用于环状RNA表达的DNA序列和表达载体及其应用的制作方法与工艺

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于环状RNA表达的DNA序列和相应的表达载体及其应用。

背景技术：
环状RNA（ciucularRNA，circRNA）是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。研究表明环状RNA主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征。已有研究显示环状RNA跟神经发育、动脉粥样硬化、强直性肌营养不良、癌症等疾病相关。此外，最新研究在在人唾液和血液中检测到环状RNA的存在，提示环状RNA可以在血液，尿液，腹水等临床标本中稳定存在，这些特点使得环状RNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。但是目前对circRNA的功能及其调控机制知之甚少。研究发现，circRNA可以作为“sponge”海绵吸附miRNA，阻断miRNA对其靶基因的抑制作用；circRNA可以通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；此外，circRNA还可能具有与蛋白质结合，调控蛋白的活性等功能。要研究circRNA的功能和调控机制一个必不可少的手段就是在细胞内过表达感兴趣的circRNA，观察其对细胞功能的影响。那么，要提高circRNA在细胞中的表达效率进而研究其功能和调控机制，需要高效、稳定的过表达基因研究的工具。目前文献报道circRNA过表达一般采取常见的商业化过表达载体如pcDNA3.1等，但是按照常方法将circRNA序列插入到载体中表达出来的是相应的线性mRNA，无法有效表达出circRNA。需要采取特殊的策略，以基因组DNA为模板，扩增circRNA序列及其上游1000bp和下游200bp的序列，然后将上游800bp序列通过反向互补插入到下游，这样得到的序列才能表达circRNA。2014年Liang对一个表达丰度极高的circRNA（hsa_circ_0001727）的两侧内含子序列进行研究，并构建了一个circRNA表达载体，但是该载体有局限性，仅个别circRNA用该载体能表达成功，成功率低[20]。现有方法操作繁琐，实验难度大，实验周期长，成功率低，给广大学者研究circRNA带来了极大的不变，限制了circRNA分子作为新型标志物及疾病治疗靶标的研究和开发。因此有必要从circRNA的形成机制及结构特点出发，开发出一种简单易行，稳定高效的circRNA过表达DNA模序及相应的载体。circRNA是通过RNA可变剪接产生的。真核生物基因的剪接为GT-AG法则，即前体RNA中参与内含子剪接的两个特殊位点，即在内含子和外显子交界处有两个相当短的保守序列：5’端为GT，3’端为AG，成为GT-AG法则。典型的剪接位置一致顺序组成为：5'-AG¯GUAAGU--------------YNYURAY--Y10-20--YAG¯G-3'。其中Y为U或C，N为任何核苷酸，箭头所指为外显子与内含子的交界。5’端剪接位称供体位（donorsite），3’端剪接位称受体位（acceptorsite）。内含子中还有另一段识别剪接边界必不可少的序列称为分枝点，位于3‘-端剪接位的上游，具有特征性组成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C），R表示嘌呤（A或G），A是剪接时参与形成分枝的特别位点。紧接在分枝点的下游有一段多嘧啶序列，也是参与剪接事件蛋白接合的位置。GT-AG保守剪接供体和受体的存在有利于提高可变剪接发生效率，大大提高RNA环化概率。Jecketal等2013年在人Hs68细胞中发现了超过25000个环状RNA，经生物信息学分析发现，circRNA的一个显著特点是两侧的内含子序列较长，是常规基因的3倍以上，而这些长的内含子中富含反向重复序列，其中最典型的就是Alu重复序列。Alu重复序列是人类基因组中一族散布的、长度大约为300bp的中等重复序列(重复频率10～104)。分析circRNA上下游500bp序列，发现20%的circRNA上下游包含Alu反向重复序列，含有ALU重复序列的circRNA表达水平是对照的6倍以上，因此反向重复序列有助于提高circRNA的表达水平。文献报道的circRNA过表达方法需要扩增circRNA本身序列及其上下游序列，并将上游序列反向互补插入到下游，构建方法操作繁琐，实验难度大，实验周期长，给广大学者研究circRNA带来了极大的不变。2014年Liang对一个表达丰度极高的circRNA（hsa_circ_0001727）的两侧内含子序列进行研究，结果发现其上下游各有50bp左右的序列对circRNA的产生至关重要，由此构建了一个circRNA表达载体，但是该载体有局限性，部分circRNA用该载体能表达成功，部分则不能，成功率低。

技术实现要素：
