水稻黄单胞杆菌的分子标记及其应用的制作方法与工艺

水稻黄单胞杆菌的分子标记及其应用本申请是针对申请人于2014年04月25日申请的发明名称为“水稻黄单胞菌的分子标记及其应用”(原申请号为：2014101695173)的发明专利所做的分案申请。技术领域本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了水稻黄单胞杆菌的分子标记及其应用，特别是提供了水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌鉴定的显性分子标记和共显性分子标记，以及应用这些分子标记检测两种病原细菌的应用。

背景技术：
水稻黄单胞杆菌是一类典型的黄色的革兰氏阴性菌，是水稻上主要的细菌性致病菌，包括水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)和水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)(Zhao,Ardalesetal.2004).Xoo能够引起水稻的维管束病害是水稻白叶枯病，而Xoc是通过组织间隙来侵染水稻从而引起水稻细菌性条斑病。由于水稻白叶枯病(BB)受到温度以及地域的影响成为最为严重的水稻细菌性病害之一，受之影响严重的主要是亚洲和部分非洲地区。然而高产的水稻品种是更易受到水稻白叶枯病(BB)的侵染，因此水稻白叶枯病(BB)常导致严重的经济损失，减产量达50％。相比之下，水稻细菌性条斑病菌(BLS)引起的损失相对较小，严重的时候减产量达30％。但是，随着杂交水稻的广泛种植，水稻细菌性病害有逐年加重的趋势。因此，遏制水稻细菌病害的发展对于稳定粮食生产和改善人们生活水平至关重要。随着全球贸易在农业中的蔓延，水稻种子进出口的检验工作尤为重要。而在亚洲包括中国在内，已经把水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌定义为水稻检疫性病害。其种子带菌传播严重，因此，快速检测和准确的识别病原物是检疫工作的关键，同时能够有效的防治病害发生和减少病害带来的损失。尽管水稻白叶枯病菌和水稻细菌性病菌的侵染方式不同，但是由于同属水稻黄单胞菌的白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)和条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)亲缘关系非常近，且基因组序列相似性高达90％以上，在检疫工作中不易被鉴定区分。传统的筛选分离手段对于同种不同致病变种，形态特征极为相似菌株，区分起来耗时耗力。噬菌体技术在水稻细菌病害流行中较为常用，但噬菌体专化性易造成的假阴性以及血清学方法中抗血清质量问题易产生的假阳性，使得这种方法的普及受到限制。在当前的检验检疫工作中，采用方便、经济的PCR分子标记开展相关工作已经成为主要方法，各种以PCR为依托的检测方法络绎不绝，如TaqMan实时荧光PCR方法虽然准确灵敏但成本昂贵，很难应用到日常检验检疫工作中。在水稻两种细菌性病害的检验检疫中，前人利用两种病原菌中电子转移黄蛋白α亚基的差异和跨膜蛋白基因(AY319937、AY319941)的差异设计显性专化性引物来进行鉴定区分，取得一定的效果。由于细菌间存在一定程度的遗传物质的交换，单一分子标记容易造成检测上的误差，而且PCR实验在实际操作中容易形成一定的污染概率，存在一定的假阳性风险，因此开发丰富的、保守性高的分子标记进行多位点检测有利于保证检测的准确性。而伴随着生物测序技术的发展，完成了很多全基因组测序工作。到目前为止，已经有四个黄单胞杆菌的菌株完成了测序(其中包括KACC10331,PXO99A,MAFF311018,andBLS256),以及完成了水稻白叶枯病菌株AX01947的草图。基于已获得的信息，可以利用生物信息学的比较算法来研究不同小种之间的差异。如何利用这些已有研究成果来区分水稻白叶枯病菌和水稻细菌性病菌成为我们的研究前沿。

技术实现要素：
