本发明涉及一种RGD三肽的制备方法。
背景技术：
RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-ASP)序列的短肽，广泛存在于生物体内，是整合素(Integrin)与其配体蛋白相互作用的识别位点。自Pierschbacher等于1984年首次报道纤维蛋白原中所含的RGD序列为细胞识别位点以来，RGD肽及其衍生物就成为众多学者关注与研究的热点。人体中最常见的含RGD序列的基质蛋白主要有纤维黏连蛋白，层黏蛋白、玻璃黏连蛋白、胶原、凝血栓蛋白等(Temming K,Schiffelers R.M,Molema G,et al.Kok RJ.RGD-based strategies for selective delivery of therapeutics and imaging agents to the tumor vasculature[J].Drug Resist Updat,2005,8(6):381-402)。
细胞黏附在细胞黏附性疾病(癌转移、血栓形成、化学致炎和骨质疏松)的发展过程中期关键作用。调节性糖蛋白例如RGD肽与整合素受体有很强的结合能力，可参与细胞黏附过程。例如RGD肽与血小板、肿瘤细胞及骨基表面的GP IIb/IIIa受体特异性结合可干预血栓、癌转移和骨质疏松的发展过程。RGD肽的这种作用赋予了含RGD序列的化合物一种重要性质，即含RGD序列的化合物可以向血栓、癌转移和骨质疏松的患病部位富集。正是由于RGD具有广泛的应用前景，所以已经成为极具研究价值的生物活性肽之一，而高效、快捷的合成RGD为其深入研究提供了坚实的基础。
目前RGD的合成方法主要有酶催化合成法和化学合成法。酶催化合成法中溶剂体系、含水量、温度、pH、反应时间及底物摩尔比等均会对酶活性产生影响，因此该方法反应条件要求比较严格，不易控制。化学合成法可以分为固相法和液相法。到目前为止，各种各样固相合成技术使得人们可以合成各种肽及衍生物，但由于其所用试剂和设备费用较高，固相合成反在很大程度上被局限于10克之内的规模(黄惟德，陈常庆，《多肽合成》，科学出版社，第一版，1985)。而液相合成法则适于大规模合成相对较短的肽以及实现肽片段的缩合，但通过目前的液相合成方法得到的RGD三肽纯度较低，约为80％左右，并含有残留溶剂(如冰醋酸等)。本发明的目的是通过对RGD三肽的合成工艺研究，克服现有技术的缺陷，快速、高效的合成高纯度RGD三肽。
技术实现要素：
具体路线如下：
(1)以甘氨酸为起始原料，在碱的作用下，经叔丁氧羰基(Boc)保护，得到Boc-甘氨酸(中间体1)。
(2)Boc-甘氨酸与天冬氨酸双苄酯对甲苯磺酸盐(原料2)在缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)以及有机碱的作用下缩合，得到Boc-甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体3)。
(3)Boc-甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体3)在三氟醋酸(TFA)作用下脱去Boc，得到甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐(中间体4)。
(4)甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐与N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸(原料5)在缩合剂二环己基碳二亚胺DCC/4-二甲氨基吡啶DMAP以及有机碱的作用下缩合得到精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体6)。
(5)精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体6)在TFA作用下脱掉Boc得到精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐(中间体10)。
(6)精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐常温、常压下经催化氢化脱掉所有保护基得到精氨酰甘氨酰天冬氨酸三肽(RGD)。
步骤1反应温度为-5～40℃，优选0～30℃；反应时间为12～48小时，优选24小时；所用溶剂为水、有机溶剂或其组合，有机溶剂可选用四氢呋喃、二氧六环等，优选水。
步骤1中的碱可列举氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸锂、三乙胺、二乙基异丙胺、N-甲基吗啡啉等，优选氢氧化钠和氢氧化钾；甘氨酸与Boc2O摩尔比为1:1～2，优选1:1.5。
步骤2反应温度为0～30℃，反应时间为4～12小时，优选6～8小时；溶剂可列举二氯甲烷、氯仿等；有机碱可列举N-甲基吗啡啉(NMM)、三乙胺、二异丙基乙胺等，天冬氨酸双苄酯对甲苯磺酸盐：Boc-甘氨酸：DCC:DMAP:有机碱摩尔比为1:1～3:1～2:0.5～1.5:1～3，优选1:1.2～2.5:1～1.5:0.5～1:1.5～2。该条件下，可以接近定量的收率得到Boc-甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体3)，且产物纯度≥99％。
步骤3反应温度为室温，反应时间为0.5～4小时，溶剂优选二氯甲烷，二氯甲烷：三氟醋酸体积比为1:0.3～1.5，优选1:1。通过该方法可以快速、完全的脱除Boc保护基，反应收率可以达到100％。
步骤4反应温度为0～30℃，反应时间为6～24小时，优选10～14小时；溶剂可列举二氯甲烷、氯仿等；有机碱可列举N-甲基吗啡啉、三乙胺、二异丙基乙胺等；N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸:甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐:DCC:DMAP:NMM摩尔比为1:1～3:1～2:0.5～1.5:1～3，优选1:1.2～2.5:1～1.5:0.5～1:1.5～2。
步骤5反应温度为室温，反应时间为2～4小时，溶剂优选二氯甲烷，二氯甲烷：三氟醋酸体积比为1:0.3～1.5，优选1:1。
步骤6反应温度为室温，反应时间为6～24小时，Pd/C用量为精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐(中间体10)质量的5～30％，优选10％；溶剂可列举水、甲醇、乙醇、四氢呋喃、冰醋酸、甲酸、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等，优选水、甲醇、乙醇和四氢呋喃。反应收率可达90％以上，纯度≥99％。
步骤2和步骤4中的缩合剂也可以选择1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐EDCI/1-羟基苯并三唑HOBt。
步骤3和步骤5也可以用饱和盐酸四氢呋喃溶液、饱和盐酸二氧六环溶液或饱和盐酸乙酸乙酯溶液脱除Boc。
具体实施方式
以下结合实施例更详细地说明本发明，但是本发明并不受这些记载的任何限定
