制备与树脂结合的环状肽的方法

专利名称：制备与树脂结合的环状肽的方法
技术领域：
本发明涉及以片段为基础制备与树脂结合的环状肽甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关蛋白类似物的方法，所述类似物含有至少一个在两个不相邻的氨基酸残基侧链之间的桥。更具体地讲，本发明涉及固相合成所述环状肽类似物的方法以及该方法所用的肽片段。
人甲状旁腺激素(hPTH)为钙体内稳态的主要调节物，是一个84个氨基酸的蛋白质。甲状旁腺激素相关蛋白(hPTHrP)为与hPTH具有N末端同源性的139-171个氨基酸的蛋白质。hPTH和hPTHrP的N末端片段，尤其是由氨基酸1-34组成的那些保留了亲代激素的全部生物学活性。
hPTH(1-34)具有下面的氨基酸序列Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe.
hPTHrP(1-34)具有下面的氨基酸序列
Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala.
hPTH的生物学活性反映在第二信使系统的活化中G-蛋白偶联的腺苷酸环化酶(AC)活性和G-蛋白偶联和未偶联蛋白激酶C(PKC)活性。就人和卵巢切除的大鼠中的骨形成而言，N末端片段hPTH(1-34)OH和hPTH(1-34)NH2已分别被证实是合成代谢的。这种骨生长的增加已证实与腺苷酸环化酶活性的刺激相偶联。这些N末端片段的类似物对于治疗与骨细胞钙调节相关的生理疾病具有显著的治疗功效包括低血钙；骨质疏松；骨质减少；和与骨质疏松和骨质减少相关的疾病，如甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退和库欣综合症；糖皮质激素和免疫抑制诱导的骨质减少；骨折和骨再折术恢复。
还已证实从hPTH(1-34)的N末端缺失多达6个氨基酸残基明显降低得到的类似物刺激腺苷酸环化酶的能力，同时对受体结合几乎没有影响。因此，在N末端截短高达6个氨基酸残基的hPTH(1-34)类似物抑制PTH的作用，可用于治疗特征为PTH过量的疾病，如甲状旁腺过量亢进和与甲状旁腺功能减退相关的高血钙危象、恶性高血钙疾病、肾衰竭和高血压。
hPTH(1-27)-(1-34)的无环类似物公开在美国专利号4,086,196中。hPTH(1-34)和hPTHrP(1-34)的无环类似物公开在美国专利号5,589,452中。[Nle8,Nle18,Tyr34或Phe34]hPTH(1-34)公开在美国专利号4,656,250中。[Nle8,Nle18,Tyr34]hPTH(1-34)和其N末端截短衍生物公开在美国专利号4,771,124和4,423,037中。PTH(1-34)的其它无环类似物公开美国专利号5,723,577和5,434,246,WO 97/02834、EPA561412-A1、EPA 747817-A2、WO-94/02510、WO 9603437和WO9511988-A1中。hPTH(1-28)NH2至hPTH(1-31)NH2和[Leu27]hPTH(1-28)NH2至[Leu27]hPTH(1-33)NH2的类似物描述在美国专利号5,556,940中。包括PTH的N末端截短类似物的PTH受体的无环拮抗剂公开在美国专利号5,446,130、5,229,489、4,771,124和4,423,037中。
公开了hPTH和hPTHrP的单环和双环类似物。环(Lys26-Asp30)[Leu27]hPTH(1-34)NH2和环(Lys27-Asp30)hPTH(1-34)NH2公开在美国专利号5,556,940中。Barbier等(药物化学杂志1997,40,1373)描述了环(Lys26-Asp30)[Leu27]hPTH(1-31)NH2、环(Glu22-Lys26)[Leu27]hPTH(1-31)NH2和环(Lys27-Asp30)hPTH(1-31)NH2。hPTH(1-34)或hPTHrP(1-34)的单环和双环衍生物公开在专利文件WO96/40193、DE19508672-A2和A.Bisello等，生物化学1997,36,3293中。M.Chorev等，生物化学1991,30,5698公开了一种PTH受体的可能的拮抗剂，环(Lys13-Asp17)hPTH(7-34)NH2。且Kanmera等，“肽化学1993:Okada,Y.，编蛋白质研究基础，Osaka,1994,321-324”描述了hPTHrP的一系列含酰胺的类似物。
WO 98/51324公开了式Ⅰ的环肽化合物X-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-YⅠ或其可药用盐或前药，其中X选自(a)R1a-A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(b)R1a-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(d)R1a-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(e)R1a-A5-A6-A7-A8-A9-,(f)R1a-A6-A7-A8-A9-,(g)R1a-A7-A8-A9-,(h)R1a-A8-A9-,(i)R1a-A9-,和(i)R1a-；Y选自
(a)-R3,(b)-A28-R3,(c)-A28-A29-R3,(d)-A28-A29-A30-R3,(e)-A28-A29-A30-A31-R3,(f)-A28-A29-A30-A31-A32-R3,(g)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3，和(h)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3；R1a为H、烷基、芳烷基或-COR2；R1b为R1a或下式的基团 或 R2为烷基、链烯基、炔基、芳基或芳烷基；R3为式A35-OR4或A35-NR4R5的基团；R4和R5彼此独立地为H或低级烷基；R6和R9彼此独立地为H或烷基；R7为烷基；R8为H、烷基或COR2；R10为H或卤素；R11为烷基或芳烷基；m为1,2或3；n为3或4；A0不存在或为1-6个氨基酸残基的肽；A1为Ser、Ala、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A2为Ala、Val或Gly或其等同的氨基酸；A3为Ala、Ser、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A4为Glu、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A5为Ile、His、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A6为Ala、Gln、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A7为Ala、Leu、Gly或其等同的氨基酸；A8为Leu、Nle、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A9为His、Ala、D-Pro或Gly或其等同的氨基酸；A10为Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A11为Ala、Gly、Leu或Lys或其等同的氨基酸；A12为Ala或Gly或其等同的氨基酸；A13为Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A14为Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、His、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A15为Ala、Gly、Ile、D-Pro或Leu或其等同的氨基酸；A16为Asn、Ala、Gly、D-Pro或Gln或其等同的氨基酸；A17为Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A18为Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Leu、Lys、Orn、Nle、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A19为Arg或Glu或其等同的氨基酸；A20为Arg或其等同的氨基酸；A21为Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Lys、Orn、Ser、Thr、Val、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A22为Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Phe、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A23为Leu、Phe或Trp或其等同的氨基酸；A24为Leu或其等同的氨基酸；A25为Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、D-Pro、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A26为Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A27为Leu或Lys或其等同的氨基酸；A28为Ile或Leu或其等同的氨基酸；A29为Ala、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gln、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A30为Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A31为Ile或Leu或Val或其等同的氨基酸；A32为His或其等同的氨基酸；A33为Asn或Thr或其等同的氨基酸；A34为Ala或Phe或其等同的氨基酸；A35不存在或为1-4个氨基酸的肽；和至少一个下面的氨基酸残基对的侧链经酰胺键、酯键、二硫键或羊毛硫氨酸键连接形成一个桥，这些氨基酸残基对为A10与A14、A13与A17、A14与A18、A17与A21、A18与A22、A21与A25、A25与A29和A26与A30，并且下面各个氨基酸残基的侧链最多导致形成一个桥，这些氨基酸残基为A10、A13、A14、A17、A18、A21、A22、A25、A26、A29和A30；条件是当下面的氨基酸残基对A13与A17或A26与A30的侧链经酰胺键、二硫键或羊毛硫氨酸键连接形成一个桥时，至少一个下面的氨基酸残基对A10与A14、A14与A18、A17与A21、A18与A22、A21与A25和A25与A29的侧链也经酰胺键、酯键、二硫键或羊毛硫氨酸键连接。
式Ⅰ的肽化合物的一个优选亚组包括如下肽化合物，其中X选自(a)R1a-A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(b)R1a-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,
