专利名称：温度敏感聚乙烯亚胺-接枝-聚丙烯酸寡乙二醇酯嵌段共聚物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及温度敏感性转基因载体的制备，特别是一种聚乙烯亚胺-接枝-聚丙烯酸乙 酯嵌段共聚物及制备方法和应用，具体是聚乙烯亚胺-接枝-聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧 基乙氧基)乙酯/甲基丙烯酸-e-羟乙酯[PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)]嵌段共聚物及制备方 法和应用。
背景技术：
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以 纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体(viral vector) 和非病毒载体(nonviral vector)两种。可采用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关 病毒(AAV)等。非病毒载体包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。
阳离子高聚物作为非病毒载体的一部分，它既存在非病毒载体的特点(即低毒性，低 免疫原性和低致癌性)以外，还有自身的优势，易制备和携带目的基因能力高，有利于其 作为转基因载体的应用。但基因转染效率远低于病毒载体。常见的阳离子高聚物能够通过 强静电作用有效縮合DNA，形成的聚电解质复合物(PECs)较稳定。这些PECs易于细胞内 化，从内涵体中逃逸，并能保护DNA免受DNA酶的降解。但是，强烈的静电作用也限 制了基因进入细胞核之后从复合物中的释放，限制了基因的表达。针对阳离子聚合物载体 与pDNA复合物解包裹成为最终基因转染的障碍，现在主要是提高其转染的可控制性，进 而提高其转染效率。
智能高分子载体的自适应特性能有效解决常规载体对于DNA"易包装、难拆解"的难 题，具有很好的应用前景。其中温度敏感性载体以其设计方便，调解灵活的特点受到了极 大的关注，被广泛用于药物、基因控制释放领域。
对于温度响应性聚合物来说，其低临界溶解温度以下溶于水，高分子链段呈无规线团 状；温度高于LCST时，高分子链段从水中析出，链段呈密实的小球。温度敏感组分与压 縮DNA组分结合既保持温度响应性，又具有复合DNA的功能，因而，通过改变温度， 利用温度敏感组分的相变可实现对DNA结合和解离的调控。
近年来， 一些以聚异丙基丙烯酰胺为温度敏感组分的转基因载体被研制成功，并得到 了很好的转染结果。Hinrichs等首次将异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)与N,N，-(二甲基胺乙基)甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的共聚物作为温度和pH值响应的转基因载体，其中NIPAAm提 供温度响应性，DMAEMA存在氨基，可提供一定的正电荷密度，可与DNA的静电相互作 用形成复合物。增加共聚物中NIPAAm的含量，复合物的细胞毒性明显降低，这说明 NIPAAm对于DMAEMA的细胞毒性有明显的屏蔽效应。他们的结果显示高分子量的共聚 物对卵巢癌细胞的转染效果较好，但未能得出聚合物的LCST和转染之间的相关性 Yokoyama等将疏水单元甲基丙烯酸丁酯(BMA)弓|入到PNIPAAm-co-DMAEMA体系形成 三元共聚物，来调节相变温度。体外转染实验研究发现温度变化不会影响不含NIPAAm的 共聚物，而三元共聚物的变温培养的转染效率比恒温培养的转染效率高，另外还发现在更 高的温度(37'C和45'C)进行复合得到的复合物比在室温条件下得到的复合物的转染效率更 高。刘文广等通过化学合成方法合成两亲性壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯 (PNVLCS)共聚物，并考察PNVLCS共聚物的温度敏感性。研究发现温度变化可引起共聚 物载体的相转变，并影响到与DNA的结合程度。PNVLCS成功地将 pTracerTM-CMV/Bsd/lacZ Vector质粒转入C2C12细胞内，温度敏感PNVLCS共聚物载体的 转染效率可由温度控制进一步提高。最近，刘文广等又通过自由基聚合反应和偶联反应制 备了聚异丙基丙烯酰胺凍精氨酸缀合物(PNIPArg)，通过FTIR和13〔 NMR实验证实了偶联 产物。由浊度法测定了缀合物水溶液的LCST为35.2'C。 PNIPArg缀合物与质粒DNA通过静 电作用形成复合物，呈现均一球状形态。以绿猴肾细胞COS-l为宿主细胞，考察了PNIPArg 载体对含有可表达荧光素酶(l uciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)的质粒PGL3和pEGFP—C 1 体外转染效率，其转染效率明显高于裸DNA,同脂质体相当。同时可以通过改变温度调控 基因的表达效率，NIPAAm的引入显著降低了载体的细胞毒性。
阳离子高聚物的典型代表是聚乙烯亚胺(PEI),它是一种高效的被广泛应用的阳离子高 聚物基因载体。细胞毒性是限制PEI作为非病毒载体进一步应用的主要因素。PEI的转染 效率及细胞毒性与分子量有关。研究发现低分子量(10KDa)和中等支化度的PEI具有高 效转染效率的同时，也具有比商业化高分子量PEI较低的毒性。