本发明的目的是在于提供一种适用于circRNA表达的DNA序列及其载体，该序列普遍适用于各种circRNA的表达，表达效率高效、稳定；该序列内部包含多个酶切位点，满足绝大多数circRNA的表达需求；且该序列能整合到各种类型的表达载体，能应用于普通真核表达、慢病毒表达、腺病毒表达、逆转录病毒表达、原核表达等各种表达体系中；应用含有该序列的载体表达circRNA操作简单易行，易于推广。本发明通过以下技术方案来实现：一种用于环状RNA表达DNA序列，其特征在于，核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。序列中的：“CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCG”为上下游反向重复序列，CACTACTAACTTTCTTCTTTCCTTTCCCAG以及AGGTAAGTAACAACTCTGTG为剪接供体和受体序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为多克隆位点区域，N表示任意核酸，序列可以根据需要拟定。含有上述用于环状RNA表达DNA序列，插入到真核表达载体或慢病毒载体或腺病毒载体或逆转录病毒载体中，形成系列circRNA专用表达载体。circRNA专用表达载体如pcDNA-circRNA载体，核苷酸序列为SEQIDNO:2所示；pcDNA-circRNA载体的多克隆位点区域序列为：GGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCTCGAGTCTAGA，依次是KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV、XhoI和XbaI。circRNA专用表达载体为pLL-circRNA载体，核苷酸序列为SEQIDNO:3所示，pLL-circRNA载体的多克隆位点区域序列为：GCTAGCTTAATTAAGGATCCACTAGTGGAATTCTACCGGTGCAGATATCCAGCTCGAG，依次是NheI、PacI、BamHI、EcoRI、AgeI、EcoRV和XhoI。本发明具体的载体的构建方案如下：1.circRNA过表达DNA模序设计：根据circRNA的形成机制和真核生物RNA剪接的GT-AG法则，设计出适用于circRNA表达剪接供体和剪接受体序列；根据circRNA两次内含子序列富含反向重复序列和真核生物基因组中普遍存在ALU重复序列的特点，设计circRNA表达普遍适用的上下游反向重复序列；根据商业化载体pcDNA3.1和pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro的序列信息，设计合适的多克隆位点，从而得到完整的实验circRNA过表达的DNA序列。并将这2个DNA序列交给核酸合成公司进行全基因合成.2.构建circRNA专用的表达载体：将合成的DNA序列2通过NheI和ApaI位点构建入pcDNA3.1载体中，得到pcDNA-circRNA质粒，测序确认质粒正确；将合成的DNA序列2通过XbaI和NotI位点构建入pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro载体中，得到pLL-circRNA质粒，测序确认质粒正确。3.构建多个circRNA过表达质粒：从CircBase数据库中下载hsa_circ_0001730、hsa_circ_0000268、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001756、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000711等circRNA的序列信息，设计引物从人cDNA文库中调取这些circRNA的序列；将序列通过KpnI和XbaI位点插入到上述构建好的pcDNA-circRNA质粒中，测序确认质粒构建正确。4.验证pcDNA-circRNA质粒的过表达效果：将系列circRNA表达质粒及空载体转染293T细胞，48小时后收集细胞样本；提取RNA，逆转录后QPCR观察这些表达质粒的表达效果。5.构建pLL-circRNA慢病毒表达质粒：从CircBase数据库中下载hsa_circ_0001730circRNA的序列信息，设计引物从人cDNA文库中调取这个circRNA的序列；将序列通过NheI和XhoI位点插入到上述构建好的pLL-circRNA慢病毒质粒中，测序确认质粒构建正确。6.验证pLL-circRNA慢病毒系统的过表达效果：pLL-circRNA质粒与PMDG、PMSV、PMOII质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装，48h和72h后收集并纯化慢病毒；慢病毒感染HepG2，SMMC7721并用Puromycin进行筛选构建稳定表达细胞株，收集细胞，提取RNA逆转录后QPCR检测hsa_circ_0001730的表达效果。该序列以及载体能整合到各种类型的表达载体，能应用于普通真核表达、慢病毒表达、腺病毒表达、逆转录病毒表达、原核表达等各种表达体系中。本申请的实验过程中设计了多种DNA序列，经过可靠的实验结果证实本发明涉及的DNA序列及其相应的表达载体效果最佳，操作简便、结果稳定、表达高效（circRNA表达水平提高百倍以上）。该序列及相应的载体能广泛应用于各种circRNA的表达，为研究circRNA的功能和机制提供了一个有力的研究工具，为进一步确定circRNA分子作为新型标志物及疾病治疗靶标的研究和开发提供理论支持。附图说明图1是本发明的pcDNA-circRNA质粒整体结构图；图2是本发明pcDNA-circRNA质粒的过表达效果图；图3为本发明pLL-circRNA慢病毒介导的稳定细胞株的过表达效果图。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。下面通过实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。