(d)R1a-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(e)R1a-A5-A6-A7-A8-A9-,(f)R1a-A6-A7-A8-A9-,(g)R1a-A7-A8-A9-,(h)R1a-A8-A9-,(i)R1a-A9-，和(j)R1a-；Y选自(a)-R3,(b)-A28-R3,(c)-A28-A29-R3,(d)-A28-A29-A30-R3,(e)-A28-A29-A20-A31-R3,(f)-A28-A29-A30-A31-A32-R3,(g)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3，和(h)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3；R1a为H、烷基、芳烷基或-COR2；R1b为R1a或式 或 R2为烷基、链烯基、炔基、芳基或芳烷基；R3为式A35-OR4或A35-NR4R5；R4和R5彼此独立地为H或低级烷基；R6和R9彼此独立地为H或烷基；R7为烷基；R8为H、烷基或COR2；R10为H或卤素；R11为烷基或芳烷基；A0不存在或为1-6个氨基酸残基的肽；A1为Ser、Ala、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A2为Ala、Val或Gly或其等同的氨基酸；A3为Ala、Ser、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A4为Glu、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A5为Ile、His、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A6为Ala、Gln、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A7为Ala、Leu、Gly或其等同的氨基酸；A8为Leu、Nle、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A9为His、Ala、Gly、D-Pro或其等同的氨基酸；A10为Ala、Asn、Gly、Asp或D-Pro或其等同的氨基酸；A11为Ala、Gly、Leu或Lys或其等同的氨基酸；A12为Ala或Gly或其等同的氨基酸；A13为Ala、Gly、Lys或其等同的氨基酸；A14为Ala、His、Asp、Gly、Lys、Ser、D-Pro或其等同的氨基酸；A15为Ala、Gly、Ile、D-Pro或Leu或其等同的氨基酸；A16Asn、Ala、Gly、D-Pro或Gln或其等同的氨基酸；A17为Ala、Asp、Gly、Lys、Ser、D-Pro或其等同的氨基酸；A18为Lys或其等同的氨基酸；A19为Arg或Glu或其等同的氨基酸；A20为Arg或其等同的氨基酸；A21为Arg、Asp、Lys、Val或其等同的氨基酸；A22为Asp、Glu、Lys、Orn或其等同的氨基酸；A23为Leu、Phe或Trp或其等同的氨基酸；A24为Leu或其等同的氨基酸；A25为Arg、Asp、Glu、His、Lys或其等同的氨基酸；A26为His、Lys或其等同的氨基酸；A27为Leu或Lys或其等同的氨基酸；A28为Ile或Leu或其等同的氨基酸；A29为Ala、Asp、Glu、Gln或其等同的氨基酸；A30为Asp、Glu、Lys或其等同的氨基酸；A31为Ile或Leu或Val或其等同的氨基酸；A32为His或其等同的氨基酸；A33为Asn或Thr或其等同的氨基酸；A34为Ala或Phe或其等同的氨基酸；A35不存在或为1-4个氨基酸的肽。
上述肽化合物公开于WO 98/51324，它们具有有用的特性，更具体地说为药物学特性。它们特别适用于治疗能够通过可与甲状旁腺激素受体结合的伴随或不伴随刺激腺苷酸环化酶活性的化合物来调节的疾病。本发明涉及合成这些肽化合物的改进的方法。
环状肽的固相合成通常包括，在肽合成树脂上顺次加成氨基酸以得到与树脂结合的具有所需环肽的全部或部分氨基酸序列的肽。然后将准备环化的氨基酸侧链残基脱保护并进行环化。如果环化在整个氨基酸序列完成之前进行，则加入剩余的氨基酸，然后将完成了的肽从树脂上裂解并进行纯化。
但是，制备肽和环肽的线性方法通常不很有效，因此在大量制备肽时成本很高。当以线性方式装配肽时，随着肽中氨基酸残基数量的增加，肽的纯化会越来越困难。此外，对于环肽，在合成接近结束时制备侧链桥将会给整个肽带来与制备侧链桥有关的问题，包括收率低、副反应和杂质的去除。因此，在长肽中掺入环状单元增加了直链肽合成的难度。上文中所描述的公开于WO 98/51324中的那些环状hPTH类似物的商业可行性合成需要克服了长的和环状成分的复杂因素，并且就药物生产而言能够进行商业有用量的制备的合成方法。本发明涉及通过使用桥接和非桥接片段的方法更有效地制备环状hPTH和HRPHrP类似物。
在本文所述的方法中，单独制备环状肽片段用于和树脂或与树脂结合的肽偶联。通过单独制备环状肽片段，可以进行与树脂结合的环肽的会聚合成，从而提高了所生成的环肽的收率和产量。与制备桥接片段有关的困难被局限在了较小的肽亚单位，所述肽亚单位可以在和固相合成树脂偶联之前进行纯化。该技术在某些优选的hPTH和hPTHrP类似物中的实践需要合成新的肽片段和新的操作顺序。发明详述若无另外说明，如上面以及整个说明书所使用的下列术语将被理解为具有下面的含义。术语的定义“烷基”指链中含有约1-约20个碳原子的直链或支链脂族烃基团。支链指一个或多个低级烷基基团与直链烷基链相连。“低级烷基”指在可为直链或支链的链中含有约1-4个碳原子。烷基基团实例为甲基、乙基、正丙基和异丙基、正、仲、异和叔丁基等。
“链烯基”指包含碳-碳双键的脂族烃基基团，其可为在链中含有约2-约20个碳原子的直链或支链。“低级链烯基”指在可为直链或支链的链中含有约2-4个碳原子。作为实例的链烯基基团包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、环己基丁烯基和癸烯基。
“炔基”指包含碳-碳三键的脂族烃基基团，其可为在链中含有约2-约20个碳原子的直链或支链。“低级炔基”指在可为直链或支链的链中含有约2-4个碳原子。作为实例的炔基基团包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、3-甲基丁-2-炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸烯基。
“亚烷基”指通过除去两个氢原子而从直链或支链饱和烃衍生的二价基团，例如亚甲基、1,2-亚乙基、1,1-亚乙基、1,3-亚丙基、2,2-二甲基亚丙基等。
“苯基烷基”指经亚烷基与母体分子部分相连的苯基。亚烷基优选含有约1至约7个碳原子。代表性的苯基烷基包括苄基、2-苯基乙基、2-苯基丙基等。
“胺保护基”指本领域已知的易于除去的基团，该基团可以防止氨基在合成过程中发生不利的反应并且可以被选择性地除去。N-保护基的使用是防止基团在合成过程中发生不利反应的本领域中熟知的，并且许多这种保护基是已知的，参见，例如T.H.Greene和P.G.M Wuts，有机合成中的保护基，第2版，John Wiely & Sons,New York(1991)，该文献引入本文作为参考。优选的N-保护基是酰基，包括甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、三氯乙酰基、邻-硝基苯乙酰基、邻-硝基苯氧基乙酰基、三氟乙酰基、乙酰乙酰基、4-氯丁酰基、异丁酰基、邻-硝基硝基肉桂酰基、吡啶甲酰基、酰基异硫氰酸酯、氨基己酰基、苯甲酰基等，以及酰氧基，包括甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、2,2,2-三氟乙氧羰基、2-三甲基硅烷基乙氧羰基、乙烯氧羰基、烯丙氧羰基、叔丁氧羰基(BOC)、1,1-二甲基丙炔氧羰基、苄氧羰基(CBZ)、对-硝基苯基亚磺酰基、对-硝基苄氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、烯丙氧羰基(Alloc)等。
“氨基酸”指如本文所定义的选自天然和非天然氨基酸的氨基酸。取决于侧链的取代基，氨基酸可为中性、带正电或带负电。“中性氨基酸”指包含不带电荷的侧链取代基的氨基酸。作为实例的中性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。“带正电的氨基酸”指在生理pH下侧链取代基带正电的氨基酸。作为实例的带正电的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。“带负电的氨基酸”指在生理pH下侧链取代基带净负电的氨基酸。作为实例的带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。优选的氨基酸为α-氨基酸。最优选的氨基酸为在α-碳原子上具有L-立体化学的α-氨基酸。
“氨基酸残基”指掺入到肽或肽片段中的各氨基酸单元。
“天然氨基酸”指选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的α-氨基酸。
“非天然氨基酸”指没有核酸密码子的氨基酸。非天然氨基酸的实例包括例如上述天然α-氨基酸的D-异构体；Aib(氨基丁酸)、bAib(3-氨基异丁酸)、Nva(正缬氨酸)、β-Ala、Aad(2-氨基己二酸)、bAad(3-氨基己二酸)、Abu(2-氨基丁酸)、Gaba(γ-氨基丁酸)、Acp(6-氨基己酸)、Dbu(2,4-二氨基丁酸)、α-氨基庚二酸、TMSA(三甲基硅基-Ala)、aIle(别异亮氨酸)、Nle(正亮氨酸)、叔亮氨酸、Cit(瓜氨酸)、Orn、Dpm(2,2’-二氨基庚二酸)、Dpr(2,3-二氨基丙酸)、α-或β-Nal、Cha(环己基-Ala)、羟基脯氨酸、Sar(肌氨酸)等；环状氨基酸；Nα-烷基化的氨基酸，如MeGly(Nα-甲基甘氨酸)、EtGly(Nα-乙基甘氨酸)和EtAsn(Nα-乙基天冬酰胺)；和α碳原子具有两个侧链取代基的氨基酸。
“等同的氨基酸”指在根据本发明的肽中可被另一个氨基酸替换而没有任何显著的功能丧失的氨基酸。在进行这些改变中，根据侧链取代基的相对相似性进行类似氨基酸的替换，例如考虑如本文所描述的大小、电荷、亲水性、hydropathicity和疏水性。
如被本文引作参考的美国专利号4,554,101所详细描述的，氨基酸残基被确定具有下面的亲水性值Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)和Trp(-3.4)。应理解一个氨基酸残基可替换具有类似亲水性值的另一个氨基酸(例如在+或-2.0的值之间)，并且仍获得生物学等同的多肽。
用类似的方法，可根据亲水性指数的相似性进行替换。根据其疏水性和电荷特性各氨基酸残基被确定了一个亲水性值。那些亲水性指数为Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。在根据亲水性指数进行替换中，优选+或-2.0之间的值。
“肽”和“多肽”指单体为经酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。本发明优选的肽化合物为包含α-氨基酸的那些。首选的本发明的肽含有在α-碳具有L立体化学的α-氨基酸。
“环肽”指含有一个或多个本文所定义的环肽片段的肽。
“肽片段”指母肽的肽亚单位。肽片段可以包括靶肽的直链的、支链的或环状的亚单位。
“直链的肽”指其中的氨基酸是通过一个氨基酸的N-末端与另一个氨基酸的C-末端之间的酰胺键彼此连接的肽或多肽。
“支链的肽”指其中的一个或多个带有羧基或胺侧链的组成氨基酸通过这些侧链与其它肽取代基连接的肽或多肽。
“环状肽片段”指本文所定义的肽片段，其中，一个氨基酸残基上的取代基与肽片段中另一个氨基酸残基上的取代基相连。连接优选是在肽片段中的两个氨基酸残基的侧链之间，优选通过酯键、酰胺键、二硫键或羊毛硫氨酸键连接。两个氨基酸侧链之间的键在此指定为 连接环肽的两个氨基酸残基的酯键、酰胺键、二硫键或羊毛硫氨酸键在侧链功能基之间形成。因此，酰胺键在酸性氨基酸残基的侧链羧基和碱性氨基酸残基的侧链氨基之间形成；酯键在酸性氨基酸残基的侧链羧基和含羟基氨基酸残基的侧链羟基之间形成；二硫键由含有侧链巯基的氨基酸残基形成；羊毛硫氨酸桥通过将相应的二硫化物脱硫形成。
由按照以上描述形成的酰胺键、酯键、二硫键或羊毛硫氨酸键所产生的桥中的原子数量将根据侧链的长度和键的类型(即酰胺键、酯键、二硫键或羊毛硫氨酸键)而改变。所述的桥优选含有2-12个原子，更优选6-10个原子。桥中所含原子的最优选的数量为7，该桥优选含有Lys和Asp残基的侧链功能基之间的酰胺键。