目前所研究的温度敏感性非病毒载体的温敏组分为聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)， PNIPAAm是目前研究和应用最多的一类温度敏感聚合物，其温度敏感行为被认为是这一 领域的黄金法则，然而最近研究者发现PNIPAAm有如下缺点(l)低分子量聚合物的相 转变不可逆性；(2)末端官能团影响聚合物的热行为；(3)体内生物相容性存在问题。最 近，侧链为寡聚乙二醇的温度敏感聚合物越来越引起研究者们的兴趣，有替代PNIPAAm之势。这类温敏聚合物具有更好的生物相容性，相转变几乎不受水溶液浓度、离子强度和 链长等因素影响。该类温敏聚合物有很好的生物应用前景。聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧 基乙氧基)乙酯(PMe02MA)是该类聚合物的典型代表，其水溶液的LCST为26°C。
本发明的目的在于提供一种温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物及制备方 法和应用。该温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物具有转基因的能力并能实现 对于DNA运输和表达的调控。本发明制备方法简单，合成条件温和。
本发明提供的一种温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物的结构如下式所
其中，m为50 200, n为10 100， x为25 50，分子量分布指数为1.1 1.3，为 AB型二嵌段共聚物。
单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯与甲基丙烯酸-P-羟乙酯两单体的共聚 比为1-10:1。
本发明提供的一种温度敏感PEI-g- (Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物的制备方法是经 过以下步骤用顺序加料的原子转移自由基聚合方式，合成聚(2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲 氧基乙氧基)乙酯-b-甲基丙烯酸-(3-羟乙酯)(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物；再以羰基二 咪唑为反应中间体，先利用羰基二咪唑活化HEMA链段末端的OH，然后再与聚乙烯亚胺 (PEI)反应，制备PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物；具体为
1) 在Schlenk管中加入单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(Me02MA)和催 化剂氯化亚铜，用乙醇溶解，用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除 去反应体系中的氧气；
2) 在氮气保护下用注射器将引发剂2-溴异丁酸乙酯(EBiB)和配体2,2'-联吡啶(bpy)的 乙醇溶液加入上述Schlenk管中，反应混合物经过反复冻融三次后，真空密封，在40-8(TC 水浴中搅拌反应2-8小时；
发明内容
1
、9
0-S~(~NHCH2CH2"^rNH23) 液氮终止反应，向反应体系中通氮气，用注射器加入甲基丙烯酸-(3-羟乙酯(HEMA) 的乙醇溶液，经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在40-8(TC水浴中搅拌反应4-12小时；
4) 用液氮冷冻终止反应，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量3500) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
5) 将步骤4)产物和羰基二咪唑加入到三口烧瓶中，再加入二甲基亚砜，密闭后通 N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反应12小时；反应液滴用无水乙醚洗 涤三次，静置后得油状沉淀。
6) 室温搅拌下，油状沉淀加入聚乙烯亚胺(PEI)的二甲基亚砜溶液溶解，再反应4 个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000)在去离子水中透析， 8小时换一次水，透析5天后冻干。
在1-3小时内逐滴滴加二甲基亚砜溶解步骤5)的油状沉淀沉淀。 本发明提供的一种温度敏感PEI-g- (Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物的用于转基因载 体，可实现对于DNA运输和表达的调控。步骤是将上述载体溶于原子级水中得到不同 浓度的载体溶液，并用0.22pm滤器过滤除菌。为制备复合比为1-60:1 (复合比均为载体 与DNA的质量比，简称为复合比)的载体/pDNA复合物溶液，将一定浓度的载体溶液加 入到等体积的质粒(pGL3) DNA溶液中，20-37'C复合30分钟将复合物溶液加入到己 培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采取不同的控温路 线进行转染后的培养(1) 37°C 48小时，(2) 37°C (21小时)—20°C (3小时)—37°C (24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性。
本发明提供了温度敏感PEI-g- (Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物。该温度敏感 PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物具有转基因的能力并能实现对于DNA运输和表达 的调控。本发明制备方法简单，合成条件温和。
图1是荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。
具体实施例方式
