C-18，51，300埃；流动相乙腈-水梯度，用0．1％TFA，40℃缓冲)。
通过快原子轰击质谱鉴定。
B．合成片段1．Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-OMe×HCla)234g(0．463mol)Me2Val-Val-MeVal-Pro-OMe×HCl溶解于2．3升甲苯和150ml甲醇的混合物中，然后加入47．7g(1．157mol)氢氧化钠，混合物在室温下搅拌大约20小时。浓缩后向残余物中加入500ml二氯甲烷，再次浓缩混合物。
b)将这种方法获得的粗产物悬浮于2．5升二氯甲烷中，在+10℃，滴加178g(1．76mol)三乙胺和85．5g(0．71mo；)新戊酰氯。混合物在5-10℃下搅拌大约1小时后分批加入77．6gH-Pro-OMe×HCl，混合物在10℃下搅拌2小时后在室温下过夜。
后处理时浓缩混合物，残余物分配在850ml水和1．1升甲苯中，搅拌下用浓盐酸将pH调节到大约1．5。
分离各相后，向水相中加入1升二氯甲烷，用浓氢氧化钠溶液将pH调节到9，分离各相并再次萃取水相，浓缩合并的有机相得到大约285g残余物。
c)得到的残余物溶解于1．6升异丙醇，并且在40℃加入64g异丙醇的盐酸盐(29％)，搅拌下使混合物冷却到室温，大约2小时后，过滤沉淀，用异丙醇和甲基叔丁基醚洗涤并在50℃下干燥，这样得到222g五肽，纯度是98．8％(根据HPLC)。
2．Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-OH×HCl222g(0．367mol)Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-OMe×HCl溶解于700ml水，并加入38g(0．94mol)氢氧化钠。
反应完全后，通过加入61．7g浓盐酸酸化混合物后浓缩。结晶残余物与500ml甲醇混合，再次浓缩后与1升丙酮在50℃下搅拌。抽滤过滤沉淀物并干燥，然后搅拌下溶解于1．6升丙酮，加入47．5g异丙醇／HCl(30％)，混合物在室温下搅拌2小时。将这种方法得到的沉淀物再次抽滤过滤，用丙酮洗涤并在50℃下干燥。
这样得到191．2g纯产物(根据HPLC，纯度99，9％)。熔点242-244℃。
C．具体方法通用方法-10℃下，1当量肽酸与1至2当量合适的亲核剂(醇，羟胺，肟)一起溶解于DMF／THF，DMAP，EDC×HCl和HOBt各加入1至2当量；混合物接着在-10℃下然后在室温下搅拌。
后处理时，向混合物中加入氯化钠水溶液，用合适的有机溶剂例如二氯甲烷萃取，或者直接浓缩反应混合物，然后通过在硅胶上层析(CH2Cl2／CH3OH作为洗脱剂)或者在RP硅胶上进行MPLC(CH3CN／H2O+TFA)纯化这种方法得到的粗产物。
实施例I-1Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro环己基酯将1．2g(2mmol)Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-OH×HCl和0．27g(2．7mmol)环己醇溶解于50ml4∶1DMF/THF，然后于-10℃依次加入0．5g(4．1mmol)DMAP，0．43g(2．2mmol)EDC×HCl和0．34g(2．2mmol)HOBt。然后混合物在-l0℃下搅拌2小时并在室温下过夜。后处理时，将混合物倒入饱和的氯化钠溶液中并用乙酸乙酯充分萃取。合并的有机相干燥并浓缩后剩余的残余物在硅胶上纯化(洗脱剂CH2Cl2／CH3OH2％)。
这样得到0．26g酯，为白色泡沫状物。
FAB-MS634．5(M+H+)。
用类似的方法制备下面的化合物I-20 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro十二烷基酯FAB-MS720．5(M+H+)I-26 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro十八烷基酯FAB-MS804．5(M+H+)I-89 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro2-(叔丁基氧基羰基氨基)乙酯FAB-MS695．5(M+H+)I-14 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro己酯FAB-MS636．5(M+H+)I-2 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro环戊酯FAB-MS620．5(M+H+)I-58 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro反3-甲基-2-丁烯酯FAB-MS620(M+H+)I-59 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro反-3，7-二甲基-2，6-辛二烯酯FAB-MS688．5(M+H+)I-49 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-1-金刚烷基甲酯FAB-MS700．4(M+H+)I-35 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-3-戊酯FAB-MS630．