“树脂“指用活泼基团修饰的固体载体，从而该固体载体可以和本文所定义的氨基酸、肽或环肽片段的羧基或N-末端偶联。代表性的树脂包括Merrifield树脂(氯甲基化的聚苯乙烯)、羟甲基树脂、2-氯三苯甲基氯化物树脂、三苯甲基氯化物树脂、Rink酸树脂(4-苄氧基-2′,4′-二甲氧基二苯基甲醇树脂)、三苯甲醇树脂、PAM树脂(4-羟基甲基-苯基乙酰氨基甲基树脂)、Wang树脂(对-苄氧基苄醇树脂)、MBHA树脂(对-甲基二苯甲基胺树脂)、BHA树脂(二苯甲基胺树脂)、Rink酰胺树脂(4-(2′,4＇-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基树脂)和PAL树脂(5-(4-Fmoc-氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酸-MBHA树脂)。优选的树脂是氯代三苯甲基树脂、Rink酸树脂和Rink酰胺树脂。
“固体载体”指对本文所述的反应物和反应条件呈惰性，并且在所用的溶媒中基本不溶的底物。代表性的固体载体包括无机底物如硅藻土、硅胶和可控孔度玻璃；有机聚合物，包括聚苯乙烯，包括1-2％共聚苯乙烯二乙烯基苯(凝胶形式)和20-40％共聚苯乙烯二乙烯基苯(大孔形式)、聚丙烯、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、纤维素等；复合无机/聚合物组合物如固定在硅藻土颗粒基质内聚丙烯酰胺。参见，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第2版，Pierce Chemical Co.(Chicago,IL,1984)。
此外，“固体载体”还包括固定在第二种惰性载体上的上述固体载体，所述第二种惰性载体是，例如技术手册，MultipinTMSPOC,Chiron Technologies(1995)和其中的参考文献中所描述的针，所述的针含有基于聚乙烯或聚丙烯的接有氨基功能基化的甲基丙烯酸酯共聚物的可检测的头和惰性的干。
此外，“固体载体”还包括聚合物载体，例如Janda等，美国国家科学院院报，92,6419-6423(1995)和S.Brenner,WO 95/16918中记载的聚乙二醇载体，该载体可溶于多种溶剂，但可以通过加入导致沉淀的溶剂析出沉淀。
本文使用的天然和非天然氨基酸和其残基的名称遵循由IUPAC有机化学命名委员会建议的和IUPA-IUB生物化学命名委员会在“α-氨基酸命名法(推荐，1974)”生物化学，14(2),(1975)中提出的命名规则。鉴于用于本发明说明书和所附权利要求中的氨基酸和其残基的命名和缩写不同于所述的那些，不同的名称和缩写将使所述内容变得清楚。
如本发明方法中制备的代表性的肽化合物指例如环(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2，相连的氨基酸残基位于“环”后面的圆括号中，取代的天然序列的氨基酸放置在方括号中。hPTH代表人PTH,PTHrP代表人甲状旁腺激素相关蛋白。第二个圆括号中的数字指从N末端开始氨基酸残基在肽化合物中的数目(即hPTH的前31个氨基酸)。
优选的实施方案如反应方案1所示，与树脂结合的环肽的制备涉及将环状和无环的肽片段与树脂、树脂结合的氨基酸或树脂结合的肽偶联。
反应方案1 是适于肽合成的树脂。T是H2N、氨基酸或环状或无环的肽；E和Q均是或彼此独立地是N末端保护的氨基酸，或N末端保护的环状或无环的肽片段。
偶联优选在肽片段的羧基末端和树脂、树脂结合的氨基酸或树脂结合的肽之间完成。当肽片段与树脂结合的氨基酸或肽偶联时，偶联优选通过环肽片段的羧基末端和与树脂结合的氨基酸或肽的N末端之间的酰胺键来完成。
为了使偶联反应进行，必需将肽片段的羧基活化。有多种活化方法可用于本发明的实践，包括，例如预形成的对称酸酐(PSA)、预形成的混合酸酐(PMA)、酰氯、活泼酯；以及将羧酸就地活化的方法，参见Fields & Noble,1990，“利用9-芴基甲氧羰基氨基酸进行固相肽合成”，国际肽与蛋白质研究杂志(Int.J.Pept.Protein Res.),35:161-214。
代表性的活化试剂包括，氯甲酸异丙酯、二异丙基碳二亚胺(DIC)、DIC与1-羟基苯并三唑(HOBT)的混合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、二(2-氧代-3-恶唑烷基)膦酰氯(BOP-Cl)、苯并三唑-1-基氧基-三((二甲氨基)鏻)六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基氧基-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、溴代-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐(PyBROP)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、2-[2-氧代-1-(2H)-吡啶基]-1,1,3,3-二亚戊基脲鎓四氟硼酸盐(TOPPipU)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、DCC与HOBT的混合物等。用于偶联反应的适宜溶剂包括二氯甲烷、DMF、DMSO、甲苯、THF等。偶联时间为约1至约48小时，这取决于待偶联的树脂和羧酸衍生物、活化试剂、溶剂和温度。偶联在约-10℃至约50℃下进行，优选在大约室温下进行。
为了防止干扰上述的偶联反应，将环肽部分的N末端用对酸或碱敏感的基团保护。所述保护基应当在酰胺键形成的条件下是稳定的，同时又很容易被除去而不会破坏伸长的肽链，或使其中所含的任何手性中心外消旋化。适宜的保护基是9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、二苯基异丙氧羰基、叔戊氧羰基、异冰片基氧羰基、(α,α)二甲基-3,5-二甲氧基苄氧羰基、邻硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基等。优选9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基。
同样，对环肽片段中的活泼侧链功能基也需要进行保护。特别优选的侧链保护基是，对于赖氨基和精氨酸的侧链氨基基团为2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯基磺酰基、Cbz、Boc、Alloc(烯丙基氧羰基)和金刚烷基氧羰基；对于酪氨酸苄基、邻溴苄基氧羰基、2,6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；对于丝氨酸叔丁基、苄基和四氢吡喃基；对于组氨酸三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2,4-二硝基苯基；对于色氨酸甲酰基和Boc；对于天冬酰胺和谷氨酰胺Trt(三苯甲基)；对于天冬氨酸和谷氨酸O-t-Bu和O-烯丙基和O-苄基。
片段与树脂或树脂结合肽的偶联优选在约室温下、用约2摩尔当量(相对于树脂)Fmoc-保护的、用约等摩尔量的苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP)和羟基苯并三唑水合物活化的环肽片段在约4当量二异丙基乙基胺的存在下在二甲基甲酰胺中于约16-48小时内完成。
必需对偶联的完成程度进行评估。本领域技术人员对于公知的监测试验是熟知的，例如茚三酮(Kaiser试验)、苦味酸、2,4,6-三硝基-苯磺酸(TNBS)、荧光胺和氯醌试验，这些试验是基于试剂与游离氨基反应生成发色化合物。如果使用亚氨基酸(例如Pro和Hyp)，优选的方法是靛红监测。Fields & Noble，文献出处同上。在反应过程中可以对反应的完成程度进行定量，参见，例如Salisbury等(国际专利公开文本WO 91/03485)。
对于Fmoc合成，优选Kaiser和TNBS试验。在Kaiser试验中，可以将树脂肽样品用来自Pierce Chemical的茚三酮试剂按照Sarin等提出的方法(1981，分析生物化学，117:147-157)进行试验。同样，也可将树脂肽样品用可从Fluka获得的三硝基苯磺酸(TNBS)按照Takajashi提出的方法(1984，化学通讯，1:127)进行试验。
如果有试验表明偶联反应未完成，则可以通过本领域技术人员熟知的多种方法强行使反应结束，包括，(a)用1-5倍过量的保护的氨基酸重复进行偶联，(b)用不同的或添加的溶剂(例如三氟乙烷)重复进行偶联，或者(c)加入离液序列高的盐如NaCIO4或LiBr(Klis & Stewart,1990，“肽化学，结构和生物学”，Rivier & Marshall编，ESCOM Publ.,p.904-906)。
优选的树脂结合环肽片段具有式Ⅱ的结构 其中 是树脂；P是胺保护基；A不存在或是式 的基团；B是式-A23-A24-A25的基团；C是式-A26-A27-A28-A29-A30-的基团；D是-A31-、-A31-A32-、-A31-A32-A33-或-A31-A32-A33-A34-；其中 是内酰胺、酯、二硫化物或羊毛硫氨酸桥；A13、A17、A18和A22是氨基酸残基；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15和A28彼此独立地是Ile或Leu；Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A23是Phe或TrP(Boc)；A24是Leu；A25是Arg(Pmc)或His(Trt)；A26和A30是氨基酸残基，其中A26和A30的侧链选择性地通过酰胺、二硫化物或羊毛硫氨酸键结合；A27是Leu或Lys(Boc)；A29是Ala或Gln(Trt)；A31是Ile或Val；A32是His(Trt)；A33是Asn(Trt)或Thr(tBu)；A34是Ala或Phe。
另一种优选的树脂结合环肽片段具有式Ⅱ的结构，其中， 是内酰胺桥，并且A26和A30的侧链选择性地通过酰胺键结合。
另一种优选的树脂结合环肽具有式Ⅱ的结构，其中， 是内酰胺桥；A13和A18是Lys；A17和A22是Asp；A26是Lys(Boc)；A30是Asp(OtBu)；或者A26和A30的侧链选择性地通过酰胺键结合。
另一种优选的树脂结合环肽片段具有式Ⅲ的结构 其中， 是内酰胺桥；A18是Lys；A19是Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Val；A22是Asp；A23是Trp(Boc)；A24是Leu；A25是Arg(Pmc)；A26是Lys(Boc)；A27是Leu；A28是Leu；A29是Gln(Trt)；A30是Asp(OtBu)；A31是Val。
按照以上描述制得的树脂结合肽还可以进行进一步的加工，例如与一个或多个另外的环肽片段偶联、与一个或多个肽片段偶联、顺次加成单个的氨基酸或以上描述的各种组合。
然后将完成的环肽从树脂上裂解并纯化。可以在从树脂上裂解之前、之后或同时除去保护基。可将完全脱保护的肽通过以下方法之一或其组合进行纯化酸-碱提取、重结晶、冷冻干燥、采用以下类型之一或其全部的一系列色谱步骤在乙酸盐形式的弱碱性树脂上进行离子交换；在未衍生化的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如AMBERLITEXAD)上进行疏水性吸附色谱；硅胶吸附色谱；在羧甲基纤维素上进行离子交换色谱；在例如SEPHADEXG-25、LH-20上进行分配色谱或进行逆流分配；高效液相色谱(HPLC)、特别是在辛基-或十八烷基硅烷基-硅胶结合相柱填料上进行反相HPLC。肽片段的制备所述片段通过合成肽主链进行制备，所述肽主链使构成片段的氨基酸以其适当的顺序装配。片段的肽主链可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行合成。对于固相肽合成，多种技术的综述可以参见J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，W.H.Freeman Co.(SanFrancisco),1963和J.Meienhofer，激素蛋白和肽，第2卷，46页，Academic Press(New York),1973。对于经典的溶液合成，可以参见G.Schroder和K.Lupke，肽，第1卷，Acacemic Press(New York),1965。