实施例中m为100， n为10， 20， 30, x为25 50,分子量分布指数为1.1 1.3 实施例一
将单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(2.214ml， 12mmo1，理论聚合度为 100)和催化剂Cu(I)Cl(11.9mg， 0.12mmol)加入Schlenk管中，用2mL乙醇溶解。用液氮 冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂2-溴异丁酸乙酯(EBiB)(18.4nl， 0.12mmol)和配体2,2'-联吡啶(bpy)(37.5mg， 0.24mmol)溶解于 lml乙醇中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真空密封，在60'C水浴中搅拌反应4小时。在第一步反应结束后，向反应体系中通 氮气，用注射器加入1 ml甲基丙烯酸-p-羟乙酯(HEMA)(156nl， 1.2 mmol，理论聚合度为 IO)的乙醇溶液。经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在6(TC水浴中搅拌反应4小时。 反应完成后用液氮冷冻终止反应。用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量 3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
取上一步反应产物(lg)和羰基二咪唑(5.84g， 36mmo1)加入到三口烧瓶中，再加 入二甲基亚砜(25ml)，密闭后通N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反 应12小时。反应结束后，反应液滴加到1000ml无水乙醚中，静置后得油状沉淀。用二甲 基亚砜(10ml)将沉淀溶解，将聚乙烯亚胺(PEI) (7.2g， 6mmol)用二甲基亚砜(30ml) 溶解后加入到三口瓶中，室温搅拌下，在1小时内逐滴滴加用二甲基亚砜(10ml)溶解的 沉淀，再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
将得到的最终产物(LCST为32.5°C) 2mg溶于lml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒 DNA溶液混合配制成PEIMH/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合 物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采 取不同的控温路线进行转染后的培养(1) 37'C48小时，(2) 37°C (21小时)—20°C (3 小时)—37°C (24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路 线(1)来说为6.23xl07RLU/mgprotein; 控温路线(2)为Ulx108 RLU/mgprotein。
实施例二
将单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(2.214ml， 12mmol，理论聚合度100) 和催化剂Cu(I)Cl(11.9mg， 0.12mmol)加入Schlenk管中，用2mL乙醇溶解。用液氮冷冻， 脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂2-溴异丁酸 乙酯(EBiB)(18.4nl， 0.12mmol)和配体2,2'-联吡啶(bpy)(37.5mg， 0.24mmol)溶解于lml乙 醇中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真 空密封，在6(TC水浴中搅拌反应4小时。在第一步反应结束后，向反应体系中通氮气， 用注射器加入1 ml甲基丙烯酸-p-羟乙酯(HEMA)(156jil， 1.2mmo1,理论聚合度为IO)的乙 醇溶液。经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在6(TC水浴中搅拌反应4小时。反应完 成后用液氮冷冻终止反应。用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量3500) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
取上一步反应产物(lg)和羰基二咪唑(5.84g， 36mmo1)加入到三口烧瓶中，再加 入二甲基亚砜(25ml)，密闭后通N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反 应12小时。反应结束后，反应液滴加到1000ml无水乙醚中，静置后得油状沉淀。用二甲 基亚砜(10ml)将沉淀溶解，将聚乙烯亚胺(P迈)(7.2g， 6mmol)用二甲基亚砜(30ml) 溶解后加入到三口瓶中，室温搅拌下，在1小时内逐滴滴加用二甲基亚砜(10ml)溶解的沉淀，再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
将得到的最终产物(LCST为32.5'C) 2mg溶于lml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒
DNA溶液混合配制成PEIMH/DNA复合物，复合质量比为30/1,静置30分钟后，将复合
物溶液加入到己培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采