5(M+H+)I-64 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-N-甲基-4-哌啶基酯FAB-MS649．4(M+H+)I-62 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-1，3-二氟-2-丙酯FAB-MS630．5(M+H+)I-74 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-2-羟基乙酯FAB-MS654(M+H+)I-76 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-2-(甲氧基乙氧基)乙酯FAB-MS654(M+H+)I-78 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-2-(2-丁氧基乙氧基)乙酯FAB-MS696．5(M+H+)I-79 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-2-(苄基氧基)乙酯FAB-MS686(M+H+)I-75 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-2-甲氧基乙酯FAB-MS610(M+H+)I-174 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-2-(4-甲基-5-噻唑基)乙酯FAB-MS677．3(M+H+)I-175 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-(2-甲氧基羰基-2-甲基)丙酯FAB-MS666(M+H+)I-172 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-(1-甲氧基羰基-2-甲基)-丙酯FAB-MS666(M+H+)III-4 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-2-丙酮肟酯FAB-MS607(M+H+)III-34 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-4-甲基苯甲醛肟酯FAB-MS669(M+H+)III-35 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-二苯甲酮肟酯FAB-MS731．5(M+H+)根据实施例I-1制备或能制备下面的化合物A-B-D-E-F-O-RL (I型)
<
D．生物评估1．体外方法使用对于粘附细胞系的标准方法例如微培养四唑鎓测试(MTT)测定细胞毒性。有关该项测试的详细说明已经公开(Alley，MC等《癌症研究》(Cancer Research)48589-601，1988)。用肿瘤细胞例如HT-29结肠癌或LX-1肺癌细胞的指数生长培养基来微滴定平板培养。在96-孔平板上以每孔5000-20000个细胞接种细胞(在150μl培养基中)，在37℃生长过夜。加入10倍稀释的试验化合物，10-4M-10-10M。然后将细胞培养48小时。为了测定每孔中存活的细胞数，加入MTT染料(50μl3mg／ml3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基四唑鎓溴化物的盐水溶液)。该混合物在37℃培养5小时后向每孔中加入50μl25％SDS，pH2。培养过夜后，使用ELISA读数器读出每孔在550nm处的吸收度。使用下面的计算式计算来自重复孔的均值±标准差数据的数值％T／C(被处理／对照存活细胞百分率)。
给出50％生长抑制的T／C的试验化合物浓度认定为IC50值。
2．体内方法在临床前试验中进一步测试本发明化合物的体内活性，其是临床效用的指征。用裸鼠进行这些测试，这些裸鼠已经移植(异种移植)了肿瘤组织，优选来自人源的肿瘤组织，这是本领域公知的。对异种移植的小鼠给药后，评价本发明化合物抗肿瘤效能。
更具体地说，在无胸腺裸鼠中生长的人肿瘤被移植给新的受体小鼠，使用的肿瘤大小是大约50mg。移植的当天定为第0天。6-10天后，静脉内或腹膜内注射给予试验化合物来治疗小鼠，每一剂量用5-10只一组的小鼠试验。每天给予化合物，连续5天，10天或15天，剂量是10-100mg／kg体重。每星期测量2次肿瘤直径和体重。用由游标卡尺测定的直径和下面的计算式来计算肿瘤体积
(长×宽2)／2=肿瘤重量mg计算了每一处理组的平均肿瘤重量，并测定每一组相对于未处理对照肿瘤的T／C值计算。
本发明新的化合物在上述测试系统中具有好的体外活性和在上述在体内系统中具有好的抗肿瘤活性。
权利要求
1．式I的肽A-B-D-E-F-L(Ⅰ)及其生理耐受的酸的盐，其中A，B，D，E，F和L具有下面的意义A
其中RA是氢，可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R1A是可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2A是可以被1-3个氟原子取代的C1-5-烷基或可以被1-3个氟原子取代的C3-5-环烷基，或者B
