本发明涉及一种核酸检测试剂盒和检测核酸的方法，属于生物检测领域。
背景技术：
核酸检测主要有两种途径：（1）模板扩增技术，它通过扩增靶序列来提高敏感性，（2）信号放大系统，它通过放大信号强度来提高敏感性，它反应迅速，简便易行，没有模板扩增的干扰因素。近年来迅速发展的核酸信号放大检测方法有效的提高了核酸检测的灵敏度和特异性。常用的信号放大系统有分支DNA探针，3DNA树状体等。在bDNA方法中，其信号放大是通过碱性磷酸酶（AP）标记的寡核苷酸杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。一个人工合成的分支DNA可结合多个酶标记探针，从而将捕获的靶标信号放大，以便进行检测。碱性磷酸酶（AP）标记的信号放大探针是bDNA系统的核心，其制备过程比较复杂，步骤包括枝链和主链寡脱氧核苷酸的化学合成，支、主链的连接，及连接后产物的纯化。因此，支链分子的制备是非常困难的，且成本较高。此外，碱性磷酸酶（AP）标记的寡核苷酸共轭分子的分子量大，在杂交中流动性低，致使检测效率不高。当放大倍数低时，其敏感性也较差，检测范围窄，不适用于低浓度样本的检测。3DNA树状体是由多个交错的自然或合成的3DNA单体结构单位组成的复杂的分枝状分子构型。每个3DNA单体由两条中央部分互补的DNA链组成，退火时两条链会形成一个中间双链两头单链的结构。3DNA单体之间的单链通过碱基互补组成了3DNA树状体构型。3DNA树状体的单链是荧光标记分子的结合位点。虽然3DNA树状体可以标记很多个荧光分子，但是由于荧光标记的分子不具有AP酶分支DNA扩增技术中的二级酶扩增能力，该方法的灵敏度不够理想。生物素是一种广泛分布于天然食物中的B族维生素，与亲和素具有很强的结合作用，一般情况下该作用是不可逆的。传统生物素标记探针将生物素连接在核酸上，利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用酶、荧光素或高电子密度（铁蛋白，胶体金等）的标志物标记的亲和素或链霉亲和素进行检测。最后，酶-底物颜色反应检测。传统生物素标记探针稳定，不易失活，并能配用多种检测系统，简单方便，在核酸检测领域运用广泛。但是其放大倍数不够，探针灵敏度不够高，在某些领域不能满足实际应用的需要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种灵敏度高的核酸检测试剂盒和使用该试剂盒检测核酸的方法。本发明采用的技术方案是，一种核酸检测试剂盒，包括捕获分子和捕获桥分子，所述捕获分子为寡核苷酸，包被于固相上；所述捕获桥分子为DNA，一端能与捕获分子部分杂交，另一端能与待测核酸靶分子部分杂交；还包括放大桥分子和放大分子，所述放大分子包括载体分子和标记分子，所述载体分子为DNA或RNA，所述标记分子为生物素标记的多核苷酸，一个载体分子通过多核苷酸与多个生物素分子相连；所述放大桥分子为DNA，一端能与待测核酸靶分子部分杂交，另一端能与载体分子部分杂交。所述的待测核酸为DNA或RNA。所述的载体分子通过多核苷酸与2-100个生物素分子相连。所述的载体分子可以通过化学合成或生物合成。所述的多核苷酸可由15-50个一种或多种核苷酸组成。所述的放大桥分子可以为多个不同DNA或RNA，使得在靶分子的不同区域连接多个放大桥分子，从而获得更大的放大效果。本发明上述的试剂盒，在实际使用中，还包括杂交液、杂交洗液、封闭液、标记物标记的链霉亲和素,等等。本发明的试剂盒中的放大桥分子、捕获桥分子和放大分子的设计和合成方法如下：1）生物素通过化学反应与多核苷酸连接形成标记分子。2）合成载体分子，载体分子的部分序列能够和放大桥分子的部分序列互补，另一部分序列与标记分子中多核苷酸的序列互补。3）多个标记分子在一定的条件下与载体分子进行杂交，形成多生物素标记的放大分子。4）放大分子的纯化。5）根据被检测核酸分子的序列，设计和合成捕获桥分子和放大桥分子，捕获桥分子和放大桥分子的部分序列能与靶分子的部分序列互补配对，两者与靶分子互补配对的区域不重叠。捕获桥分子的部分序列与捕获分子互补配对，放大桥分子的部分序列能与放大分子中不参与标记分子杂交的序列互补配对。由于靶分子是通过捕获桥分子与捕获分子的杂交而捕获到固相上，通过放大桥分子与放大分子的杂交来实现信号的放大，因此针对不同的待测对象，捕获分子和放大分子都是相同的，只需设计不同的捕获桥分子和放大桥分子，即可实现信号放大检测。使用本发明的试剂盒检测核酸的方法，包括如下步骤：（1）将待测核酸与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，50℃孵育12-16小时，待测核酸通过捕获桥分子与预包被在固相上的捕获分子的特异识别而捕获到固相上；（2）洗去未结合于固相上的核酸分子和放大桥分子、捕获桥分子，将放大分子加入到固相上，50℃孵育1小时；（3）将标记物标记的链霉亲和素或亲和素加入到固相上，室温孵育半个小时；（4）通过链霉亲和素或亲和素上的标记物的特征反应，实现核酸信号的二次放大和检测。根据链霉亲和素或亲和素上不同的标记物，使用不同的方法进行检测。以所述的标记物为辣根过氧化物酶为例，通过化学发光底物对辣根过氧化物酶进行显色反应。根据待检测样本的相对光单位测定值来对样本进行定性分析。在本发明中，核酸信号放大的原理为：待测靶分子与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，通过捕获桥分子分别与靶分子和捕获分子的部分杂交，将靶分子捕获到固相上，而放大桥分子的一端与靶分子杂交识别，另一端与下一步加入的放大分子结合，放大分子上连接的多个生物素分子再与标记物如辣根过氧化物酶结合，最终实现核酸信号的两级放大过程。本发明将生物素与多核苷酸相连，而不是碱性磷酸酶。由于生物素体积小，生物素与多核苷酸连接形成的标记分子可以有效地杂交到载体分子上形成多生物素标记的放大分子，这使得检测更加灵敏。并且，用于生物素检测的亲和素或链霉亲和素可标记具有二次扩增能力的酶（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶），进行信号的二次放大，使得本发明的检测核酸方法具有极高的灵敏度。本发明的有益效果还在于本发明是通过信号放大而不是基于PCR的模板扩增技术来实现对核酸的检测，从而避免PCR固有的污染问题。此外，本发明的技术可以直接检测RNA分子，勿须进行反转录以及RNA的预分离，极大的简化了操作步骤。