一种用于环状RNA表达DNA序列，其特征在于，核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。序列中的：“CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCG”为上下游反向重复序列，CACTACTAACTTTCTTCTTTCCTTTCCCAG以及AGGTAAGTAACAACTCTGTG为剪接供体和受体序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为多克隆位点区域，N表示任意核酸，序列可以根据需要拟定。该序列可以插入到任何商业化表达载体（如真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体）中，形成系列circRNA专用表达载体。以商业化表达载体（pcDNA3.1和pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro）为例，我们构建了过表达载体pcDNA-circRNA和pLL-circRNA，其中pcDNA-circRNA载体的多克隆位点区域序列为：GGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCTCGAGTCTAGA，依次是KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV、XhoI和XbaI，载体结构图见附图1。pLL-circRNA载体的多克隆位点区域序列为：GCTAGCTTAATTAAGGATCCACTAGTGGAATTCTACCGGTGCAGATATCCAGCTCGAG，依次是NheI、PacI、BamHI、EcoRI、AgeI、EcoRV和XhoI。为验证本发明的DNA序列及其载体对circRNA的表达效果，我们从CircBase数据库（http://www.circbase.org/）下载了hsa_circ_0001730的线性序列信息，设计引物从人cDNA模板中调取hsa_circ_0001730的线性序列，通过KpnI和XbaI位点将该序列插入到了pcDNA-circRNA载体中，得到pcDNA-circRNA1730过表达质粒。转染293细胞后经QPCR验证，跟对照空载体相比，转染pcDNA-circRNA1730质粒组，hsa_circ_0001730的表达水平上升300多倍。进一步用这个载体过表达一系列的circRNA（hsa_circ_0000268、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001756、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000711等），结果显示这些circRNA的表达水平均上调百倍以上，表明本发明能稳定、高效的表达circRNA，操作简单易行，具体结果见附图2和附图3。具体的如下具体实施例。实施例一：pcDNA-circRNA1730过表达质粒构建1、引物设计：从CircBase数据库下载hsa_circ_0001730环状RNA的线性序列：>hsa_circ_0001730|NM_004444|EPHB4GTACTAAGGTCTACATCGACCCCTTCACTTATGAAGACCCTAATGAGGCTGTGAGGGAATTTGCAAAAGAGATCGATGTCTCCTACGTCAAGATTGAAGAGGTGATTGGTGCAGGTGAGTTTGGCGAGGTGTGCCGGGGGCGGCTCAAGGCCCCAGGGAAGAAGGAGAGCTGTGTGGCAATCAAGACCCTGAAGGGTGGCTACACGGAGCGGCAGCGGCGTGAGTTTCTGAGCGAGGCCTCCATCATGGGCCAGTTCGAGCACCCCAATATCATCCGCCTGGAGGGCGTGGTCACCAACAGCATGCCCGTCATGATTCTCACAGAGTTCATGGAGAACGGCGCCCTGGACTCCTTCCTGCGG用Primer5软件进行引物设计：circRNA1730-F：5'GGGGTACCGTACTAAGGTCTACATCGACCCCTT3'circRNA1730-R：5'GCTCTAGACCGCAGGAAGGAGTCCAG3'引物序列由上海捷瑞公司进行合成。2、PCR钓取基因：PCR反应体系，总计50ul：2mMdNTP5ul10×KODbuffer5ulMgSO42ulDMSO2.5ul引物F（10uM）1.5ul引物R（10uM）1.5ulHumancDNA0.5ulKODplus1ulddH2O32ulPCR扩增条件：3.PCR产物回收1)PCR产物经电泳后，在紫外条件下，手术刀切取含目的片段的凝胶条带至干净1.5mlEP管中，按100mg凝胶对应100ul溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。2)55℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12000g离心1min，弃滤液。4)向柱上加入500ul溶液PE，室温12000g离心1min，弃滤液。5)重复上一操作一次。6)空柱12000g离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。7)将柱子置于新的1.5mlEP管上，向柱中央加入30µl洗脱液，12000g离心1min以洗脱出DNA。