反萃取法制备硫酸软骨素的方法
【专利摘要】本发明公开了反萃取法制备硫酸软骨素的方法，该硫酸软骨素制备方法包括下列步骤：（1）蒸煮、碱提；（2）酶解；（3）吸附；（4）反萃取；（5）沉淀、干燥。本发明的生产工艺简单，适合规模化生产，产品质量稳定，硫酸软骨素回收率达到80%以上。
【专利说明】反萃取法制备硫酸软骨素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种反萃取法制备硫酸软骨素的方法。
【背景技术】
[0002]硫酸软骨素,英文名chondroitin sulfate,是以动物(猪、牛、马、羊、鸡、藍鱼等)的软骨为原料的一种高分子酸性粘多糖，其分子结构为β -D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖通过βI — 3糖苷键形成的重复二糖单位所组成的多糖链。它是一种白色或微黄色粉末，吸水性强，易溶于水而成粘稠液体，不溶于酒精、丙酮、乙醚和氯仿等有机溶剂，其盐类对热较稳定。硫酸软骨素的生物活性，随分子量而不同。其药理活性与分子量有密切关系，分子量的大小对口服后肠胃吸收率的影响也十分明显。
[0003]目前，硫酸软骨素的提取方法有酶解、碱法、超声波法和中性盐法等；其分离纯化有乙醇沉淀法、离子交换色谱法、季铵盐配合法、吸附法和纤维素分离法等。提取硫酸软骨素主要采用碱-酶提取法，包括如下步骤:碱提、酶解、氧化、醇沉，操作过程繁琐，周期长，生产成本高，产品纯度低。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于:提供一种反萃取法制备硫酸软骨素的方法，操作过程简单，避免氧化及多次醇沉工序，缩短周期，制备的硫酸软骨素的产品纯度高。 本发明采取以下技术解决方案予以实现:该反萃取法制备硫酸软骨素的方法包括下列步骤:
(1)蒸煮、碱提:先将软骨在80-100°C水中煮4-6h，然后加入原料干重的6.25倍的质量浓度3%氢氧化钠溶液，30-40°C提取1.5-2 h，再用盐酸调pH到5.5-6.5，纱布过滤，留下滤液；
(2)酶解:将步骤(1)的滤液调节pH8.0~9.0，按滤液与胰酶1000: 0.5_2的质量比加入胰酶，于40~50°C水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000: 0.5-2的质量比加入胃蛋白酶，40~50°C水解3 h，过滤；
(3)吸附:步骤(2)的酶解液中加入吸附剂吸附，缓慢间歇搅拌4h，置4°C自然澄清，取上清液；
(4)反萃取:将步骤(3)的上清液按体积比1:1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
(5)沉淀、干燥:将步骤(4)的萃取液调PH6，加入体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得硫酸软骨素成品。
[0005]其中，步骤(3)的吸附剂为硅藻土、高岭土或活性炭，其终浓度0.2%-0.8%。
[0006]本发明的效果是:应用反萃取法制备硫酸软骨素，方法简单，工艺周期短，减少碱解带来的环境污染，所得的硫酸软骨素产品纯度高，收率好。
【具体实施方式】
[0007]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。
[0008]实施例1:依以下步骤制备硫酸软骨素
(O蒸煮、碱提:先将2公斤软骨原料加水浸没，在80°C水中煮6 h，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，漏勺捞出软骨；软骨放入反应釜，加入12.5公斤质量浓度3%氢氧化钠溶液，30°C提取2 h，再用盐酸调pH到5.5，纱布过滤，留下滤液；
(2)酶解:将步骤(1)的滤液调节pH8.0，按滤液与胰酶1000: 0.5的质量比加入胰酶，于40°C水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000: 0.5的质量比加入胃蛋白酶，40°C水解3 h，过滤；
(3)吸附:步骤(2)的酶解液中加入硅藻土吸附，硅藻土终浓度为0.2%，缓慢间歇搅拌4h，置4°C自然澄清，取上清液；
(4)反萃取:将步骤(3)的上清液按体积比1:1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
