专利名称：一种可提高酶热稳定性的高分子复合胶束及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及高分子材料领域，特别是一种可提高酶热稳定性的高分子复合胶束及其制备和应用。
背景技术：
酶，作为一种生物催化剂，广泛用于生产、生活中。但是，在使用的过程中，酶经常会受到高温、强酸碱、紫外照射等恶劣条件的影响而改变结构，失去活性。这种容易失活的缺陷大大限制了酶的使用效果，因此，如何在运输、贮存和应用的过程中提高酶的稳定性， 从而扩大酶的应用范围，已经引起了科研工作者的广泛关注。目前，提高酶的稳定性的方法主要有1)蛋白质工程，包括定向进化、肽链延展、 专一位点诱变和抗体工程等技术；2)化学改性，包括交联酶晶体、表面改性和固定化处理等技术；3)添加稳定剂，参见C. 0' Fagain, EnzymeMicrob. Tech. 2003, 33，137-149、 L. Gianfreda, Μ. R. Scarfi, Mol. Cell Biochem. 1991, 100，97-128。在这些方法中， 添加稳定剂的方法简单，成本低且易于操作，多元醇、聚合物等对酶的稳定性都有一定的效果。但是目前存在的问题是各种添加剂对酶的稳定效果都是有限的，而且对添加剂的选择局限于酶自身的结构特点，适用范围很窄，因此当前对酶的稳定性研究距离工业化生产仍存在一段距离。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种可提高酶热稳定性的高分子复合胶束及其制备和应用，该复合胶束在高温条件下可提高酶的稳定性，而且添加了该复合胶束的酶在高温条件下仍能保持较高的活性。本发明的技术方案
一种可提高酶热稳定性的高分子复合胶束，由粒径为40-200nm且均勻分布的颗粒构成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物组成，两种双亲性嵌段共聚物中包括一种亲水端带有温敏性的双亲性嵌段共聚物和一种为亲水端不带温敏性的双亲性嵌段共聚物，该复合胶束在室温下为核-壳结构，核层和壳层分别由两种双亲性嵌段共聚物的疏水端和亲水端混合组成。所述两种双亲性嵌段共聚物的疏水端为2_30kDa (千道尔顿)，且两种疏水端的分子量相差不超过5kDa。所述亲水端带有温敏性的双亲性嵌段共聚物为聚乳酸-b-聚异丙基丙烯酰胺 (PLA-b-PNIPAM)。所述亲水端不带温敏性的双亲性嵌段共聚物为聚乙二醇-b_聚乳酸 (PEG-b-PLA)。一种所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束的制备方法，包括如下步骤
1)采用可逆加成裂解链转移自由基聚合(RAFT)和开环聚合(ROP)的方法合成分子量分布窄的嵌段共聚物PLA-b-PNIPAM ；
2)采用ROP的方法合成生物可降解的嵌段共聚物PEG-b-PLA；
3)室温下分别将两种嵌段共聚物溶解在有机溶剂中制得共聚物溶液，两种共聚物溶液的浓度相同，均为1-5 mg/mL ；
4)按照体积比为1:0.3-9均勻混合两种共聚物溶液；
5)将混合溶液对水进行透析，通过加水定容后，最后制得嵌段共聚物的浓度为 0. 1-lmg/m的高分子复合胶束溶液。所述有机溶剂为N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)或丙酮。一种所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束的应用，用于提高酶的热稳定性， 包括如下步骤
1)将酶加入缓冲溶液中制得酶溶液，酶与缓冲溶液的用量比为0.01-0. lmg/mL，所述缓冲溶液为50mM、pH=7. 5的三羟甲基氨基甲烷盐-硫酸(Tris-H2SO4)溶液；
2)将制备的高分子复合胶束溶液与酶溶液混合均勻，高分子复合胶束溶液与酶溶液的体积比为1:1 ；