4.PCR回收产物取10ul用KpnI和XbaI双切：在1个无菌的1.5mlEP管中分别配制双酶切体系，总计50μl：ddH2O28ul10×BSA5ul10×NEBuffer45ulPCR回收产物10ulKpnI酶1ulXbaI酶1ul37℃酶切2h5.酶产物回收（DNA凝胶回收试剂盒）1)PCR产物经电泳后，在紫外条件下，手术刀切取含目的片段的凝胶条带至干净1.5mlEP管中，按100mg凝胶对应100ul溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。2)55℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12000g离心1min，弃滤液。4)向柱上加入500ul溶液PE，室温12000g离心1min，弃滤液。5)重复上一操作一次。6)空柱12000g离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。7)将柱子置于新的1.5mlEP管上，向柱中央加入30µl洗脱液，12000g离心1min以洗脱出DNA。6.双酶切pcDNA-circRNA载体；1）酶切体系如下在1个无菌的1.5mlEP管中分别配制双酶切体系，总计50μl：ddH2O36ul10×BSA5ul10×NEBuffer45ulpcDNA-circRNA载体2ulKpnI酶1ulXbaI酶1ul37℃酶切2h7.载体酶切产物回收，（DNA凝胶回收试剂盒）1）向酶切管中加入100ul溶液BD；2）将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12000g离心1min，弃滤液；3）向柱上加入500ul溶液PE，室温12000g离心1min，弃滤液；4）重复上一操作一次；5）空柱12000g离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体；6）将柱子置于新的1.5mlEP管上，向柱中央加入30µl洗脱液，12000g离心1min以洗脱出DNA。8.目的片段与载体连接：向0.2mlEP管中加入以下试剂（T4DNALigase酶购于NEB公司），总计20μlddH2O4ul酶切回收的PCR产物10ul酶切回收的pcDNA-circRNA载体3ul10×LigaseBuffer2ulT4DNALigase1ul室温连接1h。同时做阴性对照，以水代替基因与载体连接；9.连接产物的转化1)冰浴中将连接产物分别加入至50μlTran5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min。2)42℃水浴热休克90s。3)快速将管转移至冰浴中，冰浴2min。4)分别加入500μlLB培养基，混匀，37℃、150g振荡培养40min。5)将150ul菌液涂布于含氨苄青霉素（Amp）（100μg/ml）的LB平板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。10.菌落PCR鉴定阳性克隆；1)从平板上面各接7个菌落于20ulddH2O中混匀打散菌落；2)PCR鉴定所挑取菌落；PCR体系如下，总计20μl：ddH2O12.75ul10×TaqBuffer2ul2mMdNTP2ul引物ADAMTS5-F2（10uM）1ul引物ADAMTS5-R2（10uM）1ulTaq酶0.25ul菌液1ul同时，以空载体作为模板设置一组PCR作为阴性对照。PCR条件：PCR产物以含溴化乙锭（EB）的1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。11.对鉴定正确的菌落溶液进行扩增培养，加入含有相应抗生素的3mlLB培养液中37℃过夜培养，提取其质粒，（高纯质粒小量提取试剂盒）1)用1.5mlEP管收集1ml菌液，12000g离心1min，去上清。2)加入250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，重悬菌体。3)加入250μl溶液Ⅱ，温和反复颠倒混匀6次，室温放置2min。4)加入350μl溶液Ⅲ，温和反复颠倒混匀6次。5)12000g离心10min，小心吸去上清至DNA纯化柱中，静置2min。6)12000g离心1min，弃滤液。7)加入500ul溶液PB至柱中,12000g离心1min，弃滤液。8)加入500ul溶液W至柱中,12000g离心1min，弃滤液。重复一次。9)空柱12000g离心3min。10)将柱取出置于新的1.5mlEP管中，加入50μl无菌水（60℃预热），静置2min，12000g离心1min，收集管底质粒。将质粒送测序公司测序。类似的，用同样的方法可以构建pLL-circRNA1730质粒，或者其他pcDNA-circRNA表达质粒。实施例二：pLL-circRNA1730慢病毒及其稳定细胞系构建1.慢病毒包装1)转染前24h，用胰酶消化对数生长期的293T细胞，传代到10cm细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。2)转染前将细胞培养基更换为无血清培养基。3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pLL-circRNA1730载体10μg，pGag/Pol载体5μg、pRev载体5μg、pVSV-G载体5μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为1.5ml。