附图说明图1本发明试剂盒检测核酸的原理图，其中，1：待测核酸分子，2：捕获桥分子，3：放大桥分子，4：载体分子，5：标记分子6：标记物标记的链霉亲和素或亲和素，7：捕获分子，8：固相。具体实施方式实施例1，HPV检测1.捕获分子、捕获桥分子、放大桥分子、标记分子和载体分子的设计和合成：捕获分子：GTTGGGCTACGACTTAGAGGCC（SEQIDNo1）标记分子1：Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA（SEQIDNo2）标记分子2：Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG（SEQIDNo3）标记分子3：biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG（SEQIDNo4）载体分子：AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGCTTCACCGACCTATCCATCGGGTCTGCGAAAGGGCACGATGCTTACATGTGAGAACGCGAACGTGGT（SEQIDNo5）根据genebank中HPV的序列，设计捕获桥分子和放大桥分子的序列，序列如下：捕获桥分子：CAGGTAGCTTGTAGGGttttGGCCTCTAAGTCGTAGCCCAAC（SEQIDNo6）放大桥分子1：AATAAATCTTTAAATGttttAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC（SEQIDNo7）放大桥分子2：GTCTCTATACACCACAttttAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC（SEQIDNo8）2.预包被：将捕获分子包被到微孔板上，加入固定液，固定2小时后室温风干。3.样本处理将病人样本用细胞裂解液进行裂解，得到其中含有的核酸。4.样本核酸和放大桥分子、捕获桥分子温育：将样本核酸与放大桥分子、捕获桥分子共同稀释到100uL预热的杂交液中，加入到微孔板中。用铝箔膜封住反应孔，50℃温育12到16个小时。5.与放大分子温育：去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。按1:500的比例，用杂交液稀释放大分子，每孔加入稀释后的100μL放大分子，封膜。50℃温育1小时。6.与链霉亲和素-辣根酶温育：去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。每孔加入200μL封闭液，室温振荡15分钟。弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP酶联物，室温震荡30分钟。7.显色弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的检测洗涤液，室温振荡5分钟后，弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。配制底物溶液，每孔加入95μL底物溶液，孵育1分钟后，置于化学发光检测仪上进行测定。6.结果判断样本编号RLU值1259697290410733432阳性质控108073阴性质控2629临界质控5486当样本的RLU值大于临界值时，可判断该样本中HPV检测为阳性，小于临界值时，HPV检测为阴性。实施例2：晚期或转移性非小细胞肺癌化疗药敏检测大量临床研究证实，肿瘤细胞中与化疗药物作用或代谢相关的基因表达水平对化疗的疗效有重要的影响。肿瘤组织中ERCC1/RRM1/TYMS/TUBB3等靶标基因mRNA表达水平可以分别预测患者对铂类/吉西他滨/氟类/抗微管类等常用化疗药物的反应。有研究报道，高水平的ERCC1表达不利以铂类为基础的辅助化疗；ERCC1阴性者对含铂类化疗药的辅助化疗显示良好的获益率。ERCC1水平可作为铂类药物耐药的关键基因之一，相应关系已在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、结肠癌、晚期胃癌、头颈部鳞状细胞癌等中发现。1.试剂盒的组成：微孔反应板，放大桥分子，捕获桥分子，杂交液，杂交洗液（5×），放大分子，封闭液，链霉亲和素-HRP酶联物，检测洗液（5×），SuperSignalELISAPico化学发光底物（Thermo），底物稀释液，铝箔膜，临界质控物。2.捕获分子、捕获桥分子、放大桥分子、标记分子和载体分子的设计和合成：捕获分子：GTTGGGCTACGACTTAGAGGCC（SEQIDNo9）标记分子1：Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA（SEQIDNo10）标记分子2：Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG（SEQIDNo11）标记分子3：biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG（SEQIDNo12）载体分子：AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGCTTCACCGACCTATCCATCGGGTCTGCGAAAGGGCACGATGCTTACATGTGAGAACGCGAACGTGGT（SEQIDNo13）针对ERCC1和RRM1mRNA设计特异性的放大桥分子和捕获桥分子，序列如下：ERCC1：捕获桥分子：GAGGGCTCACAATGATttttGGCCTCTAAGTCGTAGCCCAAC（SEQIDNo14）放大桥分子1：CACAGGTGCTCTGGCCttttAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC（SEQIDNo15）放大桥分子2：ATTACGTCGCCAAATTttttAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC（SEQIDNo16）RRM1：捕获桥分子：TCTTTGCTGGTGTACTttttGGCCTCTAAGTCGTAGCCCAAC（SEQIDNo17）放大桥分子1：TGTGTGTTCTGATGTGttttAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC（SEQIDNo18）放大桥分子2：TTAGTGACTTCAGCCAttttAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC（SEQIDNo19）3.