专利名称：海滨锦葵多糖制备工艺及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生化分离技术领域，具体涉及从海滨锦葵中分离制备锦葵多糖的工艺 及用途。
二.
背景技术：
海滨锦葵(kostelezkya virginica)是锦葵科锦葵属多年生宿根盐生植物，天然分 布于美国东部沿海盐沼海岸带。1992年由南京大学引种至中国。有文献报道，海滨锦 葵的花、叶、根部可食用。尤其是根部可生食、可烹炸、可作茶饮，焙干碾碎可用作 糖果和口香糖原料，以增加胶粘度。根部浸出液可浓縮至蛋清状替代蛋清使用。多糖
在生物界分布很广，从其他动植物中分离制备多糖的研究方法有不少论文和专利。但 从海滨锦葵中提取锦葵多糖以及对锦葵多糖的研究论文很少见到，专利至今未有。
根据我们的研究我们认为锦葵多糖是一种杂多糖，属多糖类。在锦葵根部含量丰 富。从生物学实验证明，锦葵多糖具有增强免疫力的生物学功能。可作为人体非特异 性免疫增强剂，促进体液免疫及细胞免疫，加强抗体或补体生成。该多糖可制成片剂、 口服液、胶囊等作为保健食品给免疫低下者使用，促进他们的健康。也可进一歩制成 药品，供免疫低下或肿瘤病人辅助治疗使用。
三.
发明内容
本发明需要解决的问题是从海滨锦葵的根中提取出锦葵多糖，并利用锦葵多糖的 生物学功能将其制成片剂、胶囊、口服液等保健食品，供免疫力低下者使用。还可制 成药品供病患者使用。
本发明技术方案
l.海滨锦葵多糖提取工艺採集海滨锦葵新鲜根，洗净、晒干或烘干，粉碎。取 干粉，按比例l: 15加入蒸馏水，用超声仪加温超声提取。超声条件功率200瓦， 温度6(TC，时间1小时。超声后用纱布过滤。同样条件再重复一次；两次滤液合并。
将滤液蒸发部分后，用乙醇沉淀，将沉淀干燥得粗多糖。将锦葵粗多糖加入适量水溶
解后，加入等体积20%三氯乙酸，沉淀夫除蛋白，离心得上清液，减压蒸馏后的浓縮
液对水透析，透析后的溶液加乙醇沉淀，干燥，得去蛋白锦葵多糖(锦葵多糖简称
JKDT，以下同)溶液,简称为JKDT-1。
从上步骤得到的JKDT-1用DEAE-纤维素柱层析，梯度洗脱，分别检测，得到洗 脱液，合并有效组分，浓缩，乙醇沉淀，干燥，得组分JKDT-2A 、 JKDT-2B。得到
3的JKDT-2A组分再用sephcryl -200柱层析，纯化分离，得到三个组分，分别是 JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C。根据实验结果，JKDT-2B用sephacryl-200层析后仍 为一个峰，不需要再层析。因此锦葵多糖最后组分为四个，分别是:JKDT-2B、JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C。
2.锦葵多糖的生物学功能实验 锦葵多糖免疫活性试验
表l多糖对T细胞增殖的影响(培养24h)
齐懂(U g/ml)A值A值(加conA)
(X±S)(X±S)
对照0. 3715±0. 04330. 4408±0. 0280
3001. 7162±0. 1636*1. 7839±0. 1055*
2001. 7277±0. 2898*1. 7164土0. 1755*
1001. 5621±0. 5384*1. 6524±0. 1770*
501. 5879±0. 5450*1. 7720±0. 2324*
401. 3701±0. 5670*1. 1304±0. 7834*
P*<0. 05
表2多糖对B细胞增殖的影响(培养24h)剂量(U g/ml)A值A值(加conA)
