专利名称：一种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种转基因载体及其制备方法，更具体地说，涉及ー种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体及其制备方法。
背景技术：
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。病毒载体在基因治疗中取得了ー些突破性进展，但是在临床应用过程中，其免疫原性和潜在致癌性等仍然是其难以克服的重大隐患。非病毒载体作为基因递送的另一条途径，被人们广泛研究，其主要包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。阳离子高聚物作为非病毒载体的ー种，它既具有非病毒载体的优点(即低毒性，低免疫原性和低致癌性)，还有自身的优势——易于制备和携帯目的基因能力高，这些更加有利于其作为转基因载体的应用。常见的阳离子高聚物能够通过强静电作用有效缩合DNA，形成的聚电解质复合物(PECs)较为稳定。这些PECs易于细胞内化，从内涵体中逃逸，并能保护DNA免受DNA酶的降解。因此，阳离子高聚物已成为非病毒基因载体的重要组成部分，但是阳离子高聚物作为基因载体应用吋，仍呈现出了一些问题，例如生物相容性差、有毒性、形成的复合物从内涵体逃离的能力弱以及转染效率低等。载体/DNA复合物从内涵体逃离的能力是影响载体转染效率的ー个重要因素。具有较强“质子缓冲作用”的载体如聚こ烯亚胺进入内涵体后，会进ー步质子化，使得大量的抗衡阴离子进入，滲透压增大使内涵体破裂而利于复合物的逃离。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供ー种生物相容性好、毒性小、具有质子缓冲作用的阳离子高聚物作为非病毒型转基因载体进行使用。本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备上述阳离子高聚物的方法。
本发明的目的还在于提供ー种上述阳离子高聚物的应用。本发明的上述目的通过下述技术方案予以实现。本发明使用改性聚甲基丙烯酸缩水甘油酯作为阳离子高聚物，当作转基因载体进行使用。本发明的阳离子高聚物基因载体，以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯为主链，取代基为
胍基丁胺与组胺，其分子式如下
权利要求
1.一种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体，其特征在于，以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯为主链，取代基为胍基丁胺与组胺，其分子式结构如下 ——\p—f--NHI\(|f \l.'.'O I==ORj = ΗΜ,'ζ天 N, O O鳴')HOn^/\II JR2 =圓，xV*,'..'N.'.r—Rl %HN 其中两种重度单元的聚合度m和η由投料时两种单体的摩尔决定。
2.根据权利要求I所述的一种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体，其特征在于，两种重度单元的聚合度m η为(1-3) (3-1)。
3.根据权利要求I所述的一种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体，其特征在于，两种重度单元的聚合度m : η为I : 3、2 : 2或者3 I。
4.一种制备如权利要求I所述的线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，按照下述步骤进行将胍基丁胺、组胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯在碱性的条件下进行非均相反应，使得甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基打开进而与胍基丁胺和组胺的末端氨基反应，反应完全后，用乙醚萃取除去未反应的甲基丙烯酸缩水甘油酯；最后在酸性、无氧惰性气体保护的条件下，以过硫酸铵为引发剂，引发经胍基丁胺和组胺改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯单体进行自由基无规聚合，最终经透析冻干即得组胺修饰的线性胍基丁胺转基因载体。
5.根据权利要求4所述的制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，所述无氧惰性气体为氮气、氩气或者氦气。
6.根据权利要求4所述的制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，将胍基丁胺、组胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯混合非均相反应时，一般在PH = 9-10、温度为35°C的条件下反应至少24小时，优选24-48小时，可通过进一步延长反应时间来提高反应效果；胍基丁胺与组胺的总用量应大于甲基丙烯酸缩水甘油酯，以保证甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基尽量全部参与反应。
7.根据权利要求4所述的制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，无规聚合反应应在pH = 4-5、温度为65°C的无氧氮气保护条件下反应至少24小时，优选24-48小时，可通过进一步延长反应时间来提高反应效果。
8.根据权利要求4所述的制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，聚合反应结束后，将产物通过透析方法进行提纯，使用透析袋的截留分子量3500，在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干即得组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体。
9.如权利要求I所述的线性聚合物转基因载体在基因转染领域的应用，用于非病毒转基因载体，实现对DNA的安全高效运输。
全文摘要
本发明公开了一种组胺改性的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体及其制备方法和应用，其中采用甲基丙烯酸缩水甘油酯环氧基开环与胍基丁胺和组胺的末端氨基反应，将胍基丁胺与组胺通过化学键链接到甲基丙烯酸缩水甘油酯上，最后引发改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯单体进行自由基无规聚合，最终使带正电的胍基丁胺与具有质子缓冲作用的组胺键接到高分子链上。该胍基丁胺载体具有良好的生物相容性和促进复合物跨膜的能力。组胺改性又在不影响载体细胞毒性的前提下增加了复合物的内涵体逃逸能力，有效改善了胍基丁胺作为转基因载体的效率和性能，可作为高效非病毒基因载体用于基因治疗，实现提高胍基丁胺载体基因转染效率，延长体内循环时间的作用。
文档编号C08F220/36GK102633934SQ20121012106
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者刘文广, 李咏懋, 杨建海, 王玮 申请人:天津大学