杂交液配制：20×SSC250mL，10%SDS10mL，用灭菌的纯化水定容至1000mL，混匀。放置室温保存。4.杂交洗液（5×）配制：20×SSC250mL，10%SDS50mL，用灭菌的纯化水定容至1000mL，混匀。放置室温保存。5.检测洗液（5×）10×PBS500mL，10%SDS50mL用灭菌的纯化水定容至1000mL，混匀。放置室温保存。6.封闭液10×PBS：100mL灭菌的纯化水：900mL牛血清白蛋白：5gKathon：500μL混匀后放置室温保存。7.检验准备工作（1）将杂交洗液（5X）和检测洗液（5X）用蒸馏水稀释至1X杂交洗液和1X检测洗液。（2）杂交液和1X杂交洗液使用前平衡至50℃。8.样本处理将病人样本（新鲜组织或石蜡切片）用细胞裂解液进行裂解，提取其中含有的RNA。9.预包被：将捕获分子包被到微孔板上，加入固定液，固定2小时后室温风干。10.杂交检测（1）病人样本核酸与放大桥分子和捕获桥分子混合，稀释到100μL预热的杂交液中，加入预包被的微孔板中。（2）将微孔杂交板上使用到的微孔进行封膜，并用力将铝箔膜压紧。（3）50℃孵育过夜。（4）去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的1X杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。（5）按1:500的比例，用杂交液稀释放大分子，每孔加入稀释后的100μL放大分子，封膜。（6）50℃孵育1小时。（7）重复步骤（4）。（8）每孔加入200μL封闭液，室温振荡15分钟。（9）弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP酶联物，室温震荡30分钟。（10）弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的检测洗涤液（1X），室温振荡5分钟后，弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。（11）配制化学发光底物溶液，SuperSignalELISAPico化学发光底物A、B、底物稀释液按比例1：1：8混匀。（12）每孔加入95μL底物溶液，孵育1分钟后，置于化学发光检测仪上进行相对光单位（RLU）测定。11.结果判断当RLU＜4000，检测基因的表达水平为低表达；当4000＜RLU＜10000，检测基因的表达水平为中等表达；当RLU＞20000，检测基因的表达水平为高表达。12.结果分析根据实验结果判断：1号病人组织切片中，ERCC低表达，RRM1低表达，建议接受卡铂和吉西他滨治疗；2号病人组织切片中，ERCC高表达，RRM1低表达，建议接受多西他赛和吉西他滨治疗；3号病人组织切片中，ERCC低表达，RRM1高表达，建议接受卡铂和多西他赛治疗；4号病人组织切片中，ERCC高表达，RRM1高表达，建议接受多西他赛和多西紫杉醇治疗；实施例3.MP检测1.捕获分子、捕获桥分子、放大桥分子、标记分子和载体分子的设计和合成：捕获分子：GTTGGGCTACGACTTAGAGGCC（SEQIDNo20）标记分子1：Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA（SEQIDNo21）标记分子2：Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG（SEQIDNo22）标记分子3：biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG（SEQIDNo23）载体分子：AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGCTTCACCGACCTATCCATCGGGTCTGCGAAAGGGCACGATGCTTACATGTGAGAACGCGAACGTGGT（SEQIDNo24）根据genebank中MP的16srRNA序列，设计捕获桥分子和放大桥分子的序列，序列如下：捕获桥分子：cgacacgagctgacgttttGGCCTCTAAGTCGTAGCCCAAC（SEQIDNo25）放大桥分子1：tgcgctcgttgcgggattttAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC（SEQIDNo26）放大桥分子2：catgatgatttgacgttttAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC（SEQIDNo27）同时合成单个标记分子标记的放大分子和多个标记分子标记的放大分子，比较单生物素与多生物素的信号放大效果。2.预包被：将捕获分子包被到微孔板上，加入固定液，固定2小时后室温风干。3.样本处理将样本用细胞裂解液进行裂解，得到其中含有的核酸。4.样本核酸和放大桥分子、捕获桥分子温育：将样本核酸与放大桥分子、捕获桥分子共同稀释到100uL预热的杂交液中，加入到微孔板中。用铝箔膜封住反应孔，50℃温育12到16个小时。5.与放大分子温育：去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。按1:500的比例，用杂交液稀释放大分子，每孔加入稀释后的100μL放大分子，封膜。50℃温育1小时。6.与链霉亲和素-辣根酶温育：去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。每孔加入200μL封闭液，室温振荡15分钟。弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP酶联物，室温震荡30分钟。7.显色弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的检测洗涤液，室温振荡5分钟后，弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。配制底物溶液，每孔加入95μL底物溶液，孵育1分钟后，置于化学发光检测仪上进行测定。6.