实施例1 Boc-甘氨酸(中间体1)的制备
取甘氨酸(100g,1.3mol)溶于2000mL水，冰浴下加入NaOH(80g,2mol)，搅拌下加入Boc2O(350g,1.6mol)，自然升至室温反应24小时，结束反应，反应液用乙醚萃取2次，水层用1M盐酸酸化至pH3～4，乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯，残留物用乙酸乙酯/石油醚重结晶得白色固体215.2g，收率92％。
实施例2 Boc-甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体3)的制备
取Boc-甘氨酸(42g,240mmol)溶于二氯甲烷(600mL)，冰浴下依次加入DCC(49.5g,240mmol)DMAP(24.4g,200mmol)，NMM(33ml,300mmol)，天冬氨酸双苄酯对甲苯磺酸盐(原料2)(97g,200mmol)，室温5小时反应完全，蒸干溶剂，残留物用乙酸乙酯溶剂，分别用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，得油状物93.2g，收率99％，纯度99.9％。
实施例3甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐(中间体4)的制备
取Boc-甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体3)(47g,100mmol)溶于二氯甲烷(100mL)，搅拌下滴加三氟醋酸(TFA)(100mL)，室温反应1小时，结束反应，蒸干溶剂，乙酸乙酯/石油醚重结晶，得白色固体45.1g，收率96％。
实施例4精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体6)的制备
取N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸(原料5)(38g,120mmol)溶于二氯甲烷(300mL)，冰浴下依次加入DCC(24.8g,120mmol)，DMAP(14.7g,120mmol)，NMM(20mL,180mmol)，甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐(中间体4)(67.5g,140mmol)，室温反应12小时，蒸干溶剂，残留物用乙酸乙酯溶剂，分别用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，得浅黄色固体75.4g，收率93％。
实施例5精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐(中间体10)的制备
精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体6)(75g,110mmol)溶于二氯甲烷(150mL)，搅拌下滴加三氟醋酸(150mL)，室温反应2小时，蒸干溶剂，乙酸乙酯/石油醚重结晶，得白色固体70g，收率95％。
实施例6精氨酰甘氨酰天冬氨酸三肽(RGD)的制备
取精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐(中间体10)(20g,30mmol)溶于甲醇(100mL)，加入 Pd/C(2g)，浓盐酸HCl(0.5mL)，H2置换气，室温下通氢气反应20小时，结束反应，滤除Pd/C，蒸干溶剂，水/甲醇重结晶的白色固体9.8g，收率94％，纯度99.8％。
实施例7 Boc-甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体3)的制备
取Boc-甘氨酸(17.5g,100mmol)溶于二氯甲烷(250mL)，冰浴下依次加入EDCI(23g,120mmol)HOBt(20.3g,150mmol)，NMM(38.7ml,350mmol)，天冬氨酸双苄酯对甲苯磺酸盐(原料2)(43.7g,90mmol)，室温8小时反应完全，蒸干溶剂，残留物用乙酸乙酯溶剂，分别用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，得油状物41.1g，收率97％，纯度99.4％。
实施例8精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体6)的制备
取N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸(原料5)(38g,120mmol)溶于二氯甲烷(300mL)，冰浴下依次加入EDCI(27.6g,144mmol)HOBt(24.3g,180mmol)，NMM(39.8mL,360mmol)，甘氨酰天冬氨酸双苄酯三氟醋酸盐(中间体4)(67.5g,140mmol)，室温反应12小时，蒸干溶剂，残留物用乙酸乙酯溶剂，分别用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，得浅黄色固体72.5g，收率90％。
实施例9甘氨酰天冬氨酸双苄酯盐酸盐(中间体11)的制备
取Boc-甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体3)(47g,100mmol)溶于饱和盐酸乙酸乙酯溶液(200mL)，室温反应2小时，结束反应，蒸干溶剂，乙酸乙酯/石油醚重结晶，得白色固体37.4g，收率92％。
实施例10精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯盐酸盐(中间体12)的制备
精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体6)(68g,100mmol)溶于饱和盐酸乙酸乙酯溶液(300mL)，30℃反应2.5小时，蒸干溶剂，乙酸乙酯/石油醚重结晶，得白色固体53.6g，收率88％。
实施例12精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯(中间体6)的制备
取N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸(原料5)(31.7g,100mmol)溶于二氯甲烷(300mL)，冰浴下依次加入DCC(20.7g,100mmol)，DMAP(12.3g,100mmol)，NMM(16.7mL,150mmol)，甘氨酰天冬氨酸双苄酯盐酸盐(中间体11)(44.8g,110mmol)，室温反应10小时，蒸干溶剂，残留物用乙酸乙酯溶剂，分别用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂，残留物柱层析纯化，得浅黄色固体57.8g，收率86％。
实施例12精氨酰甘氨酰天冬氨酸三肽(RGD)的制备
取精氨酰甘氨酰天冬氨酸双苄酯盐酸盐(中间体12)(18.2g,30mmol)溶于甲醇(100mL)，加入Pd/C(2g)，浓盐酸HCl(0.5mL)，H2置换气，室温下通氢气反应20小时，结束反应，滤除Pd/C，蒸干溶剂，水/甲醇重结晶的白色固体9.5g，收率91％，纯度99.6％。