取不同的控温路线进行转染后的培养(1) 37'C48小时，(2) 37°C (21小时)—20°C (3
小时)—37°C (24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路
线(1)来说为8.09xl07RLU/mgprotein; 控温路线(2)为1.72x108RLU/mgprotein。
实施例三
将单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯a214ml， 12rnrno1，理论聚合度100) 和催化剂Cu(I)Cl(11.9mg， 0.12mmol)加入Schlenk管中，用2mL乙醇溶解。用液氮冷冻， 脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂2-溴异丁酸 乙酯(EBiB)(18.4ial， 0.12mmol)和配体2，2'-联吡淀(bpy)(37.5mg， 0.24mmol)溶解于lml乙 醇中，在氮气保护下用注射器^^移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真 空密封，在6(TC水浴中搅拌反应4小时。在第一步反应结束后，向反应体系中通氮气， 用注射器加入1 ml甲基丙烯酸-(3-羟乙酯(HEMA)(156nl， 1.2mmo1，理论聚合度为IO)的乙 醇溶液。经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在60'C水浴中搅拌反应4小时。反应完 成后用液氮冷冻终止反应。用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量3500) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
取上一步反应产物(lg)和羰基二咪唑(5.84g， 36mmo1)加入到三口烧瓶中，再加 入二甲基亚砜(25ml),密闭后通N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反 应12小时。反应结束后，反应液滴加到1000ml无水乙醚中，静置后得油状沉淀。用二甲 基亚砜U0ml)将沉淀溶解，将聚乙烯亚胺(PEI) (7.2g， 6mmol)用二甲基亚砜(30ml) 溶解后加入到三口瓶中，室温搅拌下，在l小时内逐滴滴加用二甲基亚砜(10ml)溶解的 沉淀，再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
将得到的最终产物(LCST为32.5°C) 2mg溶于lml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒
DNA溶液混合配制成PEIMH/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合 物溶液加入到己培养至指数生长期的HEK293细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采 取不同的控温路线进行转染后的培养(1) 37'C48小时，(2) 37°C (21小时)—20°C (3 小时)—37'C (24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路 线(1)来说为1.46x107RLU/mgprotein; 控温路线(2)为7.19x107 RLU/mgprotein。实施例四
将单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(2.214ml, 12mmol，理论聚合度100) 和催化剂Cu(I)Cl(11.9mg, 0.12mmol)加入Schlenk管中，用2mL乙醇溶解。用液氮冷冻， 脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂2-溴异丁酸 乙酯(EBiB)(18.4pl， 0.12mmol)和配体2,2'-联吡啶(bpy)(37.5mg， 0.24mmol)溶解于lml乙 醇中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真 空密封，在60'C水浴中搅拌反应4小时。在第一步反应结束后，向反应体系中通氮气， 用注射器加入1 ml甲基丙烯酸-p-羟乙酯(HEMA)(156^， 1.2mmo1，理论聚合度为IO)的乙 醇溶液。经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在60'C水浴中搅拌反应4小时。反应完 成后用液氮冷冻终止反应。用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量3500) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
取上一步反应产物(lg)和羰基二咪唑(5.84g， 36mmo1)加入到三口烧瓶中，再加 入二甲基亚砜(25ml),密闭后通N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反 应12小时。反应结束后，反应液滴加到1000ml无水乙醚中，静置后得油状沉淀。用二甲 基亚砜(10ml)将沉淀溶解，将聚乙烯亚胺(PEI) (7.2g， 6mmol)用二甲基亚砜(30ml) 溶解后加入到三口瓶中，室温搅拌下，在l小时内逐滴滴加用二甲基亚砜(10ml)溶解的 沉淀，再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
将得到的最终产物(LCST为32.5。C) 2mg溶于lml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒
DNA溶液混合配制成PEIMH/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合 物溶液加入到已培养至指数生长期的耶K293细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采 取不同的控温路线进行转染后的培养(1) 37'C48小时，(2) 37°C (21小时)—20'C (3 小时)—37°C (24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路 线(O来说为4.49xl()7RLU/mgprotein; 控温路线(2)为1.20><108RLU/mgprotein。 实施例五
将单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(2.214ml, 12mmol，理论聚合度100) 和催化剂Cu(I)Cl(11.9mg， 0.12mmol)加入Schlenk管中，用2mL乙醇溶解。用液氮冷冻， 脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂2-溴异丁酸 乙酉旨(EBiB)(l8.4^1， 0.12mmol)和配体2，2'-联吡啶(bpy)(37.5mg， 0.24mmol)溶解于lml乙 醇中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真 空密封，在60'C水浴中搅拌反应4小时。在第一步反应结束后，向反应体系中通氮气， 用注射器加入1 ml甲基丙烯酸-j3-羟乙酯(HEMA)(156nl， 1.2mmo1，理论聚合度为IO)的乙 醇溶液。经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在60'C水浴中搅拌反应4小时。反应完成后用液氮冷冻终止反应。用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量3500) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
取上一步反应产物(lg)和羰基二咪唑(5.84g， 36mmo1)加入到三口烧瓶中，再加 入二甲基亚砜(25ml)，密闭后通N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反 应12小时。反应结束后，反应液滴加到1000ml无水乙醚中，静置后得油状沉淀。用二甲 基亚砜(10ml)将沉淀溶解，将聚乙烯亚胺(PEI) (7.2g， 6mmol)用二甲基亚砜(30ml) 溶解后加入到三口瓶中，室温搅拌下，在1小时内逐滴滴加用二甲基亚砜(10ml)溶解的 沉淀，再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
将得到的最终产物(LCST为32.5'C) 2mg溶于lml超纯水中，滤菌，与pEGFP-Cl 质粒DNA溶液混合配制成PEIMH/DNA复合物，复合质量比为25/1,静置30分钟后， 将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染2小时 后，采取不同的控温路线进行转染后的培养(a)37'C 40小时，(b)37'C (21小时)—20°C (3小时)—37°C (16小时)。40小时后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达(如下图 l所示，绿色荧光蛋白能大量表达，改变温度后，绿色荧光蛋A量略有增加)。
对比例一
将单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(2.214ml， 12mmo1，理论聚合度l加) 和催化剂Cu(I)Cl(11.9mg， 0.12mmol)加入Schlenk管中，用2mL乙醇溶解。用液氮冷冻， 脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂2-溴异丁酸 乙酯(EBiB)(18.4nl， 0.12mmol)和配体2,2'-联吡啶(bpy)(37.5mg， 0.24mmol)溶解于lml乙 醇中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真 空密封，在6(TC水浴中搅拌反应4小时。在第一步反应结束后，向反应体系中通氮气， 用注射器加入1 ml甲基丙烯酸-p-羟乙酯(HEMA)(312nl， 2.4mmo1，理论聚合度为IO)的乙 醇溶液。经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在60'C水浴中搅拌反应4小时。反应完 成后用液氮冷冻终止反应。用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量3500) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
