技术领域本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用基因对植物进行种属鉴定的方法。
背景技术：
DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，从而实现对物种的快速自动鉴定。将核酸序列数据用于探讨植物系统发育问题现已发展成为植物系统学中的一个重要分支领域。自2005年开展植物DNA条形码研究以来，国内外学者围绕植物DNA条形码的筛选,在不同类群中对各个DNA候选片段进行适用性评价,最终正式提议rbcL+matK作为陆生植物标准。rbcL是编码1,5二磷酸核酮糖羧化酶大亚基的基因，此酶在Calvin-Benson循环中固定二氧化碳，且在C3植物的光呼吸过程中起作用，其进化速度趋于保守，能将未知植物鉴定到科、属水平。matK基因位于叶绿体赖氨酸tRNA基因高度保守的2个外显子之间的内含子中，为单拷贝编码基因，编码参与RNA转录本II型内含子剪切的成熟酶。是叶绿体基因组编码蛋白基因中，进化较快的基因之一，进化速率快于rbcL，能将未知植物鉴定到属、种水平。叶绿体基因组中的rbcL基因序列是分子系统学研究中使用最为广泛的分子指标之一。它在用于此目的的研究时具有一些独特的优点：以单拷贝形式存在，不发生基因转变；长达1.4kb；能提供较多的分子性状；进化速率比较适于研究高等级类元间的系统关系。植物种属鉴定的基本原理是基于植物cpDNA中的保守序列rbcL和matK的PCR扩增和测序，将测序结果与公共数据库中的已知序列进行比较后，判定动物种类，讲未知物种划分到属或种。并且，在PCR扩增中，引物设计的合理与否将直接影响到鉴定时间长短、准确度等。现有技术大多使用形态学进行鉴定，如八角属约有60种，其中只有一种叫八角茴香没有毒，它的成熟果实为调味香料。另外的种尤其是莽草这个种，果实则有剧毒。如果用形态学的方法鉴定，极其容易弄混，导致严重的后果。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种利用基因对植物进行种属鉴定的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明涉及一种利用基因对植物进行种属鉴定的方法，所述方法包括如下步骤：S1、待测植物样品基因组DNA提取；S2、以待测植物样品基因组DNA为模板，用针对rbcL基因序列设计的引物和/或针对matK基因序列设计的引物进行PCR扩增；S3、回收PCR扩增产物，获得目的DNA；S4、利用基于Sanger双脱氧链终止法对所述目的DNA进行测序；将测序结果与公共数据库中的序列进行比对，根据同源性将待测植物鉴定到属或种。优选的，步骤S2中，所述针对rbcL基因序列设计的引物包括如SEQIDNO.1所示的正向引物和如SEQIDNO.2所示的反向引物。优选的，步骤S2中，所述针对matK基因序列设计的引物包括如SEQIDNO.3所示的正向引物和如SEQIDNO.4所示的反向引物。优选的，步骤S2中，所述PCR扩增中，每50.0ul扩增反应体系包括：基因组DNA1.0ul，含2.5mMMg2+的10×Buffer5.0ul，5u/μL的Taq聚合酶1.0ul，10mM的dNTP1.0ul，10uM的正向引物1.5ul，10uM的反向引物1.5ul，ddH2O39.0ul。优选的，步骤S2中，所述PCR扩增中，PCR反应参数为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，45s；延伸72℃，1min30s；终延伸72℃，7m；循环数45。优选的，步骤S3中，所述回收是用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行回收。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1)从分子水平鉴定植物的种属，比从形态学鉴定更加准确；2)对植物形态的完整性没有太多的要求，只要有植物本身少许的组织即可提取DNA，并进行本发明的鉴定；3)本发明通过对引物设计的合理设计，缩短了鉴定时间，显著提高了鉴定的准确度。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例本实施例涉及一种利用基因对植物进行种属鉴定的方法；具体包括如下步骤：一、基因组提取1、称取200mg新鲜植物组织(如选用的是冷冻干燥的组织，则组织用量减半)。剪成小块放入研钵中；加入液氮，使组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止组织融化，研磨充分后将研钵放入56℃水浴至样品粉末刚开始融化；2、加入350μlPBS和0.9μlRNaseA贮存液，用力碾磨30s；3、转移350μl研磨好的匀浆至2ml离心管中，如匀浆体积不足350μl，补充PBS至350μl；4、加入150μl缓冲液C-L和20μl蛋白酶K；立即漩涡振荡1min混合均匀，短暂离心后，将离心管置于56℃水浴10min；5、加入350μl缓冲液P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12,000×g离心10min；6、将