技术领域本发明涉及一种分离纯化β-乳球蛋白的方法，具体的讲是涉及一种可循环式规模化分离β-乳球蛋白的方法。
背景技术：
β-乳球蛋白存在于牛和其他反刍类动物乳中，是乳清中的主要蛋白质，也是乳制品引起婴幼儿过敏反应的主要物质。然而，随着新工艺和加工方法的发展，β-乳球蛋白及其肽段的生物学功能和良好的食品加工特性被逐渐开发出来。例如，β-乳球蛋白特殊的蛋白质空间结构可以包埋脂溶性维生素、多不饱和脂肪酸、黄酮类物质，并保护这些物质在胃肠道消化系统中的稳定性；β-乳球蛋白水解肽具有抗菌、抗氧化的功能；在乳制品、肉制品和面包生产的食品加工方面，β-乳球蛋白还体现出优良的凝胶性、持水性、乳化性和起泡性。分离纯化β-乳球蛋白对于科学研究和功能食品的产业化有一定的意义。现有技术对β-乳球蛋白的分离已经公开的一些技术方案，但均不能进行可循环式规模化分离。如现有分离技术CN201410534492.2的中国专利公开了α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白的制备方法和产品，乳清通过孔径为100kDa和30kDa的膜进行超滤，调节pH至3.5~5.0，得到β-乳球蛋白粉纯度大于70%。该方法虽然简单，但并未去除乳清中非蛋白物质，得到的β-乳球蛋白粉纯度低；由于β-乳球蛋白分子量为18.4kDa、α-乳白蛋白分子量为14.2kDa，两种蛋白分子量相近，采用膜分离法对膜的要求十分高；此外，该方法在pH至3.5~5.0下进行，而β-乳球蛋白粉的等电点PI为5.1~5.3，很容易发生变性沉淀，膜过滤效率低，无法实现高纯度、可循环规模化分离。现有分离技术CN201210231797.7的中国专利公开了从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法，采用反复盐析、超滤得到的高纯度β-乳球蛋白(纯度为85.2%)；现有分离技术CN20140154517.6的中国专利公开了从脱盐乳清粉中分离β-乳球蛋白，通过盐析、超滤、离子交换层析、凝胶层析的步骤得到高纯度β-乳球蛋白(没有给出纯度)；这两种方法虽然得到了较高纯度的β-乳球蛋白，但步骤繁琐，样品处理量小，适合实验室内操作。现有分离技术CN200910161153.3的中国专利公开了乳清蛋白的分离和测定方法，用1.7μm亚乙基桥杂化(BEH)颗粒为填料的超高效液相色谱色谱柱将牛乳中的β-乳球蛋白a和b完全分离，该方法分离速度快，但样品处理量为0.02g，适用于乳球蛋白的分析检测。双水相萃取技术是将水溶液两相分配，通过热力学效应可将不同熵、焓的生物物质分离开来，该萃取体系具有条件温和、质量传输快、成本低、易操作，可调节、容易放大，可连续操作等特点。专利号CN201310460499.X的中国专利公开了一种PEG/磷酸盐双水相分离乳源乳清蛋白的方法，该方法使用了PEG/磷酸盐双水相体系，将α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别分离到上相PEG溶液和下相磷酸盐溶液中，并对上下相的蛋白质组成进行了SDS-PAGE电泳分析。但这种方法只是单纯的将乳清中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分开至不同相，并没有回收β-乳球蛋白方法，也没有提供分离得到的β-乳球蛋白的纯度，样品处理量小，不能进行循环规模化分离。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可循环式规模化分离乳球蛋白的方法，既能够处理大量样品，又能够将分离体系循环使用；分离回收的β-乳球蛋白纯度高。本发明采用聚乙烯比咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)/柠檬酸钠形成的双水相体系，经过相分离后，β-乳球蛋白存在于下相柠檬酸钠溶液中，经过膜滤出后的柠檬酸钠溶液仍给加入原双水相体系循环使用；此外，PVP是一种合成的水溶性高分子化合物，具有很好的溶解性和生理相容性，毒性很低，可应用于医药、食品、化妆品中；因此，本发明采用的分离方法既环保又高效。本发明所采用的技术方案如下：一种可循环式规模化分离β-乳球蛋白的方法，包括1)样品预处理、2)双水相萃取、3)过滤、4)干燥截留液、5)滤出液循环使用五个步骤，其特征在于：1)样品预处理：对荷斯坦牛乳、水牛乳或者商业乳清粉中的一种进行预处理，获得乳清液，其蛋白质含量为5%~50%。