温度敏感型细胞培养装置及制备方法、细胞培养方法
【专利摘要】本发明提供一种温度敏感型细胞培养装置及制备方法、细胞培养方法。本发明的温度敏感型细胞培养装置，包括聚苯乙烯体，所述聚苯乙烯体上接枝聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。与现有技术相比，本发明的温度敏感型细胞培养装置在培养细胞时，经简单的温度变化，就可以非损伤的获得完整的培养细胞层及其所沉积的细胞外基质，避免使用胰酶消化或者化学试剂解离，减少了细胞的死亡，降低了对细胞外基质的损伤，提高了培养细胞的质量和活性。
【专利说明】温度敏感型细胞培养装置及制备方法、细胞培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞培养装置及制备方法、细胞培养方法，特别涉及一种温度敏感型细胞培养装置及制备方法、细胞培养方法。
【背景技术】
[0002]细胞治疗是以功能性细胞为主体的治疗方法，既可作为一种独立的治疗方法，也可与常规的手术、化学药物等治疗方法联合应用。其作用机理为:1)细胞的直接作用，修复受损的组织和器官或杀伤肿瘤细胞；2)细胞的间接作用，分泌相关的细胞因子或生物活性分子，调节患者自身细胞的增殖和功能。治疗性细胞可以是患者自身来源的，也可以是同种异体来源的；治疗方法可以是一般的输注，也可以是移植。细胞治疗广泛用于骨髓移植、晚期肝硬化、股骨头坏死、恶性肿瘤、心肌梗死等疾病。
[0003]细胞治疗已有百年历史，可追溯到1493-1541年，由菲律宾Auredus Paracelsus提出，1912年德国医生将细胞治疗第一次用于治疗“小儿胸腺机能减退和甲状机能低下”，1930年瑞士的代保罗.尼汉斯(Daul Niehans, 1882-1971年)成为细胞治疗皮肤年轻化的著名医师，被称为“细胞治疗之父”。1990年，Niehans报道了 6500例患者愿意接受该治疗技术。并在墨西哥的Tiguaka开始应用细胞治疗艾滋病(AIDS)和其他各种疾病。至2012年，国外文献报道的自体MSCs移植治疗冠心病就己超过800例。一项67例的随机双盲临床试验，以自体MSCs为试验组，以安慰剂为对照组，治疗后4个月MRI检查，证实心肌血循环及心功能显著改善。国内己在很多医院有类似的临床应用，不仅用于治疗冠心病，也用于肢体缺血性疾病、促进上皮再生等治疗，近期疗效令人鼓舞。在MEDELINE上输入Cell andStem Cell Therapy,可检索到6万多条相关文献,表明细胞治疗的基础研究与临床应用已成为世界各国的研究热 点。细胞治疗具有极好的应用前景，已成为世界各国科学家、临床医生、管理者的共识。
[0004]在组织工程学中生物支架材料是指通过提供物理和化学的信号，在形成有功能的组织的过程中能指导细胞生长，分化和形成组织而所设计出的新的生物材料。通常的观点认为，理想的组织工程支架材料应该满足下列要求:①良好的组织相容性生物降解性，降解速率与新组织形成速率相一致；③无毒无免疫原性；④合适的力学性能；⑤适当的三维结构(空隙和形态)，以便细胞、气体、代谢产物、营养成分和信号分子在支架内部运输并与周围局部环境相交换。根据降解与否，生物支架材料可分为非可降解材料和可降解材料。根据来源，可分为天然生物材料和人工合成生物材料两大类，每类材料又可分为有机材料和无机材料。
[0005]目前，在组织工程中脱去组织内细胞的方法基本都是应用生物学酶(如胰蛋白酶，中性蛋白酶和核酸酶等)消化法或直接细胞刮落法，其存在对细胞表面蛋白、离子通道、细胞信号等造成损伤的缺点。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种温度敏感型细胞培养装置，以解决现有技术中在组织工程中脱去组织内细胞的方法基本都是应用生物学酶消化法或直接细胞刮落法，该些方法对细胞表面蛋白、离子通道、细胞信号等造成损伤的技术性问题。