本发明的发明人正是针对现有技术的研究情况基于这些已经发布的物种序列进行全基因组序列比对，提供了水稻黄单胞杆菌的分子标记及其应用，特别是提供了水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌鉴定的显性分子标记和共显性分子标记，以及应用这些分子标记检测两种病原细菌的应用。发明人首先根据已公布的3个白叶枯病菌株MAFF311018、KACC10311、PXO99A与2个条斑病菌株BLS256的基因组序列和RS105的部分基因序列，利用生物信息学的方法对Xoo菌株全基因组内以及与Xoc全基因组间比对分析，选定白叶枯病菌MAFF311018和条斑病菌BLS256为分析对象，根据两菌株基因组的差异序列，设计特异性引物，通过常规PCR技术，对包含水稻白叶枯病菌和条斑病菌及其它相关菌株在内的40个候选菌株进行检测区分。最终确定了可以用于区分的分子标记如下：水稻白叶枯病菌的分子标记，其序列如SEQIDNO.1-58所示；水稻细菌性条斑病菌的分子标记，其序列如SEQIDNO.59-104所示；水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的共显性分子标记，其序列如SEQIDNO.105-126所示；利用这些分子标记不但可以特异鉴定水稻黄单胞杆菌，还可以对水稻黄单胞杆菌的两个致病变种水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌进行更进一步的细致鉴定，从而解决现有技术中鉴定准确性差的问题，鉴定技术中不可靠的问题。通过上述确定的分子标记，结合简单的PCR技术以及普通的DNA检测系统进行检测，为简便，快速、准确地检测两种病原细菌开辟了有效途径，可以对于大量的样本采用多标记协同检测，有利于提高检测可靠性，符合检测技术发展的方向。附图说明图1为本发明特异性引物设计原理示意图；图2为水稻白叶枯病菌专化性引物验证结果示意图，图中1-10为水稻细菌性条斑病菌，分别是RH3,JSB2-24,RS85,RS105,HNB8-47,HCA1,HCA2,HCB1,HCC1,HGA1；11-35:为水稻白叶枯病菌，分别是PXO99,PXO86,PX071,PXO61,JL691-1,PXO339a,PXO339b,PXO339c,SC-yc-a,FuJian,GD414,HeN11,YN24,YN18,YN11,YN1,T3,T2,T1,JL691-2,PXO349,PXO364,PXO347,Zhe173-1,Zhe173-3；36-40:为参照菌株，分别是Aac,Xcv,Xac,Xcc,Pst；图3为水稻细菌性条斑病菌专化性引物验证结果示意图，图中1-10为水稻细菌性条斑病菌，分别是RH3,JSB2-24,RS85,RS105,HNB8-47,HCA1,HCA2,HCB1,HCC1,HGA1；11-35:为水稻白叶枯病菌，分别是PXO99,PXO86,PX071,PXO61,JL691-1,PXO339a,PXO339b,PXO339c,SC-yc-a,FuJian,GD414,HeN11,YN24,YN18,YN11,YN1,T3,T2,T1,JL691-2,PXO349,PXO364,PXO347,Zhe173-1,Zhe173-3；36-40:为参照菌株，分别是Aac,Xcv,Xac,Xcc,Pst；图4为水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌共显性引物验证结果示意图，图中1-10:为水稻细菌性条斑病菌，分别是RH3,JSB2-24,RS85,RS105,HNB8-47,HCA1,HCA2,HCB1,HCC1,HGA1；11-35:为水稻白叶枯病菌，分别是PXO99,PXO86,PX071,PXO61,JL691-1,PXO339a,PXO339b,PXO339c,SC-yc-a,FuJian,GD414,HeN11,YN24,YN18,YN11,YN1,T3,T2,T1,JL691-2,PXO349,PXO364,PXO347,Zhe173-1,Zhe173-3；36-40:为参照菌株，分别是Aac,Xcv,Xac,Xcc,Pst。具体实施方式以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；实施例一设计可以区分鉴定水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的分子标记水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的三个小种KACC10331、PXO99A、MAFF311018和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)的两个小种BLS256、RS105，五个病菌的基因组序列和相关信息从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载获得。(表1)表1五种细菌基因组信息的数据统计发明人对Xoo(MAFF311018，KACC10311，PXO99A)3个小种的全基因组进行比对，发现序列相似程度较高，选取MAFF311018作为水稻白叶枯菌的模式小种。