3)将上述混合液升温至50°C，加热1个小时，即可获得呈核-壳-冠结构的高分子复合胶束。所述酶为碳酸脱水酶、溶菌酶、辣根过氧化物酶、脂肪酶或蛋白酶。该高分子复合胶束提高酶热稳定性的检测方法
1)将呈核-壳-冠结构的高分子复合胶束继续升温至70°c，加热10分钟，使酶的结构改变，部分疏水基团暴露在表面，与复合胶束的疏水壳层相结合，以阻止酶分子间的聚集沉淀；
2)在4°C条件下冷藏一周后，聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)由疏水转变为亲水，进而辅助酶分子复性；
3)室温下测试酶的活性。
该复合胶束对酶保护的原理
酶，作为一种具有催化功能的生物大分子，其三维结构决定了他们的活性和催化机理。 一些极端条件，包括高温、强酸碱等，即通过改变酶的空间结构使其失活变性。在热失活的过程中，酶结构的改变使一些本来处于内部的疏水基团暴露在表面，致使酶分子之间由于疏水相互作用而聚集沉淀失去活性。本发明采用核-壳-冠结构的复合胶束，在高于温敏性双亲性嵌段共聚物的最低临界溶解温度时，处于壳层的温敏性亲水部分发生相转移，疏水塌缩形成新的壳层，而不带温敏性的亲水部分则作为冠层，阻止了复合胶束之间的聚集， 使这种带有疏水表面的核-壳-冠纳米结构能够稳定存在；将混合体系置于4°C冰箱冷藏的过程中，复合胶束的疏水表面发生相转移转变为亲水相，从而辅助酶分子复性。两种疏水端的分子量相差不超过5kDa是为了使两种双亲性嵌段共聚物能够形成复合胶束，而非各自单独形成的简单胶束。本发明的优点是
由两种双亲性嵌段共聚物形成的核-壳-冠结构的复合胶束，具有稳定的疏水表面、高比表面积且疏水面面积可以通过调节两种嵌段共聚物的比例灵活控制；通过加入该复合胶束，在高温条件下可显著提高酶的热稳定性；其制备方法工艺简单、易于操作，制备成本低， 易于推广应用。
图1为在不同PLA-b-PEG和PLA_b_PNIPAM比例的复合胶束存在下CAB的相对活性。图2为实例2、3和4中各种酶的相对活性。
具体实施例方式以下通过非限定性实例进一步详细说明本发明。实施例1
采用RAFT和ROP的方法合成了嵌段共聚物PLA1(1(1-b-PEG45和PLA125-b_PNIPAM18(1，室温下将两种嵌段共聚物溶解在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，共聚物溶液浓度均为5mg/mL，按照 PLA-b-PEG溶液与PLA-b-PNIPAM溶液体积比3 1，1 1，1 4，1 6，1 9均勻混合两种共聚物溶液，对水透析制备复合胶束，最后加水定容共聚物的浓度至0.4 mg/mL。配置0. 034 mg/mL 碳酸脱水酶(CAB) Tris-H2SO4 (50mM,pH=7. 5)缓冲溶液。按体积比1:1混合共聚物胶束溶液和CAB溶液，混合溶液在50°C水浴中加热1小时，然后再在70°C水浴中加热10分钟，置于4°C冰箱中保存一周，室温下测试CAB活性。碳酸脱水酶的活性测试以4-硝基苯基乙酸酯(pNPA)为底物。配置130mM pNPA乙腈溶液，向0. OlmL pNPA溶液中加入0. 5mL CAB溶液，快速混合，室温检测反应液在400nm处的吸光值变化，3min内的升高速率(扣除空白实验中底物水解速率后)，与酶活性成正比， 求出变化斜率，与100%酶活性相比得到相对酶活性。测试结果如图1所示，测试结果表明具有核-壳-冠结构的复合胶束可以提高碳酸脱水酶的热稳定性，其中3:1体系可以恢复16%的活性，1:1体系可以恢复22%的活性， 1:4体系可以恢复45%的活性，1:6体系可以恢复93%的活性，1:9体系可以恢复70%的活性； 通过调节组成复合胶束的两种双亲性嵌段共聚物的比例，可以找到保护效果最佳的一组复合胶束，在本实施例中，1 6体系的复合胶束对CAB的热稳定效果最佳，可以恢复93%的活性。实施例2