(x±S)(X±S)
对照0. 4840±0. 06280. 4467±0. 0537
3001. 7556±0. 0701*1. 6803±0. 0563*
2001.6967±0. 0577*1. 5382±0. 5727*
1001. 5463±0. 1927*1.4199±0. 4631*
501. 1781±0. 5431*1.4526±0. 4327*
401. 1938±0. 5144*1. 0293±0. 5641*
P*〈0.05
3.锦葵多糖的测定-酚-硫酸法。
本方法是用苯酚-硫酸试剂与锦葵多糖的己糖醛酸起反应，在490nm处产生特征 性光吸收，以光吸收值大小参比标准曲线来确定锦葵多糖的含量。苯酚试剂取苯酚 200克，加铝片0.2克和NaHC03 0.1克，蒸馏，收集180-182。C馏分称取15克，加 蒸馏水溶解，定容于250ml容量瓶。取干燥的葡萄糖标准品，准确配制浓度为 250^g/ml。分别取O.O， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0.7， 0.8ml,放入试管， 再分别补加蒸馏水至l.Oml，加入苯酚试剂l.Oml,再加入浓硫酸5.0ml,冷却后于 490nm处测定光吸收值，以浓度对光吸收值作标准曲线。锦葵多糖同法配制 25-200)^g/ml范围内浓度，取1. (M后再加入1. Oml苯酚试剂，5. Oml浓硫酸，冷却后测490nm处光吸收值，对照标准曲线计算锦葵多糖的含量。
本发明有益效果是使用了超声方法，并且采用中温度技术(60°C)，从海滨锦葵 中第一次提取了锦葵多糖，并利用现有技术进行了纯化。从我们对模型动物的实验发 现，锦葵多糖具有增强实验动物免疫力的功能。可制备成提高免疫功能的保健食品。 通过进一步的实验和研究，锦葵多糖也可制备成治疗肿瘤的药物。 四.
具体实施例方式
取新鲜採集的海滨锦葵根，洗净、干燥、粉碎，取样200克干粉，以1;15的比 例加入蒸馏水，用超声仪超声抽提，抽提条件温度6(TC，超声功率200W,时间l小 时，超声后用纱布过滤，滤渣再用上述条件处理一次。合并两次滤液，得4500ml，减 压蒸发得860ml,加乙醇至最终浓度为70%，搅拌，得粘性沉淀，去上清，绸布过滤， 沉淀5(TC烘干，得锦葵多糖粗品10. 2克。
取锦葵多糖粗品5. 0克，加蒸馏水250ml,溶解后加入20%三氯乙酸250ml，冷藏 于8"冰箱冷藏，次闩取上清，沉淀部分离心5000 r/分，10分钟，合并得上清490ml， 减压浓縮至50ml,装透析袋对水透析。除去三氯乙酸，得无蛋白锦葵多糖溶液194ml。
将按常规方法处理好的DEAE-纤微素，装柱后水洗至中性，取上述无蛋白锦葵多 糖溶液94ml,加水一倍，上样；上样结束后，先用水洗涤两个床体积，再用0-1.0MNaCL 洗脱锦葵多糖，经检测洗脱峰有两个，I峰收集120ml, II峰收集448ml，再分别^k縮 至I峰60ml， II峰162ml;两峰浓縮液分别加入4倍体积95%乙醇沉淀多糖，放置4-6 小时后，用砂芯漏斗抽滤，分次用无水乙醇脱水，5(TC烘干。I峰得干品JKDT-2A 53.6mg, II峰得JKDT-2B 362mg。
将JKDT-2A 53.6mg样品加水10ml溶解，上样于按常规处理并装好的 s印hacryl-200柱，经洗脱得到三个组分，经检测计算其含量分别是JKDT-3A 1.16mg, JKDT-3B 3.95mg.JKDT-3C 8. 3mg。