[0007]本发明的另一目的在于提供上述的温度敏感型细胞培养装置的制备方法，以解决现有技术中在组织工程中脱去组织内细胞的方法基本都是应用生物学酶消化法或直接细胞刮落法，该些方法对细胞表面蛋白、离子通道、细胞信号等造成损伤的技术性问题。
[0008]本发明的再一目的在于提供利用上述的温度敏感型细胞培养装置培养细胞的方法，以解决现有技术中在组织工程中脱去组织内细胞的方法基本都是应用生物学酶消化法或直接细胞刮落法，该些方法对细胞表面蛋白、离子通道、细胞信号等造成损伤的技术性问题。
[0009]本发明目的通过以下技术方案实现:
[0010]一种温度敏感型细胞培养装置，包括聚苯乙烯体，所述聚苯乙烯体上接枝聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。
[0011]上述的温度敏感型细胞培养装置的制备方法，包括以下步骤:
[0012]a、制备聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物；
[0013]b、将制得的聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物接枝在聚苯乙烯体上，得到温度敏感型细胞培养装置。
[0014]优选地，所述步骤a进一步包括:在二氧六环中加入聚苯乙烯、异丙基丙烯酰胺单体和偶氮二异丁腈，聚苯乙烯、异丙基丙烯酰胺单体、偶氮二异丁腈的质量之比为1:1:0.01-1:2:0.5，室温下 搅拌溶解；通氮气-冷冻-抽排循环3-5次，70-100°C反应10_18h，旋蒸除掉二氧六环，加入四氢呋喃溶解，在乙醚中沉淀，得聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。
[0015]优选地，所述聚苯乙烯由以下方法制备:在甲苯中将苯乙烯和二硫化二异丙基黄原酸酯混合搅拌均匀，室温下加入偶氮二异丁腈，苯乙烯、二硫化二异丙基黄原酸酯和偶氮二异丁腈的质量比为(15-20):3:(1-3)，搅拌至偶氮二异丁腈完全溶解，通氮气，70-90°C反应5-7h，旋蒸除掉甲苯，加入四氢呋喃溶解，在石油醚中沉淀，得聚苯乙烯。
[0016]优选地，所述步骤b进一步包括:将聚苯乙烯体放置到涂层机上，滴加聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺溶液于聚苯乙烯体上，使涂层机的转速为2000-35000rpm，悬涂30-60s，将制备好的聚苯乙烯体放入烘箱内在80-120°C烘干2_4h，即得到温度敏感型细胞培养装置。
[0017]优选地，还包括以下步骤:用傅立叶红外光谱分析或接触角测试的检测方法验证是否接枝成功。
[0018]利用上述的温度敏感型细胞培养装置培养细胞的方法，包括以下步骤:
[0019]a、对权利要求1所述的温度敏感型细胞培养装置进行消毒、灭菌；
[0020]b、用上述的温度敏感型细胞培养装置进行细胞培养，培养温度为35_38°C，待细胞培养结束后，使温度敏感型细胞培养装置的温度降为10-28°C，细胞从温度敏感型细胞培养装置上自动脱落。
[0021]优选地，所述细胞包括单克隆抗体活化的免疫细胞、脐带间充质干细胞、羊膜干细胞、成体组织间充质干细胞和人工诱导的多能干细胞。[0022]优选地，所述灭菌方法选自用苯扎溴铵溶液浸泡、酒精浸泡、EOG灭菌或Y射线灭菌的其中一种。
[0023]优选地，所述自动脱落的细胞可以成团、成片或者单独分散。
[0024]与现有技术相比，本发明有以下有益效果:
[0025]本发明的温度敏感型细胞培养装置在培养细胞时，经简单的温度变化，就可以非损伤的获得完整的培养细胞层及其所沉积的细胞外基质，避免使用胰酶消化或者化学试剂解离，减少了细胞的死亡，降低了对细胞外基质的损伤，提高了培养细胞的质量和活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为实施例一中pNIPAAm接枝片的红外图谱；