采用RAFT和ROP的方法合成了嵌段共聚物PLA1(1(1-b-PEG45和PLA125-b_PNIPAM18(1，室温下将两种嵌段共聚物溶解在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，共聚物溶液浓度均为5mg/mL，按照PLA-b-PEG溶液与PLA-b-PNIPAM溶液体积比1 6均勻混合两种共聚物溶液，对水透析制备复合胶束，最后加水定容共聚物的浓度至0.4 mg/mL。配置0. 05 mg/mL脂肪酶(lipase) Tris-H2SO4 (50mM,pH=7. 5)缓冲溶液。按体积比1 1混合胶束溶液和lipase溶液，混合溶液在50°C水浴中加热1小时，再在70°C水浴中加热10分钟，置于4°C冰箱中保存一周，室温下测试脂肪酶的活性。活性测试方法同实施例1。测试结果如图2所示，测试结果表明具有核-壳-冠结构的复合胶束可以提高脂肪酶的热稳定性，未添加复合胶束的脂肪酶加热后的活性恢复仅为阳％，添加复合胶束的脂肪酶加热后的活性恢复可以达到83. 9%。
实施例3
采用RAFT和ROP的方法合成了嵌段共聚物PLA1(1(1-b-PEG45和PLA125-b_PNIPAM18(1，室温下将两种嵌段共聚物溶解在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，共聚物溶液浓度均为5mg/mL，按照PLA-b-PEG溶液与PLA-b-PNIPAM溶液体积比1 6均勻混合两种共聚物溶液，对水透析制备复合胶束，最后加水定容共聚物的浓度至0.4 mg/mL。配置0. 02 mg/mL辣根过氧化物酶(HRP) Tris-H2SO4 (50mM, pH=7. 5)缓冲溶液。按体积比1:1混合胶束溶液和HRP溶液， 混合溶液在50°C水浴中加热1小时，再在70°C水浴中加热10分钟，置于4°C冰箱中保存一周，室温下测试辣根过氧化物酶的活性。辣根过氧化物酶的活性测试通过催化双氧水氧化 4-氨基安替比林(4-AAP)反应。分别取ImL 3. OXlO"2 mol/L苯酚溶液，ImL 6. OXlO"4 mol/ L双氧水溶液，ImL 7. 2 X IO"3 mol/L 4-AAP溶液，三者均溶解在Tris-H2SOjl冲溶液(50mM， pH=7. 5)中，混合均勻。再加入0. ImL HRP溶液，快速混合，室温测定反应液在510nm处的吸光值变化，3 min内的升高速率(扣除空白实验中底物水解速率后)，求出变化斜率，与100% 酶活性相比得到相对酶活性。测试结果如图2所示，测试结果表明具有核-壳-冠结构的复合胶束可以提高辣根过氧化物酶的热稳定性，未添加复合胶束的辣根过氧化物酶加热后的活性恢复仅为39%， 添加复合胶束的辣根过氧化物酶加热后的活性恢复可以达到62%。实施例4
采用RAFT和ROP的方法合成了嵌段共聚物PLA1(1(1-b-PEG45和PLA125-b_PNIPAM18(1，室温下将两种嵌段共聚物溶解在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，共聚物溶液浓度均为5mg/mL，按照PLA-b-PEG溶液与PLA-b-PNIPAM溶液体积比1 6均勻混合两种共聚物溶液，对水透析制备复合胶束，最后加水定容共聚物的浓度至0.4 mg/mL。配置0. 034 mg/mL CAB Tris-H2SO4 (50mM,pH=7. 5)缓冲溶液。按体积比1 1混合胶束溶液和碳酸脱水酶溶液，混合溶液在40°C 水浴中加热1周，置于4°C冰箱中保存一周，室温下测试CAB活性。活性测试方法同实例1。测试结果如图2所示，测试结果表明具有核-壳-冠结构的复合胶束可以提高低温长时间加热的碳酸脱水酶的热稳定性，未添加复合胶束的碳酸脱水酶加热后的活性恢复仅为12. 8%，添加复合胶束的碳酸脱水酶加热后的活性恢复可以达到57. 4%。
权利要求