2)双水相萃取：将步骤1）所得乳清液按照体积比1:20~1:250加入由聚乙烯比咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)和柠檬酸钠形成的双水相体系，混匀、离心至上下相分离；所述双水相体系中PVP质量为体系总质量的9~21%，柠檬酸钠质量为体系总质量的15~25%，控制pH在5.2~8.2；所述混匀是指搅拌转数为50~70rpm，搅拌时间20~40min；所述离心是指转数为2500~3500rpm，离心时间为10~30min，离心温度为4~37℃。所述上下相分离的上相是指含有部分乳清蛋白的聚乙烯比咯烷酮溶液，下相是指含有大量β-乳球蛋白的柠檬酸钠溶液；3)过滤：取出步骤2）中含有β-乳球蛋白的柠檬酸钠下相溶液，经1~10kDa膜过滤，膜过滤温度为4~37℃，控制压力≤0.2MPa，获得截留液和滤出液；所述截留液是指截留的含有大量β-乳球蛋白的水溶液；所述滤出液是指滤出的柠檬酸钠溶液；4)干燥截留液：收集步骤3）中截留的含有大量β-乳球蛋白水溶液，经喷雾干燥或冷冻干燥中的一种获得β-乳球蛋白。5)过滤液循环使用：将步骤3）所得的柠檬酸钠滤出液可用于加入步骤3）的双水相体系，可循环应用于β-乳球蛋白的分离。进一步的，所述1)样品预处理是指荷斯坦牛乳、水牛乳中的一种经巴氏杀菌、脱脂后，调pH至酪蛋白等电点沉淀、离心，收集上层乳清液，经1~6kDa膜过滤，截留液经减压浓缩至蛋白浓度为5%~50%；所述商业乳清粉预处理是指纯度为80~90的商业乳清粉(WPI80~90)加水溶解，商业乳清粉质量占溶液总质量的5%~50%。进一步的，所述2)双水相萃取中，PVP为PVP3500，PVP4000，PVP5000中的一种。进一步的，所述3)过滤中，膜的材质为聚偏氟乙二烯、醋酸纤维酯膜、再生纤维素膜或陶瓷膜中的一种。进一步的，所述4)干燥截留液步骤中，经喷雾干燥所获得β-乳球蛋白可应用于功能食品的产业化加工；经冷冻干燥步骤所获得β-乳球蛋白为活性蛋白，可用于科学研究。进一步的，所述5)过滤液循环使用步骤中，将柠檬酸钠滤出液调至一定浓度是指将滤出液的浓度调至与原双水相系统中的柠檬酸钠比重一致。本发明的有益效果是：1.本发明不受原料来源的限制，可以是荷斯坦牛乳、水牛乳，也可以是商业乳清粉，且样品处理量大，增加了β-乳球蛋白的资源。2.本发明中的双水相体系采用了环保材料PVP和柠檬酸钠，进行β-乳球蛋白分离后仍可循环使用，大大降低了分离成本。3.本发明的分离方法采用的pH条件温和，温度可控，分离回收的β-乳球蛋白纯度高。由于较高的温度和低pH会导致蛋白质的变性，本发明根据不同的分离温度，在冻干条件下可得到适用于科研的生物活性β-乳球蛋白，在喷雾干燥条件下可得适用于食品加工的功能性β-乳球蛋白。4.本发明提供的可循环式规模化分离乳球蛋白的方法包括样品预处理、双水相萃取、过滤、截留液干燥、滤出液循环使用五个步骤，操作过程简单，能够实现大规模、低成本的工业化生产。本发明采用的原料做如下说明：所述聚乙烯比咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)，所述商业乳清粉预处理是指纯度为80~90的商业乳清粉(WPI80~90)。附图说明图1是PVP/3000/柠檬酸钠相图图2是SDS-PAGE电泳检测β-乳球蛋白的双水相分离效果图其中，Marker是已知分子量标准蛋白质，分子量范围在14.4kDa~97kDa；α-la表示乳清中α-乳白蛋白；β-lg表示乳清中β-乳球蛋白。图3-图5为β-乳球蛋白高效液相色谱图其中图3为β-乳球蛋白标准品高效液相色谱图，图4为乳清蛋白高效液相色谱图，图5为分离出的β-乳球蛋白高效液相色谱图。图6为以高效液相色谱建立的β-乳球蛋白的标准曲线，标准曲线回归方程为：。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例1一种可循环式规模化分离β-乳球蛋白的方法，以处理50L荷斯坦牛乳牛乳，生产科研用β-乳球蛋白为例；依次进行如下步骤：1)样品预处理：50L荷斯坦牛乳以乳脂分离机脱脂，制备得到脱脂牛乳，其脂肪含量≤0.5wt%；脱脂牛乳调pH至4.6~4.7，于60℃热处理30min，取上清液脱盐，于30~50℃低温浓缩得乳清液15L，其乳清蛋白含量为20wt%；2)双水相萃取：将步骤1）所得乳清液按照体积比1:100加入聚乙烯比咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)/柠檬酸钠形成的双水相体系，混匀、离心至上下相分离；关于双水相体系，控制PVP和柠檬酸钠的质量分数在PVP/柠檬酸钠相图（图1）曲线的上方，使其中PVP质量为系统总质量的12%，柠檬酸钠质量为系统总质量的18%，两相体积比为1，控制pH在7.0；乳清液加入上述双水相体系，经搅拌转数为60rpm，搅拌时间30min混匀后，于4℃、3500r/min离心20min；3）β-乳球蛋白的分离效果：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测乳清中β-乳球蛋白在双水相体系的分离。