正如本领域普通技术人员所知的，在固体载体上进行肽合成通常涉及从羧基或C-末端开始构建肽，其中，α-氨基被保护了的C-末端氨基酸与固相聚合物相连。然后裂解掉N-保护基，将同样是N-保护的下一个氨基酸通过与连接在上述固体载体上的氨基酸之α-氨基之间的肽键偶联。重复前一氨基酸的脱保护和下一氨基酸的偶联的循环，直至肽完成。将氨基酸的所有活泼侧链通过能够经受得住偶联和Nα-脱保护过程但可以在合成结束时被除去的化学基团进行保护。当用固相方法制备肽片段时，通过从树脂上裂解得到用于与其它片段偶联的片段。
环肽片段按照类似的方式制备。但是，在主链装配后进行(1)将待环化的侧链功能基选择性地脱保护，(2)环化，和(3)选择性地除去所有剩余的保护基。
使用Fmoc氨基酸是肽合成的一种策略。Boc(叔丁氧羰基保护的氨基)策略还可用于制备与固体载体结合的肽(例如Geysen等，1987，免疫学方法杂志102:259-274.)。
用于肽合成的氨基酸可以是Merrifield(1963，美国化学会志85:2149-2154)所描述的常规的Boc(Nα-氨基保护的Nα-叔丁氧羰基)氨基酸，或是Carpino和Han(1972，有机化学杂志37:3403-3409)所描述的对碱不稳定的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc Nα-氨基保护的氨基酸均可以从Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、Bachem或Peninsula Labs或本领域技术人员熟知的其它化学品公司得到。此外，本发明的方法也可以使用本领域技术人员熟知的其它Nα-保护基。固相肽合成可以通过本领域技术人员熟知的方法完成(参见Stewart和Young,1984，固相合成，第2版，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL；Fields和Noble,1990，国际肽、蛋白研究杂志，35:161-214)，或用例如ABS所售的自动合成仪合成。
尽管C-末端至N-末端肽合成是常规的，但本领域技术人员可以理解，也可以从N-末端至C-末端来合成肽片段。内酰胺桥的制备内酰胺桥接的环肽片段通过在以上所述的活化剂的存在下，在酸性氨基酸残基的侧链羧基和碱性氨基酸残基的侧链氨基之间形成酰胺键制得。优选的酸性氨基酸残基包括Asp、Glu、-NHCH[(CH2)3CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-。首选Asp。优选的碱性氨基酸残基包括His、Lys、Orn、-NHCH(CH2NH2)CO-和-NHCH[(CH2)2NH2]CO-，首选Lys。
当环肽片段的肽前体含有一个以上的酸性或碱性氨基酸残基时，应对环肽片段中其它的酸性或碱性氨基酸的保护基进行选择，以便使待环化的氨基酸可以被选择性地脱保护。优选所需的酸性和碱性氨基酸残基同时被脱保护。此外，除了对用于脱保护选定的碱性和酸性氨基酸残基所用的试剂稳定外，其余氨基酸残基上的保护基还应对所用的环化条件是稳定的。
当用于指侧链保护基时，术语“正交性”指如本文所述的在分子上具有两种或多种类型保护基，每一种在特定的条件下被最佳地除去，而同时对用来除去其它类型保护基的条件保持稳定的情况。因此，可除去一种类型的所有保护基，而保持所有其它保护基的完整性。
优选的具有所需正交性的保护基为对于待环化的酸性氨基酸残基烯丙基；对于待环化的碱性氨基酸残基烯丙基氧羰基(alloc)；对于任何其它酸性氨基酸残基叔丁基(tBu)；对于任何其它碱性氨基酸残基叔丁基氧羰基(Boc)。
在用固相或液相技术合成了环肽片段的肽主链后，通过用钯，优选四(三苯基膦)钯(0)在N-甲基苯胺的存在下处理，同时除去烯丙基和烯丙氧羰基保护基。接着如本文对酰胺键形成所描述的完成酰胺桥的形成。
用于制备本发明的树脂结合环肽的优选的环肽片段具有式ⅩⅤ、ⅩⅥ或ⅩⅦ的结构， 其中 是内酰胺、二硫化物或羊毛硫氨酸桥；P是胺保护基；A13、A17、A18、A22、A26和A30是氨基酸残基；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15是Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A27是Leu或Lys(Boc)；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln(Trt)。
更优选的环肽片段具有式Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ的结构，其中 是内酰胺桥；P是Fmoc；
A13、A18和A26是Lys；A17、A22和A30是Asp；A14是His(Trt)或Ser(tBu)；A15是Ser(tBu)或Leu；A16是Asn(Trt)或Gln(Trt)；A19是Arg(Pmc)或Glu(OtBu)；A20是Arg(Pmc)；A21是Arg(Pmc)或Val；A27是Leu或Lys(Boc)；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln(Trt)。
用于制备本发明的树脂结合环肽的仍更优选的环肽片段是Fmoc-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH。
适于用本发明的方法制备的环状肽甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关蛋白类似物公开于1．Condon等，U.S.系列号60/046,472(1997年5月14日申请)；2．Willick等，U.S.专利号5,556,940(1997年9月17日)；3．Chorev等，U.S专利号5,717,062(1998年2月10日)；4．Vickery等，WO 96/40775(1996年12月19日公开)。
适于用本发明的方法制备的优选的环肽具有式Ⅰ的结构X-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30-A31-Y1其中X选自(a)R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-,(b)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-,(d)R1b-A4-A5-A6-,(e)R1b-A5-A6-,(f)R1b-A6-和(g)R1b-，其中R1a选自(1)H,(2)由1-6个氨基酸组成的肽，(3)烷基，(4)苯基烷基，(5)-COR2，其中R2选自烷基、链烯基、链炔基、苯基、萘基和苯基烷基，R1b选自(1)H,(2)烷基，(3)苯基烷基和(4)-COR2，其中R2选自烷基、链烯基、链炔基、苯基、萘基和苯基烷基，A1选自Ser和Ala或其等同的氨基酸残基，A2、A3、A4和A6是氨基酸残基，A5选自Ile和His或其等同的氨基酸残基；A7、A9、A11和A12是氨基酸残基；A8是Leu或Nle或其等同的氨基酸残基；A10是Asp或Asn或其等同的氨基酸残基；A13和A17是氨基酸残基，其中A13和A17的侧链通过酰胺键连接；
A14是His或Ser或其等同的氨基酸残基；A15和A28彼此独立地是Ile或Leu或其等同的氨基酸残基；A16是Asn或Gln或其等同的氨基酸残基；A18和A22是氨基酸残基，其中A18和A22的侧链通过酰胺键连接；A19是Arg或Glu或其等同的氨基酸残基；A20是Arg或其等同的氨基酸残基；A21是Arg或Val或其等同的氨基酸残基；A23是Phe或Trp或其等同的氨基酸残基；A24是Leu或其等同的氨基酸残基；A25是Arg或His或其等同的氨基酸残基；A26和A30是氨基酸残基，其中A26和A30的侧链通过酰胺键连接；A27是Leu或Lys或其等同的氨基酸残基；A29是Ala或Gln或其等同的氨基酸残基；A31是Ile或Val或其等同的氨基酸残基；Y选自(a)R3,(b)A32-R3,(c)-A32-A33-R3和(d)-A32-A33-A34-R3-，其中R3是-OH或-NR4R5，其中R4和R5彼此独立地选自氢和低级烷基，A32是His或其等同的氨基酸残基，A33是Asn或Thr或其等同的氨基酸残基，A34是Ala或Phe或其等同的氨基酸残基。
式Ⅰ的肽具有有用的药物特性。它们特别适用于治疗能够通过可与甲状旁腺激素受体结合的伴随或不伴随刺激cAMP酶活性的化合物来调节的疾病。参见U.S.系列号60/046,472。
适于用本发明方法制备的代表性的优选环肽包括但不仅限于，环(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.2,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.3,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.4,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.5,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.6,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.7,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.10,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.11,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.12,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.13,Nle8,Lys18Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.14,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.15,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.16,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二环(Lys13-Asp17,Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp17.22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二环(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-34)NH2二环(Lys13-Asp17,Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp17.22,Leu27]hPTH(1-34)NH2二环(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-34)NH2环(Lys18-Asp22)[Lys18,Asp22]hPTHrP(1-34)NH2环(Lys18-Asp22)[Lys18,26,30,Asp22,Leu23,28,31,Glu25,29]hPTHrP(1-34)NH2环(Lys18-Asp22)[Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(7-34)NH2环(Lys18-Asp22[Lys18,Asp22]hPTHrP(7-34)NH2二环(Lys13,Asp17,Lys18-Asp22)[Nle8.Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(7-34)NH2，和二环(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(7-34)NH2.
