专利名称：b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及荚膜多糖纯化技术领域，特别是ー种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化ェ艺。
背景技术：
流感嗜血杆菌迄今仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌(Hib)引起，是导致2岁以下婴幼儿脑膜炎和细菌性肺炎的主要病因。全世界估计毎年至少造成300万例严重疾病和40万 70万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。在エ业化国家和发展中国家，疫苗接种都是唯一能迅速降低Hib疾病发病的公 共卫生措施。将Hib疫苗纳入儿童常规免疫规划的国家多数在数年内就实际上消除了 Hib严重病例。由于细菌对ー些最有效的抗生素耐药性正在不断増加，通过疫苗预防Hib疾病就变得比以往更为重要。在Hib疫苗制备的过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。在我国多采用和流行性脑膜炎球菌以及伤寒Vi多糖提取相似的エ艺来提取Hib荚膜多糖。此エ艺采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与酸性多糖形成季胺络合物从而沉淀多糖。但是CTAB对核酸、蛋白质也有不同程度的沉淀作用，因此要获得纯度较高的荚膜多糖，必须进一歩去除一起沉淀的核酸和蛋白质。常规的去除蛋白质的方法是将Hib粗制多糖溶解于饱和中性醋酸钠溶液中，然后用冷酚溶液抽提，根据粗制多糖中含有的蛋白的情況，此步骤通常需要重复数次。该エ艺的缺点是会使用大量的苯酚，苯酚是ー种强腐蚀性的高毒性物质，对人的皮肤和粘膜有強烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。人吸入高浓度苯酚气体可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。皮肤接触可致灼伤。可经灼伤皮肤吸收，经一定潜伏期后引起急性肾功能衰竭。同时，该エ艺会产生大量的废弃苯酚，对水体和大气可造成污染，对环境有严重危害。随着对环保意识的增強，以及对工人工作环境状况的重视，人们一直在寻找合适的方法来避免在疫苗制造过程中使用象苯酚这样有毒的化学试剂。使用现代的技术对传统的生产エ艺进行改进以减少或弃用有毒化学试剂对于保护人类健康以及减少环境污染都具有重要的意义。Hib粗多糖的制备參照文献公开的方法(Anderson等，1977. INFECTION ANDIMMUNITY. 15(2) :472 477)。培养基采用CY培养基，I升培养基含IOg酸水解酪蛋白，5g酵母提取物，5g葡萄糖，Img氯化血红素，Img辅酶1,0. IM磷酸盐缓冲液,培养基的pH值为7. 6。培养温度为37 °C，振荡速度为220rpm，待菌种浓度OD66tl为O. 5后接种至发酵罐继续培养，维持培养温度37°C，搅拌速度150rpm，培养8 IOh后加入浓度为O. 5% (v/v)的甲醛杀菌，收获时菌液浓度OD66tl > 4. O0杀菌后的培养液采用IOOOOrpm离心30min沉淀菌体，收集上清液。将CTAB加入上清液中，CTAB与上清液的重量体积比(w/v)为I : 1000，室温搅拌lh，得到的混合液IOOOOrpm离心30min后收集CTAB与Hib荚膜多糖的复合物沉淀。沉淀用O. 5 IM氯化钠溶液溶解，室温搅拌2小吋，使Hib荚膜多糖与CTAB解离。加入4°C预冷的无水こ醇至こ醇终浓度为25% (v/v)，4°C搅拌过夜。IOOOOrpm离心30min，收集上清液，上清液中继续加入无水こ醇至こ醇终浓度为75% (v/v)，4°C搅拌过夜，IOOOOrpm离心30min，收集沉淀。沉淀用无水こ醇和丙酮各洗涤两次，最終得到的沉淀即为Hib荚膜多糖粗多糖。国外的Pato 等人(Pato 等，2006. Purification of capsular polysaccharideirom Neisseria menmgitides serogroup C Dy 丄lquia chromatography. Jouranl oiChromatography B. 832 :262)通过层析法对C群流脑荚膜多糖进行了了纯化探索。根据b型流感嗜血杆菌荚膜多糖可以用阳离子型去污剂十六烷基三甲基溴化铵沉淀这ー现象推断该类多糖是带有负电荷的酸性多糖，按照离子交换层析的理论可以选用阴离子交换层析进行纯化。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供ー种安全有效、减轻对人体和环境危害的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺。本发明的目的通过以下技术方案来实现b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，它包括以下步骤a、用缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积直至电导基线平稳并且与上柱之前的缓冲液的电导值一致；b、用20mM Tirs, 1% (w/v)脱氧胆酸钠，pH8. O溶液溶解粗多糖，使得溶解后的溶液中多糖浓度为5 10mg/ml，用0. 45 μ m的滤膜澄清过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱；C、采用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱，监测吸收波长为206nm和280nm的吸收曲线，收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰；d、将收集的洗脱峰上样于预先用生理盐水平衡好的S^hadex G_25凝胶柱，监测吸收波长为206nm的吸收曲线，收集206nm的吸收峰，即得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化样品。所述的缓冲液A为20mM Tirs，pH8. O溶液；所述的缓冲液B为20mM Tris, IM NaCl，pH8. O溶液。本发明具有以下优点I、本发明制备的Hib多糖的质量指标可达到行业标准。2、本发明的纯化过程不使用苯酚，避免了对人体健康和环境造成的危害。3、本发明通过凝胶过滤层析改变离子交換洗脱液的缓冲体系，使所获得的洗脱液可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，減少了处理步骤中可能造成的污染与损失。4、本发明操作简单、方便，有利于规模化生产。 本发明制备的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的质量指标如下表
权利要求
1.b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，其特征在于它包括以下步骤 a、用缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积直至电导基线平稳并且与上柱之前的缓冲液的电导值一致； b、用20mMTirs, 1% (w/v)脱氧胆酸钠，pH8. O溶液溶解粗多糖，使得溶解后的溶液中多糖浓度为5 10mg/ml，用O. 45 μ m的滤膜澄清过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱； C、采用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱，监测吸收波长为206nm和280nm的吸收曲线，收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰； d、将收集的洗脱峰上样于预先用生理盐水平衡好的S^hadex G_25凝胶柱，监测吸收波长为206nm的吸收曲线，收集206nm的吸收峰，即得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化样品O
2.根据权利要求I所述的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，其特征在于所述的缓冲液A为20mM Tirs, pH8. O溶液；所述的缓冲液B为20mM Tris, IM NaCl，pH8. O溶液。
全文摘要
本发明公开了b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺，它包括以下步骤a、用缓冲液A平衡离子交换层析柱2个柱体积；b、用20mMTirs，1%(w/v)脱氧胆酸钠，pH8.0溶液溶解粗多糖，过滤后，将滤液上样于已经平衡好的离子交换层析柱；c、用缓冲液A和缓冲液B的线性梯度洗脱，收集206nm吸收值较高，280nm吸收值较低的洗脱峰；d、将收集的洗脱峰上样于平衡好的SephadexG-25凝胶柱，收集206nm的吸收峰。本发明的有益效果是质量指标可达到行业标准，纯化过程不使用苯酚，避免了对人体健康和环境造成的危害，减少了处理步骤中可能造成的污染与损失，操作简单、方便，有利于规模化生产。
文档编号C08B37/00GK102633897SQ20121012129
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者伍长华, 关晓峰, 吴强, 樊紹文 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司