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤5中的混合液移至制备管中，12,000×g离心1min；7、弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500μl缓冲液W1，12,000×g离心1min；8、弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μl缓冲液W2，12,000×g离心1min；以同样的方法，用700μlBufferW2(缓冲液W2)再洗涤一次；9、弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，12,000×g离心1min；10、将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100-200μl去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱DNA。以上缓冲液C-L、缓冲液P-D、缓冲液W1、缓冲液W2分别为购买的试剂盒(美国Axygen生物科技有限公司的Axygen动植物基因组DNA制备试剂盒AP-MN-MS-GDNA-50)里的缓冲液C-L、缓冲液P-D、缓冲液W1、缓冲液W2。二、引物设计与合成用针对rbcL基因序列设计的引物或针对matK基因序列设计的引物进行PCR扩增。并由上海派森诺生物科技有限公司合成，具体如下。rbcL序列两端的通用引物序列如下：rbcL_1F:TCACAAGCAGCAGCTAGTTC(SEQIDNO.1)rbcL_1R:ATGTCACCAAAAACAGAGACT(SEQIDNO.2)matK序列两端的通用引物序列如下：MatK_XF：TAATTTACGATCAATTCATTC(SEQIDNO.3)MatK_5R：TTATGTTTACGAGCCAAAG(SEQIDNO.4)三、PCR扩增3.1PCR扩增反应体系在0.2ml离心管中加入以下成分：基因组DNA1.0ul10×Buffer(含2.5mMMg2+)5.0ulTaq聚合酶(5u/μL)1.0uldNTP(10mM)1.0ul正向引物(10uM)1.5ul反向引物(10uM)1.5ulddH2O39.0ul总体积50.0ul轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底,在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下：反应完成后，取3ulPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。3.2PCR产物的回收PCR产物用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：3.2.1在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取重量；3.2.2加入3个凝胶体积的缓冲液DE-A，混合均匀后于75℃加热直至凝胶块完全熔化；3.2.3加0.5个BufferDE-A体积的缓冲液DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇；3.2.4将混合液，转移到DNA制备管12,000×g离心1min，弃滤液；3.2.5将制备管置回2ml离心管，加500μlBufferW1(缓冲液W1)，12,000×g离心30s，弃滤液；3.2.6将制备管置回2ml离心管，加700μlBufferW2(缓冲液W2)，12,000×g离心30s，弃滤液，以同样的方法再用700μlBufferW2(缓冲液W2)，12,000×g离心1min；3.2.7将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min；3.2.8将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。以上缓冲液DE-A、缓冲液DE-B、缓冲液W1、缓冲液W2分别为购买的试剂盒(美国Axygen生物科技有限公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，型号为AP-GX-250G)里的缓冲液DE-A、缓冲液DE-B、缓冲液W1、缓冲液W2。四、一代测序利用基于Sanger双脱氧链终止法的技术进行一代测序，所用测序仪为ABI3730xl。五、结果比对与分析将测序结果与公共数据库中的序列进行比对，根据同源性将待测植物鉴定到属或种。具体应用如下：1)待测物种1的matK序列如SEQIDNO.5所示：用NCBIBlast程序将以上序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测植物序列相似性最大为100％的植株物种信息，为Stephanandrachinensis(华空木)2)待测物种2的rbcL序列如SEQIDNO.6所示：用NCBIBlast程序将以上序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测植物序列相似性最大为100％的植株物种信息，为Dioscoreabulbifera(黄药子)。