[0027]图2为实施例一中干细胞在接枝片表面的脱附过程照片；
[0028]图3为实施例二中人牙髓间充质干细胞原代培养形态学照片(接种后A:24h ；B:7d ；C:10d ；D:15d,40X )；
[0029]图4为实施例二中人牙髓间充质干细胞的生长曲线图；
[0030]图5为接枝片脱落的细胞和胰酶消化收获的细胞进行损伤检测的示意图。
【具体实施方式】
[0031]以下结合实施例，详细说明本发明。
[0032]实施例一旋 涂法制备温敏性聚苯乙烯培养片并培养人脐带间充质干细胞
[0033](I)聚苯乙烯(PS)的合成:在25ml圆底单口烧瓶中，加入IOml干燥甲苯溶剂，将
7.5g苯乙烯和二硫化二异丙基黄原酸酯(DIP)L 5g加入烧瓶中搅拌均勻，室温下加入0.5gAIBN,搅拌至AIBN完全溶解，用橡皮塞密封，通氮气-冷冻-抽排循环三次。75°C反应6h，旋蒸除掉甲苯，加入THF溶解，在石油醚中沉淀，得聚苯乙烯(PS) 7.5g。
[0034](2) PS-PNIPAAm的合成:6ml干燥1.4 二氧六环中加入1.0g PS, 1.2g异丙基丙烯酰胺单体，IOmg AIBN，室温下搅拌溶解。通氮气-冷冻-抽排循环三次，80°C反应10h，旋蒸除掉1.4 二氧六环，加入THF溶解，在乙醚中沉淀，得PS-PNIPAAm嵌段聚合物1.34g。
[0035](3)将Icm2的聚苯乙烯片放在涂层机的真空吸盘上，将制得的PS-PNIPAAm嵌段聚合物溶解于四氢呋喃中，用注射器将嵌段聚合物溶液滴加到聚苯乙烯片上，3000r旋转30s，保证悬涂均匀。得到接枝片后放入80°C烘箱中烘干4h待用。图1给出了 pNIPAAm接枝片的红外图谱。其中，在1648cm-l左右位置的吸收峰由酰胺的羰基(C=O)的伸缩振动产生的，即酰胺I带；而在1550cm-l处的谱带为酰胺II带，是由酰胺基团中的N-H弯曲振动和C-H伸缩振动的组合吸收产生的。波数在SOOcm-1附近出现了吸收峰，这是聚苯乙烯中的苯环特征峰。由图1可判定通过悬涂法已成功将PS-PNIPAAm嵌段聚合物接枝到聚苯乙烯片的表面。
[0036](4)温敏材料的灭菌处理:接枝片烘干后，于1%苯扎溴铵溶液中浸泡30min，无菌PBS冲洗2次，如此循环重复3次。75%酒精浸泡30min，无菌PBS冲洗2次，此过程也重复3次。将接枝面朝上放入超净工作台中，尽量使表面全部暴露在紫外灯光下，紫外照射过夜。灭菌处理后，用无菌镊子将接枝片放入12孔板中，加新鲜培养液lmL，放入培养箱内检菌，48h后培养液未变浑浊，即证明灭菌彻底，可用来培养细胞。[0037](5)细胞接种:取第3代DPSCs，胰蛋白酶-EDTA消化，含血清培养液中和。离心，弃上清，调整细胞密度为105个细胞/20 μ L培养液，移取20 μ L细胞悬液轻轻滴加到接枝片的中央，缓慢放入培养箱内。6h后观察细胞80%以上贴壁，补加ImL预热的培养液继续培养。涉及温敏材料的实验组的处理过程都要在恒温板(温度控制在37°C左右)上进行，以防止细胞在室温下的自发脱落。
[0038](6)降低温度收获细胞:将接枝片置于20°C环境下，吸出原始培养基，再加入新鲜的冷a -MEM培养基，并在细胞与材料表面的边缘处用移液枪轻轻吹打一次，此时开始持续观察及拍摄细胞脱附的全过程。如附图2所示，间充质干细胞接种于温敏表面24h后，倒置显微镜下观察细胞已全部贴壁。将细胞培养孔板内培养液吸出，加入100yL25°C环境平衡的PBS，置于25°C培养箱内，记录干细胞在适宜的温敏表面脱附的整个过程。其中，当冷的PBS加入细胞培养板IOmin后，温敏表面接枝的共聚物膜边缘区域开始变厚并更具亲水性，约40min之后98%以上的细胞从温敏表面脱落。
[0039]实施例二人牙髓间充质干细胞在接枝片中培养