锦葵多糖含量纯度检查酚-硫酸法。本方法是用苯酚-硫酸试剂与锦葵多糖的己 糖醛酸起反应，在490nm处产生特征性光吸收，以光吸收值大小参比标准曲线来确 定锦葵多糖的含量。苯酚试剂取苯酚200克，加铝片0.2克和NaHC03 0.1克，蒸 馏，收集180-182'C馏分。称15克，加蒸馏水溶解，定容于250ml容量瓶。放入棕色 瓶，冰箱保存备用。取干燥的葡萄糖标准品，准确配制浓度为25(^g/ml。分别取O.O， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0,7， C ftr〗,放入试管，再分别补加蒸馏水至1. Oml， 加入苯酚试剂1. Oml,再加入浓硫酸5. Oml，冷却后于490nm处测定光吸收值，以'浓度 对光吸收值作标准曲线。锦葵多糖同法配制25-20(^g/ml范围内浓度， 1.0ml后再 加入1. Oml苯酚试剂，5. Oml浓硫酸，冷却后测490nm处光吸收值，对照标准曲线计 算锦葵多糖的含量。
权利要求
1.一种从海滨锦葵中分离制备锦葵多糖的工艺，其特征是探集海滨锦葵鲜根，洗净，烘干，粉碎，干粉中加入1∶15的蒸馏水，用超声仪超声提取，超声条件温度60℃，功率200W，时间1小时，超声结束后，用两层纱布过滤，滤液存放，滤渣再用上述条件重复一次，两次滤液合并，减压蒸发，得浓缩液，加入乙醇使最终浓度为70％，搅拌后低温静置10-12小时，虹吸去上清，将沉淀抽滤，烘干，得锦葵多糖粗品。
2. 根据权利1所述从海滨锦葵中分离制备锦葵多糖的工艺，其特征是锦葵粗多 糖产品，加适量蒸馏水溶解，加入等体积20%三氯乙酸，静置12小时以上，离心去、沉 淀，上清液为去蛋白多糖溶液，减压浓缩，再对蒸馏水透析去除三氯乙酸，得除蛋白 锦葵多糖溶液。
3. 根据权利2所述制备从海滨锦葵中分离制备锦葵多糖的工艺，其特征是用 DEAE-纤维素柱层析进行分离，上样液以合适浓度上样，洗脱液为0-lmol/LNaCL梯 度，分部收集，用苯酚-硫酸法检测糖浓度，得到糖浓度-洗脱体积曲线，根据洗脱曲 线辨别分离峰，分别合并有效洗脱部分，减压浓縮后用95%乙醇调乙醇最终浓度为 80%，静置过夜，用砂芯漏斗抽滤多糖，再分别用95%乙醇、无水乙醇脱水，烘干， 得锦葵多糖，锦葵多糖简称JKDT，两个组分分别是JKDT-2A、 JKDT-2B。
4. 根据权利3所述方法得到的JKDT-2A，其特征是进行sephacryl-200柱层析， 柱层析后得JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C，根据以上方法，从海滨锦葵根中分离得 到四个纯组分分别是JKDT-2B、 JKDT-3A、 JKDT3B、 JKDT-3C。
5. 根据权利要求4所述方法制备的海滨锦葵多糖纯品在制备具有调节免疫功能 的保健食品中的应用。
6. 根据权利要求4所述方法制备的海滨锦葵多糖纯品在制备治疗肿瘤药物中的 应用。
全文摘要
本发明属于生化分离技术领域，具体涉及海滨锦葵多糖的制备工艺及用途，本发明从海滨锦葵中分离、纯化锦葵多糖工艺，从新鲜海滨锦葵根、得干粉，超声，乙醇沉淀，三氯乙酸去蛋白，DEAE-柱层析，sephacryl-200再层析。共得到四个组分JKDT-2B、JKDT-3A、JKDT-3B、JKDT-3C。该产品可制成片剂、口服液、胶囊作为保健品给免疫低下者使用。还可进一步制成治疗肿瘤的药品。
文档编号C08B37/00GK101638444SQ200910032020
公开日2010年2月3日 申请日期2009年7月7日 优先权日2009年7月7日
发明者张太平, 张鹤云, 佩 钦 申请人:南京大学