适于用本发明方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中的氨基酸残基是在α-碳上具有L立体化学的α-氨基酸残基。
适于用本发明方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中的X选自(a)R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-，其中R1a是H或Pro,A1是Ser或Ala,A2是Val,A3是Ser,A4是Glu,A5是Ile或His,A6是Gln,(b)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-，其中A2、A3、A4、A5和A6如上所定义，R1b是H,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-，其中R1b、A3、A4、A5和A6如上所定义，(d)R1b-A4-A5-A6-，其中R1b、A4、A5和A6如上所定义，(e)R1b-A5-A6-，其中R1h、A5和A6如上所定义，(f)R1b-A6-，其中R1b和A6如上所定义，(g)R1b-，其中R1b如上所定义，A7是Leu；A8是Leu或Nle；A9是His；A10是Asp或Asn；A11是Leu；A12是Gly；A13、A17、A18、A22和A30彼此独立地选自Ser、Thr、Lys、Cys、同型-Cys、Orn、Asp、Glu、-NHCH(CH2NH2)CO-、-NHCH[(CH2)2NH2]CO-、-NHCH[(CH2)3]CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-；A14是His或Ser；A15是Ser或Leu；A16是Asn或Gln；A19是Arg或Glu；A20是Arg；A21是Arg或Val；A23是Phe或Trp；A24是Leu；A25是Arg或His；A26是His或彼此独立地选自Ser、Thr、Lys、Cys、同型-Cys、Orn、Asp、Glu、-NHCH(CH2NH2)CO-、-NHCH[(CH2)2NH2]CO-、-NHCH[(CH2)3]CO2H]CO-和-NHCH[(CH2)4CO2H]CO-；A27是Leu或Lys；A28是Ile或Leu；A29是Ala或Gln；A31是Ile或Val；Y选自(a)-R3，其中R3是-OH或-NR4R5，其中R4和R5彼此独立地选自氢和1-4个碳原子的烷基，(b)-A32-R3，其中R3如上所定义，A32是His,(c)-A32-A33-R3，其中R3和A32如上所定义，A33是Asn或Thr和(d)-A32-A33-A34，其中A34是Ala或Phe。
适于用本发明方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中(ⅰ)A18和A22的侧链通过酰胺键连接，(ⅱ)A13和A17的侧链通过酰胺键连接，并且A18和A22的侧链通过酰胺键连接，(ⅲ)A18和A22的侧链通过酰胺键连接，并且A26和A30的侧链通过酰胺键连接，或(ⅳ)A13和A17的侧链通过酰胺键连接，A18和A22的侧链通过酰胺键连接，并且A26和A30的侧链通过酰胺键连接。
适于用本发明的方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中A13选自Lys和Ala,A17选自Ser和Asp,A18是Lys,A22是Asp,A26是Lys,A30是Asp。
适于用本发明的方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中X是R1a-A1-A2-A3-A4-A5-A6-。
适于用本发明的方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中A1是Ala,A8是Nle,A27是Leu。
适于用本发明的方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中R1a是H,Y是NH2。
适于用本发明的方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中R1a是H,Y是-A32-A33-A34-NH2。
适于用本发明的方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中X选自(a)R1b-A2-A3-A4-A5-A6-,(b)R1b-A3-A4-A5-A6-,(c)R1b-A4-A5-A6-,(d)R1b-A5-A6-,(e)R1b-A6-和(f)R1b-。
适于用本发明的方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中A8是Nle,A27是Leu。
适于用本发明的方法制备的另一种优选的环肽具有式Ⅰ的结构，其中X是H,Y是-A32-A33-A34-NH2。
适于用本发明的方法制备的更优选的环肽选自环(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.2,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.3,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.4,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.5,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.6,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.7,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.10,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.11,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.12,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.13,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.14,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.15,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2环(Lys18-Asp22)[Ala1.16,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二环(Lys13-Asp17,Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp17.22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二环(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2
适于用本发明方法制备的仍更优选的环肽选自环(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二环(Lys13-Asp17,Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp17.22,Leu27]hPTH(1-31)NH2二环(Lys18-Asp22,Lys26-Asp30)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2适于用本发明方法制备的仍更优选的环肽是环(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2。
参照以下实施例可以更好地理解以上的描述，给出这些实施例是为了说明，而并非想要限定本发明的范围。
用7.89g(18.9mmole)Fmoc-Asp(O-烯丙基)-OH、82g(39.9mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP)和10.2g(78.8mmole)二异丙基乙基胺在150mL二氯甲烷中完成Fmoc-Asp(O-烯丙基)-OH与15g 1.05毫当量/g填充量(共15.75mmole)的1％交联氯代三苯甲基树脂的偶联。将混合物振摇，然后滗干并将树脂用每份150mL的二氯甲烷/甲醇/二异丙基乙基胺(17∶2∶1)洗涤3次，然后用每份150mL的二氯甲烷洗涤3次。将树脂的样品进行TNBS试验，试验呈阴性。将Fmoc-保护的树脂结合的氨基酸用150mL 5％哌啶在二氯甲烷-二甲基甲酰胺(1∶1)中的溶液处理10分钟，然后用150mL20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理30分钟，除去N-末端9-芴基甲氧羰基。将树脂结合的氨基酸按照以上描述进行洗涤。将Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH(在该步骤后取出10％)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Lys(ε-Alloc)-OH分别按照相同的方式偶联，并采用相同的操作顺序，但在TNBS试验之前用3至5次的二甲基甲酰胺洗涤代替3次的二氯甲烷洗涤。无需重复偶联。将最终的树脂结合肽用150mL四氢呋喃和150mL乙醚洗涤，然后真空干燥得到27.23g。b．Lys18和Asp22的烯丙基和Alloc的脱除Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基树脂的合成。
将10g以上制得的Fmoc-(Lys-Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)树脂用100mL二甲亚砜/二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1∶1∶0.2v/v/v)振摇20分钟使其溶胀，然后将树脂小心地滗干。加入2.9g四(三苯膦)钯(0)在240mL二甲亚砜/二甲基甲酰胺(1∶1,v∶v)中的溶液，然后加入60mL二氯甲烷和16.2g(150mmole)N-甲基苯胺，然后将混合物振摇2小时。将树脂滗干并用每份100mL的二氯甲烷洗涤3次。将树脂用100mL二甲亚砜/二甲基甲酰胺(1∶1v∶v)溶胀，然后小心地滗干并直接用于Lys18-Asp23环化。c．Lys18-Asp22内酰胺桥的形成Fmoc-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基树脂的合成。
将以上实施例的树脂肽用5.2g(10mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP)和2.6g(20mmole)二异丙基乙基胺在100mL二甲亚砜/二甲基甲酰胺(1∶1v∶v)中处理，然后将混合物振摇4小时。将树脂滗干并用每份100mL的二甲基甲酰胺洗涤3次，然后取出一部分滗干的树脂进行TNBS试验(阴性)。将树脂用四氢呋喃和乙醚各100mL洗涤，然后真空干燥。d．Fmoc-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp的树脂裂解和产物分离。
将以上Lys18-Asp22内酰胺桥形成实施例中制得的树脂肽在振摇器中用130mL乙酸/二氯甲烷/2,2,2-三氟乙醇(1∶8∶1)处理20分钟。将液体部分与树脂分离，并用500mL甲基叔丁基醚和100mL乙醚处理，然后将混合物离心。除去上清液，向残余物中加入乙醚，然后离心。除去上清液并将残余物干燥过夜得到2.77g黄色固体(MS:1172；41％化学计量学收率，粗品)。将其通过快速色谱纯化(85∶15至60∶40二氯甲烷∶甲醇)得到1g Fmoc-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH(15％收率，以树脂计)，纯度为85A％。方法B在溶液中合成a．顺序装配BOC-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室温下，向3L的三颈烧瓶中加入1,1-二甲基乙氧羰基-(L)-天冬氨酸苄酯(50g,154.5mmol)、二氯甲烷(96mL)、烯丙醇(9.438,162.3mmol)和4-N,N-二甲氨基吡啶(10mg)。将反应混合物冷却至8℃，然后在8-11℃下于1.5小时内加入二环己基碳二亚胺(32g,154.5mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液。加入二环己基碳二亚胺溶液的同时，析出二环己基脲的沉淀。将反应混合物于11-12℃搅拌2小时，此时HPLC显示原料消失。滤出二环己基脲并将滤液浓缩。将油状残余物加入甲基叔丁基醚(250mL)中，然后将溶液过滤除去残余的二环己基脲，用30mL 0.2N盐酸、30mL水、20mL饱和碳酸氢钠水性溶液、30mL水和2×50mL盐水洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到55.88g油状的BOC-(L)AsP(O-烯丙基)-OBzl。(M计算值363.4；M+1实测值364)。HCl-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成在装有机械搅拌器的3L三颈烧瓶中，将BOC-Asp(O-烯丙基)-OBzl(110.5g,302.7mmol)的500mL乙酸乙酯溶液冷却至5℃，并向反应混合物中通入氯化氢气体2.5小时，在此期间内反应温度达到约22℃。HPLC显示无原料存在。向溶液中通入氮气过夜，形成白色沉淀，过滤收集沉淀并用100mL乙酸乙酯洗涤。将残余物真空干燥得到84g白色结晶固体状(显微镜观察)HCl.Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M计算值263；M+1实测值264)。BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成向BOC-Val-OH(25.4g,116.7mmol)的乙酸乙酯(85mL)溶液中加入羟基苯并三唑水合物(16.55g,122.5mmol)的二甲基甲酰胺(122.3mL)溶液。将混合物冷却至5℃，然后在1小时内加入二环己基碳二亚胺(25.2g,122.5mmol)的乙酸乙酯(58.7mL)溶液，在此期间内，温度升至约18℃并有二环己基脲沉淀生成。停止冷却并将混合物搅拌2小时，然后在25分钟内加入HCl-H2N-Asp(OAll)-OBzl(35g,116.7mmol)的189mL二甲基甲酰胺溶液。在0.5小时内缓慢加入N-甲基吗啉(12.8mL)使反应混合物的pH达到7，然后将混合物室温搅拌36小时。将反应混合物过滤除去二环己基脲，将滤液用甲基叔丁基醚稀释，搅拌2小时然后过滤。将滤液用100mL水、100mL 0.5M柠檬酸水溶液、100mL水、100mL饱和碳酸氢钠水溶液、100mL盐水洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到41.3g油状的BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M计算值462；M+1实测值463)。HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成向2-4℃的BOC-Val-Asp(OAll)-OBzl(31.7g,68.5mmol)的乙酸乙酯(300mL)溶液中通入氯化氢气体2小时。停止冷却并将混合物搅拌48小时。向溶液中剧烈地通入氮气1小时。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩得到38.3g白色固体，将其用乙酸乙酯结晶得到24.2g HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M计算值362M+1实测值363)。FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成在装有机械搅拌器的3L三颈烧瓶中加入17.25g(26mmol)FMOC-Arg(PMC)和300mL乙腈，然后将混合物室温搅拌直至形成透明的溶液。加入苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP)，将溶液冷却至2℃，加入2.6g(26mmol)N-甲基吗啉，形成白色的焦油。缓慢加入二甲基甲酰胺(52mL)直至焦油溶解，然后将混合物于3℃搅拌30分钟。在2-3℃下于20分钟内加入HCl.Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(10.4g,26mmol)的39mL二甲基甲酰胺溶液，然后加入N-甲基吗啉(7.5mL)达到pH7。停止冷却，将混合物搅拌2.5小时。然后将混合物用250mL水和250mL乙酸乙酯稀释。分出乙酸乙酯层，用水(2×100mL)和盐水(2×100mL)洗涤然后浓缩得到白色固体，将其用175mL乙酸乙酯结晶，得到18.5g FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(95A％)。将乙酸乙酯滤液浓缩并将胶状残余物用乙酸乙酯研制另外得到3.12g产物。(M计算值1007；M+1实测值1008)。Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室温下，向FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(16g,15.9mmol)的二氯甲烷(267mL)溶液中加入哌啶(23g,27mmol,26.7mL)。将反应液搅拌2.5小时然后用水(2×60mL)和盐水(2×60mL)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到半固体。将所述半固体加入400mL乙酸乙酯中，将溶液搅拌3天然后过滤。将滤液用水洗涤(2×60mL)，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩得到23.5g含有哌啶-亚甲基茚加合物杂质的产物(MS分析)。将固体溶于400mL乙酸乙酯，过滤，用水洗涤(2×60mL)，干燥(硫酸镁)然后浓缩得到固体，将其真空干燥过夜得到12.55g白色固体状Arg(PMC)-Val-Asp(OAll)-OBzl。(M计算值784M+1实测值785)。FMOC-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成2℃下，向FMOC-Glu(tBu)(6.73g,15.8mmol)和苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP,8.18g,15.8mmol)的105mL乙腈溶液中加入N-甲基吗啉(1.58g,15.8mmol)并将反应混合物于2-4℃搅拌30分钟。在2℃下于20分钟内加入L)Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl(12.4g,15.8mmole)的70mL乙腈溶液。然后加入N-甲基吗啉达到pH7。停止冷却，使混合物升温至室温，然后继续搅拌共3小时。将乳状的反应混合物过滤(慢)并将白色残余物在滤纸上干燥过夜得到10.8g FMOC-Glu(OBut)-Arg(PMC)-Val-Asp(烯丙基)-OBzl。将滤液浓缩得到胶状物，将其加入30mL乙腈中并放置48小时，另外得到3.45g产物。FMOC-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的总收率为14.3g。(M计算值1192；M+1实测值1192.4)。Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成室温下，向FMOC-Glu(OBut)-Arg(PMC)-Val-Asp(OAll)-OBzl(12.3g,10.3mmol)的105mL二氯甲烷溶液中加入哌啶(3.5g,41.3mmol)。将混合物搅拌2小时，然后用庚烷稀释，浓缩至一半的体积，然后在冰箱中放置过夜。从油状残余物中滗析出液体，然后将残余物加入二氯甲烷中。将溶液用0.5M柠檬酸水溶液、水和盐水洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤然后浓缩。将粗品固体用庚烷研制两次然后过滤得到9.0g白色粉末状Glu(OtBu)-(L)Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M计算值970.2；M+1实测值971)。FMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的合成。