取上一步反应产物(lg)和羰基二咪唑(7.78g， 48mmo1)加入到三口烧瓶中，再加 入二甲基亚砜(30ml)，密闭后通N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反 应12小时。反应结束后，反应液滴加到1000ml无水乙醚中，静置后得油状沉淀。用二甲 基亚砜(10ml)将沉淀溶解，将聚乙烯亚胺(PEI) (8.4g， 7mmol)用二甲基亚砜(35ml) 溶解后加入到三口瓶中，室温搅拌下，在1小时内逐滴滴加用二甲基亚砜(10ml)溶解的 沉淀，再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。将得到的最终产物(LCST为38.7°C) 2mg溶于lml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒 DNA溶液混合配制成PEIMH/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合 物溶液加入到已培养至指数生长期的C0S-7细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采 取不同的控温路线进行转染后的培养(1) 37'C48小时，(2) 37°C (21小时)—20°C (3 小时)—37°C (24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路 线(1)来说为1.6x 107 RLU/mg protein; 控温路线(2)为1.74x 107 RLU/mg protein。
对比例二
将单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(2.214ml， 12mmo1，理论聚合度100) 和催化剂Cu(I)Cl(11.9mg， 0.12mmol)加入Schlenk管中，用2mL乙醇溶解。用液氮冷冻， 脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂2-溴异丁酸 乙酯(EBiB)(18.4pl， 0.12mmol)和配体2，2'-联吡啶(bpy)(37.5mg， 0.24mmol)溶解于lml乙 醇中，在氮气保护下用注射器转移到Schknk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真 空密封，在6(TC水浴中搅拌反应4小时。在第一步反应结束后，向反应体系中通氮气， 用注射器加入1 ml甲基丙烯酸-j3-羟乙酯(HEMA)(312pl， 2.4mmo1，理论聚合度为IO)的乙 醇溶液。经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在60'C水浴中搅拌反应4小时。反应完 成后用液氮冷冻终止反应。用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量3500) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
取上一步反应产物(lg)和羰基二咪唑(7.78g， 48mmo1)加入到三口烧瓶中，再加 入二甲基亚砜G0ml),密闭后通N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反 应12小时。反应结束后，反应液滴加到1000ml无水乙醚中，静置后得油状沉淀。用二甲 基亚砜(10ml)将沉淀溶解，将聚乙烯亚胺(PEI) (8.4g， 7mmol)用二甲基亚砜(35ml) 溶解后加入到三口瓶中，室温搅拌下，在1小时内逐滴滴加用二甲基亚砜(10ml)溶解的 沉淀，再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
将得到的最终产物(LCST为38.7'C) 2mg溶于lml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒 DNA溶液混合配制成PEIMH/DNA复合物，复合质量比为30/1，静置30分钟后，将复合 物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采 取不同的控温路线进行转染后的培养(1) 37'C48小时，(2) 37°C (21小时)—20°C (3 小时)—37°C (24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路 线(1)来说为1.8xl07 RLU/mg protein; 控温路线(2)为1.35x107 RLU/mg protein。 对比例三
将单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(2.214ml， 12rnmo1，理论聚合度 100)和催化剂Cu(I)Cl(11.9mg, 0.12mmol)加入Schlenk管中，用2mL乙醇溶解。用液氮 冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂2-溴异丁酸乙酯(EBiB)(18.4pl， 0.12mmol)和配体2，2'-联吡啶(bpy)(37.5mg， 0.24mmol)溶解于 lml乙醇中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次 后，真空密封，在6(TC水浴中搅拌反应4小时。在第一步反应结束后，向反应体系中通 氮气，用注射器加入1 ml甲基丙烯酸-P-羟乙酯(HEMA)(468^U， 3.6 mmol,理论聚合度为 IO)的乙醇溶液。经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在6(TC水浴中搅拌反应4小时。 反应完成后用液氮冷冻终止反应。用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量 3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