4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取60μlLipofectamine2000试剂在另一管中与1.5mlOpti-MEM混合，在室温下温育5分钟。5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。8)培养6小时后吸去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基10ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。2.病毒的收获及浓缩1)收集转染后48小时和72小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。3)以0.45μm滤器过滤上清液于50ml离心管中。4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19ml），盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。5)组合好后，做好平衡，放在转头上。6)在5000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。7)离心结束后，过滤杯中的即为病毒浓缩液。8)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，可在4℃保存一周，或-80℃长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。3.慢病毒感染细胞：(1).根据细胞的量将细胞在1.5ml管中离心收集然后用100-200ul的无血清培养液稀释细胞沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准。(2).吸取pLL-circRNA1730病毒液加入细胞中，将1.5ml管放在37℃度培养箱中孵育30分钟。另取pLL-circRNA空载体对照病毒感染做对照细胞系。(3).将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里。(4).加入足够量的新鲜培养液。(5).12小时后换液。(6).48小时后加入2ug/mlpuromycin进行稳定细胞株筛选。实施例三：QPCR检测1.RNA提取1)细胞处理：6孔板每孔加入1mlTrizol，用1ml枪头反复吹打10次，收集到EP管内；离心15分钟，12000g，取上清。2)向上清中加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。3)4℃，12000g离心15分钟，此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA,脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。4)取上清500ul到新的EP管内，167ul吸三次；加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟。5)小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1ml75%乙醇,上下颠倒，使沉淀块重悬起。6)4℃，12000g离心10分钟,小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。晾干约15分钟，至管壁无液体。7)加入适量体积（20-30ul）的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。8)取出2ul定量，测量buffer:10mMTrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆转录。（1A260=40µg/ml,A260/A280=1.8~2.1）9)逆转录2.cDNA逆转录1）实验体系M-MLVReverseTranscriptase：RNA2μgPrimerMix1μlRNase-freewater至15μl70℃5min冰上5min5×buffer5μl2mMdNTP6.25μlM-MLV1μlRNase-freewater12.75μl25μl42℃60min3.QPCR扩增实验1)实验体系，总计20μl：GoTaq®qPCRMasterMix10μlFprimer1μlRprimer1μlcDNA模板1.5μlNuclease-FreeWater6.5μl2)反应条件：第一步：95℃2min第二步（40个循环）：95℃3秒，60℃30秒第三步60–95°C溶解曲线3)上机进行目标基因扩增4.qPCR相对定量结果目标基因的相对表达量计算公式为：2-△△Ct=2-【（△Ct）Test-（△Ct）Control】。Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值。△Ct=Ct目的-Ct管家，表示各样本目的基因相对管家基因的相对Ct值，△△Ct=（△Ct）Test-（△Ct）Control，表示处理组相对对照组进行归一化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案所作的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围之内。