5℃下，将FMOC-Lys(Alloc)(4.2g,9.3mmol)和苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP,4.8g,9.3mmol)在69mL乙腈中的悬浮液用N-甲基吗啉(0.94g,9.3mmol)处理，然后将形成的溶液于5℃搅拌30分钟。加入Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(烯丙基)-OBzl(9g,9.3mmole)在52mL乙腈中的悬浮液，使反应混合物变成白色混浊液。加入N-甲基吗啉直至反应混合物达到pH7，然后将反应混合物升温至室温并搅拌1.33小时。将混合物过滤并将固体残余物用乙腈洗涤(2×40mL)，然后在氮气流下真空干燥过夜得到12.8g灰白色硬的固体，将其用200mL甲基叔丁基醚研制，过滤收集并真空干燥得到9.7gFMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl。(M计算值1404.7；M+1实测值1406)。b．从Lys18和Asp22上脱除Alloc和烯丙基FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl的合成。
室温下，向装有机械搅拌器并通氮气流的1L三颈烧瓶中加入167mL二氯甲烷和1.37g(1.18mmol,0.2当量)Pd(PPh3)4。向橙色的溶液中通入氮气2分钟，然后加入8.3g(5.91mmol,1.0当量)FMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-OBzl的66.4mL二甲基甲酰胺溶液，然后加入13.3g,(124mmol,21当量)甲基苯胺。将溶液室温搅拌1小时。将混合物用700mL甲基叔丁基醚稀释导致固体形成。将悬浮液搅拌1小时然后过滤。将固体残余物用200mL甲基叔丁基醚研制，过滤然后干燥得到5.0浅黄色固体。由滤液得到1.1g浅黄色固体状的第二批产物，总收率6.1g FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl。(M计算值1280.6；M+1实测值1281)。c．Lys18-Asp22内酰胺桥的形成FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl的合成。
室温及氮气氛下，将6.0g(4.69mmol)FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl在1L三颈烧瓶中溶于300mL二甲基甲酰胺，然后加入3.44g(6.61mmol,1.41当量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP)、0.89g(6.57mmol,1.40当量)羟基苯并三唑水合物和1.73g(13.4mmol；2.85当量)二异丙基乙基胺。将橙色溶液室温搅拌1小时，然后用300mL水稀释形成油状残余物。滗析出混浊的液体(主要含杂质)。将油状残余物在100mL水中搅拌过夜，过滤收集形成的硬的固体，得到4.2g浅黄色固体。由滤液得到1.0g黄色固体状第二批产物，总收率5.2g FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OBzl。(M计算值1262M+1实测值1262.5)。d．苄酯的脱除FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH的合成。
将5.9g(4.7mmol)FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OBzl的25mL二甲基甲酰胺溶液用5.9g木炭处理并过滤，然后用0.59g 10％Pd/C处理并在Parr装置中置于50psig氢气下。1.5小时后，将混合物过滤，再次用木炭处理，过滤，再次加入0.59g 10％ Pd/C并和置于50psig氢气下2小时。将混合物过滤并将滤液用50mL水稀释，用3×200mL二氯甲烷萃取。将合并的二氯甲烷萃取液浓缩得到1.2g油状的FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH。(M计算值1171；M+1实测值1172.3)。3．纯化将400mg FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH样品溶于10mL 1∶1三氟乙醇/异丙醇。将样品分成两个5mL栓注射到用55％B(A=0.1％vl/vl三氟乙酸水溶液；B=v/v75％乙腈/25％异丙醇+0.1％三氟乙酸)平衡的制备HPLC柱(Microsorb MV C18.300Ang,8u,41.4×250mm)上。将填料以70mL/分钟的流速洗脱，洗脱梯度为在30分钟内从55％B至65％B，在1分钟内从65％B至95％B，然后用95％B进行恒溶剂成分柱洗脱10分钟。用UV在210nM监测流出液。收集纯度为93.5A％或更高的馏份，并通过旋转蒸发进行浓缩。将残余物冷冻干燥得到200mg FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OH(M计算值1171:M+1实测值1172.6)。步骤3 将FMOC-[Trp23(BOC),Arg25(PMC),Lys26(BOC),Leu27,Gln29(Trt)]HPTH(23-31)-氯代三苯甲基树脂(1g,0.185mmole)在10mL二甲基甲酰胺中振摇30分钟进行溶胀，然后滗干，用10mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)处理并振摇30分钟。将树脂滗干并用3×20mL二甲基甲酰胺洗涤。加入240mg(0.205mmole,1.1当量)FMOC-环(Lys18-Asp22)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH、312mg(0.6mmole,3当量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP)和156mg(1.2mmole,6当量)二异丙基乙基胺的10mL二甲基甲酰胺溶液，并将混合物搅拌16小时。将树脂滗干并用3×20mL二甲基甲酰胺洗涤(TNBS阳性)，再次用FMOC-环(Lys18-Asp22)Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-OH/PyBOP/iPr2NEt处理16小时，然后将树脂滗干并用3×10mL二甲基甲酰胺洗涤(TNBS阴性)。按照方法A步骤2中的描述用试剂K将一部分标题肽从树脂上裂解下来，得到侧链脱保护了的肽片段。(LC-MS:M计算值2001；M实测值2000.5)。剩余的物质用于步骤4。步骤4 所需的树脂结合肽通过将1.38g(0.244mmole，以Trp23的滴度计)步骤3的树脂结合肽按照步骤1除去Fmoc保护基，然后按照步骤1顺次进行FMOC脱除和用各0.5亳摩尔的FMOC-Ser(OtBu)-OH、FMOC-Asn(Trt)-OH、FMOC-Leu-OH、FMOC-His(Trt)-OH和FMOC-Lys(BOC)-OH偶联的循环，在每次偶联时使用190mg(0.5mmole)O-苯并三唑-1-基-N,N,N＇,N＇-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和2mmole N-甲基吗啉的25mL二甲基甲酰胺溶液。偶联在室温下进行约1小时。将最终的树脂肽用每份25mL的二甲基甲酰胺、四氢呋喃和乙醚洗涤，然后真空干燥(1.93g)。将一部分标题肽按照以下描述从树脂上裂解(试剂K)得到侧链脱保护了的肽片段(LC-MS:M计算值2579.4；M实测值2580.7)，纯度52A％。步骤5Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OHFMOC-[Ala1,Ser3(OtBu),Glu4(OtBu),Gln6(Trt),His9(Trt),Asn10(Trt)Nle8]hPTH(1-12)标题肽通过将2.65g(5mmole)Fmoc-Leu-OH与5g(3mmole)1％交联的0.6毫当量/g的Gly-2-氯代三苯甲基树脂用3.9g(7.5mmole)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP)、1.94g(15mmole)二异丙基乙基胺在50mL二甲基甲酰胺/四氢呋喃(v/v)中振摇0.5小时偶联制得。将树脂滗干，然后用二甲基甲酰胺/四氢呋喃洗涤5次并用甲醇洗涤1次(茚三酮阴性)。将树脂用二甲基甲酰胺洗涤一次，然后用60mL20％哌啶/二甲基甲酰胺处理2次，每次15分钟，在各次处理之间用3×60mL二甲基甲酰胺和1×60mL甲醇处理。在第二次处理后，茚三酮呈强阳性。重复该循环，每次循环采用单次的0.5小时哌啶二甲基甲酰胺处理，并使用各2.5摩尔当量的FMOC-Asn(Trt)、FMOC-His(Trt)、FMOC-Nle、FMOC-Leu、FMOC-Gln(Trt)、FMOC-Ile、FMOC、Glu(OtBu)、FMOC-Ser(OtBu)、FMOC-Val和FMOC-Ala以及各2.5摩尔当量的PyBOP和二异丙基乙基胺。通过与100mL乙酸/三氟乙烯/和二氯甲烷(1∶1∶8)一起振摇1小时将树脂裂解。从树脂中滗析出液体，然后将树脂用200mL二氯甲烷洗涤；然后将洗涤液与液体的主要部分合并。将其依次从己烷、乙酸乙酯和异丙醇中蒸发。将残余物用乙醚研制，然后干燥(真空，过夜)得到2.24g标题肽(HPLC:83A％纯度)。将树脂再次在裂解条件下处理，将液体按照第一次裂解后的方式处理，最后得到2.75g第二批的标题肽(HPLC:00A％纯度)，总收率为4.95g(2.1mmole,70％收率，以树脂计)。[LC-MS(M计算值1514.8；M实测值1514.7]。该物质直接用于步骤6。步骤6 将步骤5制得的肽(900mg,0.114mmole)在振摇下在15mL二甲基甲酰胺中溶胀40分钟，然后将树脂滗干并用15mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)处理45分钟。将树脂滗干并用3×30mL二甲基甲酰胺处理(树脂TNBS试验阳性)。向其中加入15mL二甲基甲酰胺、775mg(0.33mmole，以23位的滴度计，为2.7摩尔当量)FMOC-[Ala1,Ser3(OtBu),Glu4(OtBu),Gln6(Trt),His9(Trt),Asn10(Trt)Nle8]hPTH(1-12)(由步骤4制得)、151mg(0.29mmole,0.2摩尔当量)苯并三唑基氧基-三[吡咯烷基]-鏻六氟乙酸盐(PyBOP)、39mg(0.25摩尔)羟基苯并三唑水合物和75mg(0.58mmole)二异丙基乙基胺，然后将混合物振摇3天。将树脂滗干，用3×30mL二甲基甲酰胺洗涤(TNBS，弱阳性和阴性小珠的混合物)，然后用15mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺(v/v)处理，滗干，用每份15mL的二甲基甲酰胺、四氢呋喃和乙醚各洗涤3次，然后干燥并按照步骤7从树脂上脱保护、裂解。步骤7 将步骤6制得的树脂按照方法A步骤1的描述处理以除去Ala1上的FMOC，然后在33/2/2/1/2三氟乙酸、苯酚、茴香硫醚、乙二硫醇和水的混合物(试剂K，总稀释度10mL/g树脂-肽)中同时进行裂解和脱保护3小时。将树脂滗干，将反应混合物加入到冷的叔丁基甲基醚(50mL/g树脂-肽)中使产物从滤液中沉淀出来。将混合物放置15分钟，然后离心(2000rpm,5分钟)。滗析出液体，将剩余的固体用乙醚洗涤，通过离心分离混合物的上清液并将上清液除去。将得到的固体在0.1％三氟乙酸水溶液(6mL/g树脂肽)中搅拌1小时，以确保完全除去对酸敏感的基团。将溶液冷冻干燥得到414mg白色固体状标题肽(37A％纯度，26.3％纯度(wt/wt)，以Trp23计，26.3％收率)。(LC-MS:M计算值3632.0；M+1实测值3633.4)。步骤8纯化将1g以上制得的物质溶于10mL水并将该溶液注射到2＂×25cm预先用75/5/20 0.1％三氟乙酸水溶液(A)/0.1％三氟乙酸的乙腈溶液(B)/异丙醇(C)平衡的制备HPLC(10微米，120A或300A)上。将柱子以115mL每分钟，以在30分钟内从75A/5B/20C到60A/20B/20C的梯度洗脱，然后用30％A,60％B,20％C冲洗并再次用75A/5B/20C平衡。用UV在280nm检测流出液。将含有大约75面积百分比纯度的标题肽的馏份合并，然后在旋转蒸发仪上(约35℃)浓缩。将浓缩的含水溶液泵到相同的制备柱上并再次用相同的30分钟梯度洗脱。将含有90A％或更高的面积百分比纯度标题肽的馏份合并，然后在旋转蒸发仪上(约35℃)浓缩。然后将浓缩的溶液泵到预先用75％ 0.1M乙酸铵水溶液(用乙酸调至pH6)(D)/15％乙腈(E)/10％异丙醇(C)平衡的制备柱上。将柱子以115mL/分钟，以在30分钟内从75D/15E/10C至60D/30E/10C的梯度洗脱，然后用30D/60E/20C冲洗。将含有95A％或更高的面积百分比纯度标题肽的馏份合并然后冷冻干燥，得到固体状乙酸盐形式的纯化产物(从1g粗品得到约100-200mg@大约95A％纯度)。在每一阶段，用分析HPLC在C18柱(4.6mm×25cm,5微米，120A或300A)上分析馏份的含量和纯度，梯度为30分钟内25-40％B(A=0.1％三氟乙酸/水；B=0.1％三氟乙酸/乙腈)，流速为1mL/分钟，用TV在220nm检测。
序列表<110>Sledeski,Adam W.