取上一步反应产物(lg)和羰基二咪唑(9.74g， 60mmo1)加入到三口烧瓶中，再加 入二甲基亚砜(40ml)，密闭后通N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反 应12小时。反应结束后，反应液滴加到1000ml无水乙醚中，静置后得油状沉淀。用二甲 基亚砜(10ml)将沉淀溶解，将聚乙烯亚胺(PEI) (9.6g， 8mmol)用二甲基亚砜(45ml) 溶解后加入到三口瓶中，室温搅拌下，在l小时内逐滴滴加用二甲基亚砜(10ml)溶解的 沉淀，再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
测定最终产物水溶液的LCST为4rC,未用于基因转染研究。 对比例四
将分子量为1200Da的PEI 2mg溶于lml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒DNA溶液 混合配制成PEI/DNA复合物，复合质量比为30/1,静置30分钟后，将复合物溶液加入到 巳培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采取不同的控温 路线进行转染后的培养(1) 37°C 48小时，(2) 37°C (21小时)一20。C (3小时)—37°C (24小时)。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为对于控温路线(1)来说 为3.3xl05RLU/mg protein; 控温路线(2)为3.1 x105 RLU/mg protein。
权利要求
1、一种温度敏感聚乙烯亚胺-接枝-聚丙烯酸寡乙二醇酯嵌段共聚物，其特征在于它的结构为其中，m为50～200，n为10～100，x为25～50，分子量分布指数为1.1～1.3，为AB型二嵌段共聚物。
2、 按照权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧 基乙氧基)乙酯与甲基丙烯酸-(3-羟乙酯两单体的共聚比为1-10:1。
3、 一种温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物的制备方法，其特征在于它 是经过以下步骤用顺序加料的原子转移自由基聚合方式，合成聚(2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧 基)乙酯-b-甲基丙烯酸-p-羟乙酯)(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物；再以羰基二咪唑为反 应中间体，先利用羰基二咪唑活化HEMA链段末端的OH，然后再与聚乙烯亚胺(PEI) 反应，制备PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物；具体为-1 )在Schlenk管中加入单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(Me02MA)和催 化剂氯化亚铜，用乙醇溶解，用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除 去反应体系中的氧气；2) 在氮气保护下用注射器将引发剂2-溴异丁酸乙酯(EBiB)和配体2,2'-联吡啶(bpy)的 乙醇溶液加入上述Schlenk管中，反应混合物经过反复冻融三次后，真空密封，在40-80。C 水浴中搅拌反应2-8小时；3) 液氮终止反应，向反应体系中通氮气，用注射器加入甲基丙烯酸-P-羟乙酯(HEMA) 的乙醇溶液，经过三次冻融循环，真空密闭反应器，在40-8(TC水浴中搅拌反应4-12小时；4) 用液氮冷冻终止反应，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量3500) 在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干；5) 将步骤4)产物和羰基二咪唑加入到三口烧瓶中，再加入二甲基亚砜，密闭后通 N2气，搅拌使其充分溶解，在N2保护条件下，室温反应12小时；反应液滴用无水乙醚洗 涤三次，静置后得油状沉淀；6) 室温搅拌下，将溶解的油状沉淀加入到聚乙烯亚胺(PEI)的二甲基亚砜溶液中， 再反应4个小时后，用去离子水稀释反应产物后，再用透析袋(截留分子量8000)在去离子 水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。
4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤6)是在1-3小时内逐滴滴 加二甲基亚砜溶解的油状沉淀。
5、 权利要求3所述的温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物的应用，其 特征在于用于转基因载体，实现对于DNA运输和表达的调控。
全文摘要
本发明公开了一种温度敏感PEI-g-(MeO2MA-b-HEMA)嵌段共聚物及制备方法和应用，属于温度敏感性转基因载体的制备。该方法过程包括用顺序加料的原子转移自由基聚合技术，合成聚(2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯-b-甲基丙烯酸-β-羟乙酯)(MeO2MA-b-HEMA)嵌段共聚物。再以羰基二咪唑为反应中间体，先利用羰基二咪唑活化HEMA链段末端的羟基，然后与聚乙烯亚胺(PEI)偶联反应，制备了PEI-g-(MeO2MA-b-HEMA)嵌段共聚物。本发明的优点在于制备方法简单，合成条件温和，所制得的产物用于转基因载体，可实现对于DNA运输和表达的调控。
文档编号C08G81/02GK101585921SQ200910069310
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月18日 优先权日2009年6月18日
发明者刘文广, 鹏 张, 杨建海 申请人:天津大学