结果样本单生物素标记的放大分子多生物素标记的放大分子MP菌种11650231790MP菌种2107831456MP菌种31232108073空白对照332433多生物素标记的放大分子检测到的信号是单生物素标记的放大分子检测信号的10-100倍。SEQUENCELISTING<110>武汉中织生物科技有限公司；深圳市宏信生物技术有限公司<120>一种核酸检测试剂盒和多生物素信号放大检测核酸的方法<130><160>27<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1gttgggctacgacttagaggcc22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2acccgatggataggtcggtgaa22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3taagcatcgtgccctttcgcag22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4accacgttcgcgttctcacatg22<210>5<211>88<212>DNA<213>人工序列<400>5agaaggcgtccgtctttgaggcttcaccgacctatccatcgggtctgcgaaagggcacga60tgcttacatgtgagaacgcgaacgtggt88<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>6caggtagcttgtagggttttggcctctaagtcgtagcccaac42<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>7aataaatctttaaatgttttagaaggcgtccgtctttgaggc42<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>8gtctctatacaccacattttagaaggcgtccgtctttgaggc42<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>9gttgggctacgacttagaggcc22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10acccgatggataggtcggtgaa22<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>11taagcatcgtgccctttcgcag22<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>12accacgttcgcgttctcacatg22<210>13<211>88<212>DNA<213>人工序列<400>13agaaggcgtccgtctttgaggcttcaccgacctatccatcgggtctgcgaaagggcacga60tgcttacatgtgagaacgcgaacgtggt88<210>14<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>14gagggctcacaatgatttttggcctctaagtcgtagcccaac42<210>15<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>15cacaggtgctctggccttttagaaggcgtccgtctttgaggc42<210>16<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>16attacgtcgccaaattttttagaaggcgtccgtctttgaggc42<210>17<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>17tctttgctggtgtactttttggcctctaagtcgtagcccaac42<210>18<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>18tgtgtgttctgatgtgttttagaaggcgtccgtctttgaggc42<210>19<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>19ttagtgacttcagccattttagaaggcgtccgtctttgaggc42<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>20gttgggctacgacttagaggcc22<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>21acccgatggataggtcggtgaa22<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>22taagcatcgtgccctttcgcag22<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>23accacgttcgcgttctcacatg22<210>24<211>88<212>DNA<213>人工序列<400>24agaaggcgtccgtctttgaggcttcaccgacctatccatcgggtctgcgaaagggcacga60tgcttacatgtgagaacgcgaacgtggt88<210>25<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>25cgacacgagctgacgttttggcctctaagtcgtagcccaac41<210>26<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>26tgcgctcgttgcgggattttagaaggcgtccgtctttgaggc42<210>27<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>27catgatgatttgacgttttagaaggcgtccgtctttgaggc41