Mencel,James J.<120>制备树脂结合的环肽的方法<130>A3113A-WO<140><141><150>60/081,897<151>1998-04-15<160>47<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>1Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>2<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>2Ala Ala Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>3<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>3Ala Val Ala Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>4<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>4Ala Val Ser Ala Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>5<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Xaa Mis Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>6<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>6Ala Val Ser Glu Ile Ala Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>7<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>7Ala Val Ser Glu Ile Gln Ala Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>8<211>31<213>未知<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>8Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>9<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>9Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Ala Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>10<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>10Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Ala Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>11<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>11Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Ala Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>12<211>31<212>PRT<213>未知<220><22l>MOD_RES<222>(8)<223>N1e<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>12Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Ala His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<21O>13<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>13Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys Ala Leu Asnl 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>14<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>14Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Ala Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>15<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>15Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>16<211>31<2112>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(13)..(17)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>16Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Asp Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>17<211>31<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(26)..(30)<223>“在26位的Lys与在30位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(31)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>17Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>18<211>34<212>PRT<213>未知<220><221>MOD RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>18Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>19<211>34<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<221>肽<222>(13)..(17)<223>“在13位的Lys与在17位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>19Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Asp Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gin Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>20<211>34<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>20Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Lys Arg Arg Arg Asp Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala<210>21<211>34<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(34)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>21Ala Val ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Lys Arg Arg Arg Asp Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala<210>22<211>28<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys与在16位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Nle<400>22Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn ser Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe20 25<210>23<211>28<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys与在16位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>23Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Lys Arg Arg Arg Asp1 5 10 15Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala20 25<210>24<211>28<212>PRT<213>未知<220><221>MOD_RES<222>(8)<223>Nle<220><221>肽<222>(7)..(11)<223>“在7位的Lys与在11位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys与在16位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>24Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Asp Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn phe20 25<210>25<211>28<212>PRT<213>未知<220><22l>MOD_RES<222>(2)<223>Nle<220><221>肽<222>(12)..(16)<223>“在12位的Lys与在16位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(20)..(24)<223>“在20位的Lys与在24位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(28)<223>“此C-末端氨基酸为酰胺，即CONH2”<400>25Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Lys Glu Arg Val Asp1 5 10 15Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe20 25<210>26<211>34<212>PRT<213>未知<400>26Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>27<211>34<212>PRT<213>未知<400>27Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala<210>28<211>9<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Trp(BOC)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(4)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(7)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(8)<223>Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(9)<223>“此C-末端氨基酸通过酰胺键与氯三苯甲基树脂键合”<400>28Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>未知<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Trp(BOC)<220><221>肽<222>(3)<223>产物=Arg(PMC)<220><221>肽<222>(4)<223>产物=Lys(BOC)<220><221>肽<222>(7)<223>产物=Gln(Trt)<220><221>肽<222>(8)<223>产物=Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(9)<223>其它“此C-末端氨基酸通过酰胺键与Rink酰胺MBHA树脂键合”<400>29Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val1 5<210>30<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys与在5位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys与在5位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<400>30Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>31<211>14<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys与在5位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys与在5位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(6)<223>Trp(BOC)<220><221>肽<222>(8)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(9)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(12)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(13)<223>Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(14)<223>“此C-末端氨基酸通过酰胺键与Rink酰胺MBHA树脂键合”<400>31Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val<210>32<211>19<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(BOC)<220><221>肽<222>(2)<223>His(Trt)<220><221>肽<222>(4)<223>Asn(Trt)<220><221>肽<222>(5)<223>Ser(OtBu)<220><221>肽<222>(6)..(10)<223>“在6位的Lys与在10位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(7)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(8)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(6)..(10)<223>“在6位的Lys与在10位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(11)<223>Trp(BOC)<220><221>肽<222>(13)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(14)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(17)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(18)<223>Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(19)<223>“此C-末端氨基酸通过酰胺键与氯三苯甲基树脂键合”<400>32Lys His Leu Asn Ser Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu1 5 10 15Gln Asp Val<210>33<211>11<212>PRT<213>未知<221>肽<222>(1)<223>FMOC-Ala<220><221>肽<222>(3)<223>Ser(OtBu)<220><221>肽<222>(4)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(6)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(9)<223>His(.Trt)<220><221>肽<222>(10)<223>Asn(Trt)<400>33Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu His Asn Leu Gly1 5 10<210>34<211>30<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Ala<220><221>肽<222>(3)<223>Ser(OtBu)<220><221>肽<222>(4)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(6)<223>Gln (Trt)<220><221>肽<222>(9)<223>His(Trt)<220><221>肽<222>(10)<223>Asn(Trt)<220><221>肽<222>(13)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(14)<223>His(Trt)<220><221>肽<222>(16.)<223>Asn(Trt)<220><221>肽<222>(17)<223>Ser(OtBu)<220><221>肽<222>(18)..(22)<223>“在18位的Lys与在22位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(19)<223>Glu(ptBu)<220><221>肽<222>(20)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(22)..