[0040](I)在IOml圆底单口烧瓶中，加入5ml干燥甲苯溶剂，将12g苯乙烯和二硫化二异丙基黄原酸酯(DIP) 2.4g加入烧瓶中搅拌均匀，室温下加入0.8gAIBN，搅拌至AIBN完全溶解，用橡皮塞密封，通氮气-冷冻-抽排循环三次。75°C反应5h，旋蒸除掉甲苯，加入THF溶解，在石油醚中沉淀，得聚苯乙烯(PS )。
[0041](2) PS-PNIPAAm的合成:10ml干燥1.4 二氧六环中加入3.0g PS，6.0g异丙基丙烯酰胺单体，150mg AIBN,室温下搅拌溶解。通氮气-冷冻-抽排循环五次，90°C反应15h，旋蒸除掉1.4 二氧六环，加入THF溶解，在乙醚中沉淀，得PS-PNIPAAm嵌段聚合物。
[0042](3)将制得的PS-PNIPAAm嵌段聚合物溶解于四氢呋喃中。Icm2聚苯乙烯片放在涂层机的真空吸盘上，用注 射器将嵌段聚合物溶液滴加到聚苯乙烯片上，5000rpm旋转60s，保证悬涂均匀。得到接枝片后放入100°C烘箱中烘干3h待用。
[0043](4)将接枝片于75%酒精中放置lh，然后无菌条件下烘干，紫外线照射5h，备用。
[0044](5)消化人牙髓间充质干细胞，按照15*5/ml的密度接种于接枝片中，放置于24孔板进行培养，每隔3天换液，培养8天后，将接枝片放置于25摄氏度无菌环境，观察细胞的脱附情况。请参阅图3，细胞传代后，贴壁速度增快，生长迅速。当细胞传至第4代时仍然维持较快的生长速度，培养4天左右，细胞铺满皿底，融合成片，细胞排列整齐，分布均匀，生长一致。请参阅图4，所示的DPSCs的生长曲线呈S形，接种后第O?2天为潜伏适应期，细胞无明显增殖从第3天起细胞开始增殖并进入对数生长期，第6天达到高峰，以后进入平台期。根据生长曲线可知DPSCs的群体倍增时间为33.8h。
[0045]实施例三人羊膜间充质干细胞在接枝片表面生长与脱附
[0046](I)PS-PNIPAAm嵌段共聚物的合成:50ml干燥1.4 二氧六环中加入5.0gPS，IOg异丙基丙烯酰胺单体，80mg AIBN，室温下搅拌溶解。通氮气-冷冻-抽排循环三次，100°C反应12h，旋蒸除掉1.4 二氧六环，加入THF溶解，在乙醚中沉淀，得PS-PNIPAAm嵌段聚合物。
[0047](2)将制得的PS-PNIPAAm嵌段聚合物溶解于四氢呋喃中。聚苯乙烯材料切割成5cm2的面积，将聚苯乙烯片放在涂层机的真空吸盘上，用注射器将嵌段聚合物溶液滴加到聚苯乙烯片上，8000rpm旋转40s,保证悬涂均勻。得到接枝片后放入100°C烘箱中烘干3h待用。[0048](3)温敏材料的灭菌处理:接枝片烘干后，于1%苯扎溴铵溶液中浸泡30min，无菌PBS冲洗2次，75%酒精浸泡30min，无菌PBS冲洗2次，重复3次。紫外照射过夜。
[0049](4)细胞接种:取第3代人羊膜间充质干细胞，调整细胞密度为106个细胞/100 μ L培养液，移取100 μ L细胞悬液轻轻滴加到PS片的中央，5h之后，添加培养基培养。将细胞接种于接枝片表面，置于培养箱内进行培养，5h后倒置显微镜下观察，可看到90%以上的细胞附着于温敏材料的表面，呈现半贴壁的状态。待细胞接种24h时观察到细胞所有细胞均已完全贴壁生长。
[0050](5)降低温度收获细胞:细胞在37°C培养7天之后，将接枝片置于20°C环境下，吸出原始培养基，再加入新鲜的冷a -MEM培养基，并在细胞与材料表面的边缘处用移液枪轻轻吹打一次，此时开始持续观察及拍摄细胞脱附的全过程。对从接枝片脱落的细胞和胰酶消化收获的细胞进行损伤检测，检测结果如图5所示，可以看出完全裂解的细胞、胰酶消化收获的细胞和降低温度收获的细胞释放的乳酸脱氢酶含量依次降低，且存在显著性差异。说明降低温度相较于胰酶消化可以降低对收获质细胞的损伤。
[0051]本发明的温度敏感型细胞培养装置在培养细胞时，经简单的温度变化，就可以非损伤的获得完整的培养细胞层及其所沉积的细胞外基质，避免使用胰酶消化或者化学试剂解离，减少了细胞的死亡，降低了对细胞外基质的损伤，提高了培养细胞的质量和活性。