(5)沉淀、干燥:将步骤(4)的萃取液调PH6，加入其体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得125g硫酸软骨素成品；其中，硫酸软骨素成品中葡萄糖醛酸的含量达35.0%。
[0009]实施例2:依以下步骤制备硫酸软骨素
(O蒸煮、碱提:先将2公斤软骨原料加水浸没，在90°C水中煮5 h，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，漏勺捞出软骨；软骨放入反应釜，加入12.5公斤质量浓度3%氢氧化钠溶液，35°C提取1.75 h，再用盐酸调pH到6.0,纱布过滤，留下滤液；
(2)酶解:将步骤(1)的滤液调节pH8.5，按滤液与胰酶1000: 1.25的质量比加入胰酶，于45°C水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000: 1.25的质量比加入胃蛋白酶，45°C水解3h，过滤；
(3)吸附:步骤(2)的酶解液中加入高岭土吸附，高岭土终浓度为0.5%，缓慢间歇搅拌4h，置4°C自然澄清，取上清液；
(4)反萃取:将步骤(3)的上清液按体积比1:1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
(5)沉淀、干燥:将步骤(4)的萃取液调PH6，加入体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得127g硫酸软骨素成品；其中，硫酸软骨素成品中葡萄糖醛酸的含量达35.7%。
[0010]实施例3:依以下步骤制备硫酸软骨素
(O蒸煮、碱提:先将2公斤软骨原料加水浸没，在100°C水中煮4 h，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，漏勺捞出软骨；软骨放入反应釜，加入12.5公斤
质量浓度3%氢氧化钠溶液，40°C提取1.5 h，再用盐酸调pH到6.5，纱布过滤，留下滤液；
(2)酶解:将步骤(1)的滤液调节pH9.0，按滤液与胰酶1000: 2的质量比加入胰酶，于50°C水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000: 2的质量比加入胃蛋白酶，50°C水解3 h，过滤；(3)吸附:步骤(2)的酶解液中加入活性炭吸附，活性炭终浓度为0.8%，缓慢间歇搅拌4h，置4°C自然澄清，取上清液；
(4)反萃取:将步骤(3)的上清液按体积比1:1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
(5)沉淀、干燥:将步骤(4)的萃取液调PH6，加入体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得128g硫酸软骨素成品；硫酸软骨素成品中葡萄糖醛酸的含量达36.5% 。
【权利要求】
1.反萃取法制备硫酸软骨素的方法，其特征是该硫酸软骨素制备方法包括下列步骤: (1)蒸煮、碱提:先将软骨在80-100°C水中煮4-6h，然后加入原料干重的6.25倍的质量浓度3%氢氧化钠溶液，30-40°C提取1.5-2 h，再用盐酸调pH到5.5-6.5，纱布过滤，留下滤液； (2)酶解:将步骤(1)的滤液调节pH8.0~9.0，按滤液与胰酶1000: 0.5_2的质量比加入胰酶，于40~50°C水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000: 0.5-2的质量比加入胃蛋白酶，40~50°C水解3 h，过滤； (3)吸附:步骤(2)的酶解液中加入吸附剂吸附，缓慢间歇搅拌4h，置4°C自然澄清，取上清液； (4)反萃取:将步骤(3)的上清液按体积比1:1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层； (5)沉淀、干燥:将步骤(4)的萃取液调PH6，加入体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得硫酸软骨素成品。
2.如权利要求1所述的反萃取法制备硫酸软骨素的方法，其特征是:步骤(3)的吸附剂为硅藻土、高岭土或 活性炭，其终浓度0.2%-0.8%。
【文档编号】C08B37/08GK104177511SQ201410422075
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】陈菊 申请人:淮安麦德森制药有限公司