(30)<223>“在13位的Lys与在30位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(23)<223>Trp(BOC)<220><221>肽<222>(25)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(26)<223>Lys(BOC)<220><221>肽<222>(29)<223>Gln(Trt)<220><221>肽<222>(18)<223>Asp(OtBu)<220><221>肽<222>(30)<223>“此C-末端氨基酸通过酰胺键与Rink酰胺MBHA树脂键合”<400>34Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser1 5 10 15Lys Glu Arg Val Asp Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>35<211>2<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(2)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(1)<223>BOC-Val<220><221>肽<222>(2)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>35Val Asp1<210>36<211>2<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>“N-末端氨基酸是以盐酸盐的形式”<220><221>肽<222>(2)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(2)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>36Val Asp1<210>37<211>3<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Arg(PMC)<220><221>肽<222>(3)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(3)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>37Arg Val Asp1<210>38<211>3<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(3)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(3)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>38Arg Val Asp1<210>39<211>4<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(2)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(4)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(4)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>39Glu Arg Val Asp1<210>40<211>4<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(2)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(4)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(4)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>40Glu Arg Val Asp1<210>41<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(Alloc)<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>Asp(OAllyl)<220><221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>41Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>42<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>42Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>43<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys与在5位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“在1位的Lys与在5位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(5)<223>“此C-末端氨基酸是以与苄醇形成的酯的形式”<400>43Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>44<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>“在1位的Lys与在5位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“在1位的Lys与在5位的Asp的侧链之间通过酰胺键连接”<400>44Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>45<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys(Alloc)<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>Asp(OAllyl)<220><22l>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp与氯三苯甲基树脂键合”<400>45Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>46<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp与氯三苯甲基树脂键合”<400>46Lys Glu Arg Val Asp1 5<210>47<211>5<212>PRT<213>未知<220><221>肽<222>(1)<223>FMOC-Lys<220><221>肽<222>(1)<223>“C-末端Asp与氯三苯甲基树脂键合”<220><221>肽<222>(2)<223>Glu(OtBu)<220><221>肽<222>(3)<223>Arg(PMC)<220><221>肽<222>(5)<223>“C-末端Asp与氯三苯甲基树脂键合”<400>47Lys Glu Arg Val Asp1 权利要求
1．制备下式化合物的方法 其中J、L和M是直链肽片段K1不存在或为环状肽片段,且K2是环状肽片段；该方法包括如下步骤(1)通过向树脂上顺次连接适宜保护的氨基酸残基制备M-，制得M- Ⅲ其中是适宜的肽合成树脂，M是多肽片段(2)通过常规的肽合成单独制备式Ⅳ的N-末端保护的环状多肽片段 其中P是适宜的胺保护基，(3)将Ⅲ与Ⅳ偶联得到式Ⅴ的肽 (4)如果K2不存在，则(a)以式Ⅵ的单个多肽的形式制备多肽片段J和L 然后将多肽Ⅵ与肽Ⅴ偶联得到式Ⅶ的肽 或者，选择性地，(b)向式Ⅴ的肽片段中顺次加入多肽J和L的保护了的单个氨基酸单元，或者，选择性地，(c)以多肽片段的形式单独制备J和/或L，并偶联到从式Ⅴ的片段开始的正在延伸的肽上；(5)当存在环肽K1时，则(a)通过常规的肽合成方法单独制备式Ⅷ的多肽片段 其中P是适宜的胺保护基，(b)制备式Ⅸ的肽片段 并将该片段与肽片段Ⅴ偶联得到式Ⅹ的肽片段 且(c)将环状肽片段Ⅷ与式Ⅹ的肽片段偶联得到式Ⅺ的肽片段 (d)制备式Ⅻ的肽片段 将片段Ⅻ与片段Ⅺ偶联，然后(6)将树脂裂解并脱保护。
2．权利要求1的方法，其中，式Ⅰ的肽是下式的环肽化合物X-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Y其中X选自(a)R1a-A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(b)R1a-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(c)R1b-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(d)R1a-A4-A5-A6-A7-A8-A9-,(e)R1a-A5-A6-A7-A8-A9-,(f)R1a-A6-A7-A8-A9-,(f)R1b-A6-A7-A8-A9-,(g)R1a-A7-A8-A9-,(h)R1a-A8-A9-,(i)R1a-A9-，和(j)R1a-；Y选自(a)-R3,(b)-A28-R3,(c)-A28-A29-R3,(d)-A28-A29-A30-R3,(e)-A28-A29-A30-A31-R3,(f)-A28-A29-A30-A31-A32-R3,(g)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3,和(h)-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3；R1a为H、烷基、芳烷基或-COR2；R1b为R1a或下式的基团 或 R2为烷基、链烯基、炔基、芳基或芳烷基；R3为式A35-OR4或A35-NR4R5的基团；R4和R5彼此独立地为H或低级烷基；R6和R9彼此独立地为H或烷基；R7为烷基；R8为H、烷基或COR2；R10为H或卤素；R11为烷基或芳烷基；m为1,2或3；n为3或4；A0不存在或为1-6个氨基酸残基的肽；A1为Ser、Ala、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A2为Ala、Val或Gly或其等同的氨基酸；A3为Ala、Ser、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A4为Glu、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A5为Ile、His、Ala或Gly或其等同的氨基酸；A6为Ala、Gln、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A7为Ala、Leu、Gly或其等同的氨基酸；A8为Leu、Nle、Gly或D-Pro或其等同的氨基酸；A9为His、Ala、D-Pro或Gly或其等同的氨基酸；A10为Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A11为Ala、Gly、Leu或Lys或其等同的氨基酸；A12为Ala或Gly或其等同的氨基酸；A13为Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Tbr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A14为Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、His、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A15为Ala、Gly、Ile、D-Pro或Leu或其等同的氨基酸；A16为Asn、Ala、Gly、D-Pro或Gln或其等同的氨基酸；A17为Ala、Asn、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、D-Pro、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A18为Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Leu、Lys、Orn、Nle、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A19为Arg或Glu或其等同的氨基酸；A20为Arg或其等同的氨基酸；A21为Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Lys、Orn、Ser、Thr、Val、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A22为Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Phe、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A23为Leu、Phe或Trp或其等同的氨基酸；A24为Leu或其等同的氨基酸；A25为Arg、Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、D-Pro、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A26为Asp、Cys、同型Cys、Glu、His、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A27为Leu或Lys或其等同的氨基酸；A28为Ile或Leu或其等同的氨基酸；A29为Ala、Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gln、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A30为Asp、Cys、同型Cys、Glu、Gly、Lys、Orn、Ser、Thr、-NHCH(CH2)mNH2)CO-或-NHCH[(CH2)nCO2H]CO-；A31为Ile或Leu或Val或其等同的氨基酸；A32为His或其等同的氨基酸；A33为Asn或Thr或其等同的氨基酸；A34为Ala或Phe或其等同的氨基酸；A35不存在或为1-4个氨基酸的肽；和至少一个下面的氨基酸残基对的侧链经酰胺键、酯键、二硫键或羊毛硫氨酸键连接形成一个桥，这些氨基酸残基对为A10与A14、A13与A17、A14与A18、A17与A21、A18与A22、A21与A25、A25与A29和A26与A30，并且下面各个氨基酸残基的侧链最多导致形成一个桥，这些氨基酸残基为A10、A13、A14、A17、A18、A21、A22、A25、A26、A29和A30；条件是当下面的氨基酸残基对A13与A17或A26与A30的侧链经酰胺键、二硫键或羊毛硫氨酸键连接形成一个桥时，至少一个下面的氨基酸残基对的侧链A10与A14、A14与A18、A17与A21、A18与A22、A21与A25和A25与A29也经酰胺键、酯键、二硫键或羊毛硫氨酸键连接。
3．权利要求1的方法，用于制备环(Lys18-Asp22)[Ala1,Nle8,Lys18,Asp22,Leu27]hPTH(1-31)NH2该方法包括如下步骤(a)制备树脂结合肽片段AFmoc-Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-树脂 (A)；(b)制备环肽片段B (c)将步骤(a)的肽片段A与步骤(b)的肽片段(B)偶联形成中间体肽AB (d)向肽AB上顺次加成Ser(OtBu)、Asn(Trt)、Leu、His(Trt)和Lys(Boc)形成中间体肽C (e)制备肽片段D:Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH (D)；(f)将片段C和D偶联形成树脂结合肽EFmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly- 和(g)将树脂裂解并脱保护。
4．适于在权利要求3的方法中作为中间体的肽，所述的肽选自Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-树脂，Fmoc-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH，环(Lys18-Asp22)Fmoc-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-树脂，环(Lys18-Asp22)Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-树脂，Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-OH，环(Lys18-Asp22)Fmoc-Ala-Val-Ser(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(PMC)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-树脂，BOC-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,HCl·Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,FMOC-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,Arg(PMC)-Val-Asp(OAll)-Obzl,FMOC-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,Glu(OtBu)-(L)Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,FMOC-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp(O-烯丙基)-Obzl,FMOC-Lys-Glu(OtBu)-Arg(PMC)-Val-Asp-Obzl,FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Gtu-Arg-Val-Asp-Obzl,FMOC-环(Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OH,Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(O-烯丙基)-氯代三苯甲基树脂，Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基树脂，和Fmoc-环(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-氯代三苯甲基树脂。
全文摘要
本发明涉及以片段为基础固相合成与树脂结合的环状肽甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关蛋白类似物的方法,所述类似物含有至少一个在两个不相邻的氨基酸残基侧链之间的桥,本发明还涉及该方法所用的肽片段。
文档编号C07K5/078GK1323313SQ99811970
公开日2001年11月21日 申请日期1999年4月15日 优先权日1998年4月15日
发明者A·W·斯莱迪斯基, J·J·曼西尔 申请人:阿温蒂斯药物制品公司