[0052]以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变 化，都应落在本申请的保护范围内。
【权利要求】
1.一种温度敏感型细胞培养装置，其特征在于，包括聚苯乙烯体，所述聚苯乙烯体上接枝聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。
2.如权利要求1所述的温度敏感型细胞培养装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: a、制备聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物； b、将制得的聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物接枝在聚苯乙烯体上，得到温度敏感型细胞培养装置。
3.如权利要求2所述的温度敏感型细胞培养装置的制备方法，其特征在于，所述步骤a进一步包括:在二氧六环中加入聚苯乙烯、异丙基丙烯酰胺单体和偶氮二异丁腈，聚苯乙烯、异丙基丙烯酰胺单体、偶氮二异丁腈的质量之比为1:1:0.01-1:2:0.5，室温下搅拌溶解；通氮气-冷冻-抽排循环3-5次，70-100°C反应10-18h，旋蒸除掉二氧六环，加入四氢呋喃溶解，在乙醚中沉淀，得聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺嵌段聚合物。
4.如权利要求3所述的温度敏感型细胞培养装置的制备方法，其特征在于，所述聚苯乙烯由以下方法制备:在甲苯中将苯乙烯和二硫化二异丙基黄原酸酯混合搅拌均匀，室温下加入偶氮二异丁腈，苯乙烯、二硫化二异丙基黄原酸酯和偶氮二异丁腈的质量比为(15-20):3:(1-3)，搅拌至偶氮二异丁腈完全溶解，通氮气，70-901:反应5_7h，旋蒸除掉甲苯，加入四氢呋喃溶解，在石油醚中沉淀，得聚苯乙烯。
5.如权利要求2所述的温度敏感型细胞培养装置的制备方法，其特征在于，所述步骤b进一步包括:将聚苯乙烯体放置到涂层机上，滴加聚苯乙烯-聚N-异丙基丙烯酰胺溶液于聚苯乙烯体上，使涂层机的转速为2000-35000rpm，悬涂30_60s，将制备好的聚苯乙烯体放入烘箱内在80-120°C烘干2-4h，即得到温度敏感型细胞培养装置。
6.如权利要求2所述的 温度敏感型细胞培养装置的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤:用傅立叶红外光谱分析或接触角测试的检测方法验证是否接枝成功。
7.一种利用权利要求1所述的温度敏感型细胞培养装置培养细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: a、对权利要求1所述的温度敏感型细胞培养装置进行消毒、灭菌； b、用上述的温度敏感型细胞培养装置进行细胞培养，培养温度为35-38°C，待细胞培养结束后，使温度敏感型细胞培养装置的温度降为10-28°C，细胞从温度敏感型细胞培养装置上自动脱落。
8.如权利要求7所述的培养细胞的方法，其特征在于，所述细胞包括单克隆抗体活化的免疫细胞、脐带间充质干细胞、羊膜干细胞、成体组织间充质干细胞和人工诱导的多能干细胞。
9.如权利要求7所述的培养细胞的方法，其特征在于，所述灭菌方法选自用苯扎溴铵溶液浸泡、酒精浸泡、EOG灭菌或Y射线灭菌的其中一种。
10.如权利要求7所述的培养细胞的方法，其特征在于，所述自动脱落的细胞可以成团、成片或者单独分散。
【文档编号】C08J7/12GK103436444SQ201310321123
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月26日 优先权日:2013年7月26日
【发明者】齐念民, 杜明明, 冯见, 陈彦田 申请人:上海瀚正生物技术服务有限公司