1.一种可提高酶热稳定性的高分子复合胶束，其特征在于由粒径为40-200nm且均勻分布的颗粒构成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物组成，两种双亲性嵌段共聚物中包括一种亲水端带有温敏性的双亲性嵌段共聚物和一种为亲水端不带温敏性的双亲性嵌段共聚物，该复合胶束在室温下为核-壳结构，核层和壳层分别由两种双亲性嵌段共聚物的疏水端和亲水端混合组成。
2.根据权利要求1所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束，其特征在于所述两种双亲性嵌段共聚物的疏水端为2-30kDa (千道尔顿)，且两种疏水端的分子量相差不超过 5kDa0
3.根据权利要求1所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束，其特征在于所述亲水端带有温敏性的双亲性嵌段共聚物为聚乳酸_b-聚异丙基丙烯酰胺(PLA-b-POTPAM)。
4.根据权利要求1所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束，其特征在于所述亲水端不带温敏性的双亲性嵌段共聚物为聚乙二醇_b-聚乳酸(PEG-b-PLA)。
5.一种如权利要求1所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)采用可逆加成裂解链转移自由基聚合(RAFT)和开环聚合(ROP)的方法合成分子量分布窄的嵌段共聚物PLA-b-PNIPAM ；2)采用ROP的方法合成生物可降解的嵌段共聚物PEG-b-PLA；3)室温下分别将两种嵌段共聚物溶解在有机溶剂中制得共聚物溶液，两种共聚物溶液的浓度相同，均为1-5 mg/mL ；4)按照体积比为1:0.3-9均勻混合两种共聚物溶液；5)将混合溶液对水进行透析，通过加水定容后，最后制得嵌段共聚物的浓度为 0. 1-lmg/m的高分子复合胶束溶液。
6.根据权利要求5所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)或丙酮。
7.—种如权利要求1所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束的应用，其特征在于 用于提高酶的热稳定性，包括如下步骤1)将酶加入缓冲溶液中制得酶溶液，酶与缓冲溶液的用量比为0.01-0. lmg/mL，所述缓冲溶液为50mM、pH=7. 5的三羟甲基氨基甲烷盐-硫酸(Tris-H2SO4)溶液；2)将制备的高分子复合胶束溶液与酶溶液混合均勻，高分子复合胶束溶液与酶溶液的体积比为1:1 ；3)将上述混合液升温至50°C，加热1个小时，即可获得呈核-壳-冠结构的高分子复合胶束。
8.根据权利要求7所述可提高酶热稳定性的高分子复合胶束的应用，其特征在于所述酶为碳酸脱水酶、溶菌酶、辣根过氧化物酶、脂肪酶或蛋白酶。
全文摘要
一种可提高酶热稳定性的高分子复合胶束，由粒径为40-200nm且均匀分布的颗粒构成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物组成，两种双亲性嵌段共聚物中包括一种亲水端带有温敏性的双亲性嵌段共聚物和一种为亲水端不带温敏性的双亲性嵌段共聚物，该复合胶束在室温下为核-壳结构，核层和壳层分别由两种双亲性嵌段共聚物的疏水端和亲水端混合组成。本发明的优点是由两种双亲性嵌段共聚物形成的核-壳-冠结构的复合胶束，具有稳定的疏水表面、高比表面积且疏水面面积可以通过调节两种嵌段共聚物的比例灵活控制；通过加入该复合胶束，在高温条件下可显著提高酶溶液的热稳定性；其制备方法工艺简单、易于操作，制备成本低，易于推广应用。
文档编号C08L53/00GK102336999SQ201110186298
公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者刘学, 刘阳, 史林启, 安英丽, 陶倩, 马如江, 黄帆 申请人:南开大学