用RS105和BLS256比对，发现BLS256包含了RS105的全部信息，相似程度很高，因此用BLS256作为水稻细条病菌的模式小种。用BLAST对两模式小种MAFF311018与BLS256进行全基因组序列比对，用perl程序把结果中的match信息和mismatch(含gap)信息分开，利用非匹配信息设计特异性标记。(表2)表2模式菌株MAFF311018和BLS256的比对结果利用MAFF3011018基因组中与BLS256不匹配的信息，截取片段长度大于200bp的片段并用eprimer3设计引物。先用ePCR在五种菌中分别检测所设计的引物，再用Perl筛选MAFF3011018的显性分子标记。同理，开发出BLS256的显性分子标记(图1中I)。利用Perl程序，在两菌种不匹配区段的两侧各截取60bp的相似片段，分别设计上游和下游引物，这样获得的扩增产物包括三部分，一个完整的非匹配区段，两部分匹配区段。进而用ePCR筛选在两菌种中其扩增长度不一致的引物，即为可以在两种菌中有多态性的共显性分子标记(图1中II)。其中设计的相关引物的信息如表3所示。表3设计的引物相关信息本发明所检测的菌株供40株，具体信息如表4所示表4实验所用的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌以及其他相关菌株实施例二对水稻白叶枯病菌专化的显性分子标记筛选及验证我们根据所设计的对水稻白叶枯病菌专化的特异性引物的ePCR筛选结果，选取了40对引物对25株水稻白叶枯病菌和10株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证。将供试菌株划线于TSA固体培养基平板上，28℃培养2d后，挑取单菌落，置于TSA液体培养基，在180r·min-1，28℃摇床培养两天。吸取菌液3mL，用试剂盒提取菌株的基因组DNA。并以此为PCR反应的模板。优化的反应体系为：Taq酶0.2μL(5u·μL-1)，10×PCRBuffer(Mg2+Free)2μL，25mMMgCl21.2μL，2.5mMdNTPMixture1.5μL，取菌液为模板1μL，引物F(10μM)0.6μL，引物R(10μM)0.6μL，用灭菌双蒸水补充至20μL体系。反应程序为94℃预变性3min；94℃变性15s,58℃退火15s，72℃延伸30s，30个反应循环；最后72℃延伸7min。用2％的TBE琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。经检测，我们获得了29对特异性引物可以将25株水稻白叶枯病菌在所有供试菌株中准确的鉴定出来，所扩增的DNA片段均与预期目的片段大小相近(片段大小见表5)。此类特异性分子标记均不能在水稻细菌性条斑病菌以及其他参照菌株中扩增出条带(如图2所示)。表5此类分子标记在序列表中的序列号、所对应的分子标记的名称及所扩增DNA片段的大小实施例三对水稻细菌性条斑病菌专化的显性分子标记筛选及验证根据对水稻细菌性条斑病菌专化的特异性引物的ePCR筛选结果，采用已获得的供试菌株的基因组DNA，利用与实施例2完全相同的优化的PCR反应体系以及2％的TBE琼脂糖凝胶电泳检测方法，选取了40对引物对供试菌株进行验证。经过检测，我们获得了23对特异性引物可以将10株水稻细菌性条斑病菌在所有供试菌株中准确的扩增到与目标大小相符合的DNA片段(片段大小见表6)。该类特异性引物均不能在水稻白叶枯病菌以及其他参照菌株中扩增出条带(如图3所示)。表6此类分子标记在序列表中的序列号及所对应的分子标记的名称实施例四对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的共显性分子标记进行PCR试验证明我们根据水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的共显性分子标记引物的ePCR筛选结果，同样，结合实施例2和3已经建立起来的PCR检测体系和2％的TBE琼脂糖凝胶电泳方法，选取了40对引物对供试菌株进行验证。通过检测，获得了11对特异性引物可以准确地将10株水稻细菌性条斑病菌和25株水稻白叶枯病菌区分并且扩增到与目标大小相符合的DNA片段(片段大小见表7)。该类特异性分子标记在水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌中可以扩增出的DNA片段有显著差异，并且仅通过一次PCR和简单的凝胶检测就可以快速准确的区分鉴定(如图4所示)。表7此类分子标记在序列表中的序列号及所对应的分子标记的名称