其中或者T是NH基团，R1B是氢，R2B是C1-6烷基，C3-6环烷基，甲氧基甲基，1-甲氧基乙基或1-甲基乙烯基，或R1B和R2B一起是异亚丙基，或者T是氧原子，R1B是氢，和R2B是C1-6-烷基；D
其中RD是氢，可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R1D是氢和R2D是C1-5-烷基，环丙基，甲氧基甲基，1-甲氧基-乙基或1-甲基乙烯基，或E
其中nE是0，1，或2，R1E是可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2E和R3E各自独立地是氢或甲基，R4E是氢，羟基，甲氧基或乙氧基或氟原子，和R5E是氢或氟原子，或者，如果nE是1，R3E和R4E一起是一个键，或R4E和R5E是双键键合的氧基，或者，如果nE是2，R1E和R2E一起是一个键；
其中RE是氢或甲基或乙基，和R1E是氢，可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，或者E是下式残基
其中XE是氧原子或硫原子F
其中nF是0，1，或2，R1F是可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2F和R3F各自独立地是氢或甲基，R4F是氢，羟基，甲氧基或乙氧基或氟原子，和R5F是氢或氟原子，或者，如果nE是1，则R3F和R4F一起是一个键，或
其中R1F是可以被1-3个氟原子取代的C1-3-烷基或可以被1-3个氟原子取代的环丙基，R2F和R3F各自独立地是氢或甲基，R4F是氢，羟基，甲氧基或乙氧基或氟原子，和R5F是氢或氟原子，或者，如果nE是1，则R3F和R4F一起是一个键，或F
其中XF是氧或硫FN-甲基甘氨酰，N-乙基甘氨酰或-丙氨酰残基，L取代的或未取代的烷基，羟基氨基，或肟残基。
2．权利要求1的式Ⅰ的肽，其中L是下式ⅠL残基-O-RL(ⅠL)其中RL5是C3-C10-环烷基，C2-18-甲基链烯基或C5-16-烷基或C1-5-烷基羧基-C1-10-烷基，其可以被1-5个卤原子取代，或者RL是-(CH2)aL-RL1残基，其中aL是1，2，或3，和RL1是饱和的或部分未饱和的C3-10-碳环，或是饱和的或部分未饱和的环残基，其除了碳原子外，还含有选自氧原子，硫原子或氮原子的杂原子作为环系杂原子，在饱和的环系中，氮原子可以另外键合于C1-4-烷基，C1-4-酰基，C1-4-烷氧基酰基或苄基或苯甲酰基，或者RL是残基-[CH2-CH=C(CH3)-CH2]bL-H，其中bL是1，2，3或4，或RL是-(CH2-CH2-O)dL-CH3，其中dL是1，2，3，4或5，或RL是-(CH2)eL-芳基或-(CH2)eL-杂芳基(其限制是RL不是苄基)，所述芳基或杂芳基可以是取代的或未取代的，和eL是0，1，2或3，或RL是下式残基-(CH2)fL-WL-RL2-(CH2)fL-WL-RL2(ⅡL)其中fL是2，3或4，WL是由氧，硫或-N-RL3形成的桥其中RL2是氢，C1-4-烷基，或C3-7-环烷基或取代的或未取代的芳基或甲基芳基，RL3是氢，C1-4-烷基，或C3-7-环烷基，C1-18-烷酰基，苯甲酰基，羰基氧基-C1-4-烷基，羰基氧基苄基或取代的或未取代的芳基或甲基芳基，或RL是下式残基-(CH2)gL-ZL(ⅢL)其中gL是2，3或4和ZL是甲酰基，氨基羰基或肼羰基或无环或环缩醛或硫代缩醛残基，或RL是下式残基
其中gL具有上述定义，和RL4具有下式二醇残基的定义-O-(CH2-CH2-O)hL-CH3，其中hL是40-90的数，及其生理耐受酸的盐。
3．权利要求1的式Ⅰ肽，其中L是
其中RL5是氢，C1-C8-烷基，其可以被至多6个卤原子优选氟原子取代，或者C3-C10-环烷基或C1-C4-烷基-C3-C10-环烷基，取代的或未取代的芳基或杂芳基或可以被1-5个卤原子取代的C1-C4-烷基芳基，和RL6是C1-C8-烷基，其可以被至多6个卤原子优选氟原子取代，或者C3-C10-环烷基或C1-C4-烷基-C3-C10-环烷基，取代的或未取代的芳基或杂芳基或可以被1-5个卤原子取代的C1-C4烷基芳基，和或者
形成5-，6-或7-元杂环，及其生理耐受的酸的盐。
4．权利要求1的式I肽，其中L是式ⅣL肟残基
其中RL5和RL6具有上面的定义，或
一起形成3-至7-元环系，其可以是芳香稠合的，和其生理耐受的酸的盐。
5．一种药物组合物，其含有一种药学上可接受载体和治疗有效量的一种权利要求1的化合物。
6．一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括对患肿瘤的哺乳动物施用肿瘤抑制量的一种权利要求1的化合物。
7．制备权利要求1的式Ⅰ化合物的方法，其特征在于根据肽化学已知的方法制备这些化合物。
全文摘要
本发明涉及式A－B－D－E－F－L新的肽,其中A,B,D,E,F,和L具有说明书所述定义,公开了其制备方法。这些新的化合物适用于治疗疾病。
文档编号C07K7/00GK1206423SQ96199420
公开日1999年1月27日 申请日期1996年10月30日 优先权日1996年10月30日
发明者A·克林, B·詹森, W·阿姆堡, A·豪普特, K·里特, E·布施曼, H·贝纳德, S·米勒, T·兹尔克, T·巴罗扎里, M·德阿鲁达, S·鲁滨逊 申请人:Basf公司