电泳条件：5%浓缩胶，14%分离胶，上样量10μL，上样顺序为蛋白质标准分子量Marker、α-乳白蛋白标准品、β-乳球蛋白标准品、乳清、上相溶液、下相溶液。β-乳球蛋白分子量为18.2kDa。经过检测，发现β-乳球蛋白很好的分离至双水相体系的下相，即柠檬酸钠相（图2）4)过滤：从双水相萃取罐的下方取出步骤2）中含有β-乳球蛋白的柠檬酸钠下相溶液，经10kDa膜过滤，膜过滤温度为4℃，控制压力≤0.2MPa；5)干燥截留液：收集步骤3）中膜过滤截留下来的含有大量β-乳球蛋白水溶液，经-45℃冷冻干燥获得科研用具有活性的β-乳球蛋白冻干粉(β-乳球蛋白纯度≥95wt%)；6）β-乳球蛋白的测定采用高效液相色谱法对乳清及β-乳球蛋白冻干粉中的β-乳球蛋白含量进行测定，具体测定条件为：色谱柱：ZORBAX300SB-C18色谱柱，4.6×250mm流动相：相A：体积浓度0.1%TFA超纯水溶液相B：体积浓度0.1%TFA乙腈梯度洗脱：0-35min30%-50%相B35-40min50%-30%相B流速：1mL/min检测波长：215nm柱温：30℃进样量：10μL将商业β-乳球蛋白标准品、步骤1）所得的乳清蛋白浓缩液、步骤5）所得的β-乳球蛋白冻干粉分别配制成终浓度为1mg/mL，取10μL进行上述高效液相色谱法检测β-乳球蛋白，结果如图2所示。将β-乳球蛋白商业购买标准品分别配制浓度为：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL，得到乳球蛋白浓度和高效液相色谱峰面积呈线性关系，如图3所示。该标准曲线线性回归方程为：根据回归方程计算步骤1）所得的乳清蛋白浓缩液中β-乳球蛋白的浓度为48.9%，步骤5）所得的β-乳球蛋白冻干粉中β-乳球蛋白的浓度为98.2%。利用高效液相色谱法测定双水相体系中β-乳球蛋白的浓度，按照公式（3）计算回收率Y：（1）r=V上/V下（1）（2）K=C上/C下（2）（3）Y=1/(1+r×K)×100%（3）式中：r为相比；V上和V下为上下相的体积(L)；C上和C下为上下相中目标分离物的质量浓度(mg/mL)；K为分配系数。当r=1时，计算的β-乳球蛋白在柠檬酸钠相的回收率为98.2%；7)过滤液循环使用：将步骤3）所得的柠檬酸钠滤出液按照上下相比为1，调至终浓度18%，加入步骤2）的双水相体系，可循环应用于β-乳球蛋白的分离。因此，每50L荷斯坦牛乳最终可得到150gβ-乳球蛋白冻干粉，纯度为98.2%。实施例2以处理500L荷斯坦牛乳，生产食品加工用β-乳球蛋白为例；依次进行如下步骤：1)样品预处理：500L荷斯坦牛乳以乳脂分离机脱脂，制备得到脱脂牛乳，其脂肪含量≤0.5wt%；脱脂牛乳调pH至4.6~4.7，于60℃热处理30min，取上清液脱盐，于30~50℃低温浓缩得乳清液，其乳清蛋白含量为5wt%；2)双水相萃取：将步骤1）所得乳清液按照体积比1:25加入聚乙烯比咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)/柠檬酸钠形成的双水相体系，混匀、离心至上下相分离；其中，双水相体系中PVP质量为系统总质量的15%，柠檬酸钠质量为系统总质量的22%，控制pH在7.6；乳清液加入上述双水相体系，经搅拌转数为60rpm，搅拌时间30min混匀后，于4℃、3500r/min离心20min；3)过滤：从双水相萃取罐的下方取出步骤2）中含有β-乳球蛋白的柠檬酸钠下相溶液，经10kDa膜过滤，膜过滤温度为4℃，控制压力≤0.2MPa；4)干燥截留液：收集步骤3）中膜过滤截留下来的含有大量β-乳球蛋白水溶液，经喷雾干燥获得食品加工用β-乳球蛋白；5)过滤液循环使用：将步骤3）所得的柠檬酸钠滤出液调至终浓度22%，加入步骤2）的双水相体系，可循环应用于β-乳球蛋白的分离；每500L荷斯坦牛乳最终可得到700gβ-乳球蛋白粉，纯度为95.3%。实施例3处理50L水牛乳，将步骤1）中的荷斯坦牛乳替换为水牛乳，其余等同于实施例1。每50L水牛乳最终可得到197gβ-乳球蛋白粉，纯度为97%。实施例4处理50kg商业乳清粉，取消步骤1），将商业乳清粉配制终浓度为20wt%，其余等同于实施例1。每50kg商业乳清粉最终可得18.2kgβ-乳球蛋白粉，纯度为98%。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。