用于有效纯化来自微生物发酵的中性人乳低聚糖(HMO)的方法与流程

技术特征：

1.一种用于从通过微生物发酵获得的发酵液以分批方式或连续方式纯化中性人乳低聚糖(HMO)的方法，所述发酵液包含中性HMO、生物质、培养基组分和污染物，其中发酵液中所述中性HMO的纯度为＜80％，

其特征在于，对所述发酵液应用以下纯化步骤：

i)从发酵液分离生物质，

ii)进行阳离子交换剂处理以去除带正电荷的物质，

iii)进行阴离子交换剂处理以去除带负电荷的物质，

iv)纳滤步骤和/或电渗析步骤，

其中提供包含纯度≥80％的所述中性HMO的纯化溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从通过使用重组微生物的微生物发酵获得的发酵液纯化所述中性HMO，所述重组微生物优选细菌或酵母、更优选在化学成分确定的培养基中生长的重组微生物，其中将步骤i)中分离的生物质任选地再循环到微生物发酵。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，发酵液中所述中性HMO的纯度为≤70％、≤60％、≤50％、≤40％、≤30％、≤20％、≤10％或≤5％和/或所述纯化溶液含有纯度≥85％、优选≥90％的所述中性HMO。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述中性HMO的收率为＞75％和/或所述纯化溶液不含DNA、蛋白质和/或重组遗传物质。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述中性HMO选自2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖和乳-N-新六糖。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，通过以下步骤实现从发酵液分离生物质：

a)超滤，其优选通过分离生物质和＞500kDa、更优选＞150kDa的物质来实施；和/或

b)通过错流过滤器过滤，所述过滤器优选具有≤100kDa的截留、更优选具有≤10kDa的截留、甚至更优选≤5kDa的截留；

其中步骤a)优选在步骤b)之前实施。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，纯化步骤ii)至iv)中至少一个在所述方法中重复至少一次。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，在纯化步骤i)至iv)中至少一个之后，对所述发酵液应用活性炭处理至少一次以将显色物质和更大的低聚糖吸附至活性炭。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，

a)在纯化步骤i)至iv)中至少一个之后；或

b)在用于将显色物质和更大的低聚糖吸附至活性炭的至少一次活性炭处理之后；或

c)在纯化步骤i)至iv)中至少一个之后实施的浓缩步骤之前；

对包含中性人乳低聚糖的溶液进行渗滤和/或浓缩，其优选用纳滤膜、的尺寸排阻极限的纳滤膜来实施，其中最优选将所述溶液渗滤直至达到≤15mS/cm、优选≤10mS/cm、更优选≤5mS/cm的电导率。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤i)之前的步骤中，对所述发酵液实施葡糖苷酶处理、优选β-葡糖苷酶处理，其中所述处理优选通过以下实施

a)添加能够表达适用于降解不需要的中间体、底物和/或低聚糖副产物的一种或更多种糖苷酶的微生物菌株；和/或

b)使用表达一种或更多种糖苷酶的发酵菌株，其优选通过向所述发酵液添加诱导物和/或通过改变所述发酵液的温度来实施；和/或

c)向发酵液添加粗酶形式或纯化酶形式的一种或更多种糖苷酶，优选至少β-葡糖苷酶。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，在纯化步骤i)至iv)中至少一个之后，优选在纯化步骤iv)之后，使用真空蒸发或反渗透或纳滤将所述发酵液

a)浓缩至≥100g/L、优选≥200g/L、更优选≥300g/L的浓度；和/或

b)在真空蒸发或反渗透期间，在＜80℃、优选＜50℃、更优选20℃至50℃、甚至更优选30℃至45℃的温度下浓缩；和/或

c)在＜80℃、优选＜50℃、更优选20℃至50℃的温度下浓缩。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纯化溶液无菌过滤和/或使其经受内毒素去除，其优选借助所述纯化溶液通过3kDa过滤器的过滤来实施。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纯化溶液浓缩至＞1.5M的浓度并冷却至＜25℃、更优选＜8℃的温度，以获得所述中性HMO的结晶物质。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纯化溶液喷雾干燥，特别地以20至60(重量/体积)、优选30至50(重量/体积)、更优选35至45(重量/体积)的所述中性HMO的浓度，在110℃至150℃、优选120℃至140℃、更优选125℃至135℃的喷嘴温度和/或60℃至80℃、优选65℃至70℃的出口温度下进行喷雾干燥。

15.一种用根据权利要求1至14中任一项所述的方法能够制备的中性人乳低聚糖(HMO)，其中，中性HMO优选是喷雾干燥的或结晶的。

16.根据权利要求15所述的HMO，其特征在于，所述中性HMO选自2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖和乳-N-新六糖。

17.根据权利要求15或16中任一项所述的HMO，其特征在于，所述HMO

a)在300g/l的溶液中具有小于1mSi/cm的电导率；

b)不含重组DNA物质，任选地不含任何DNA；和/或

c)不含来源于重组微生物的蛋白质，任选地不含任何蛋白质。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的HMO，其用于医学，优选用于预防或治疗胃肠道紊乱。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的HMO在食品中作为添加剂的用途，优选在人类食品和/或宠物食品中作为添加剂，更优选在人类婴儿食品中作为添加剂。