一套适于大白菜品种核酸指纹数据库构建的核心SNP标记及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一套适于大白菜品种核酸指纹数据库构建的核心SNP标记及其应用。

背景技术：

我国是世界蔬菜生产和消费第一大国，2014年蔬菜播种面积达3.6亿亩，总产量8.4亿吨，产值超过1.3万亿元，已超过粮食作物成为我国的第一大种植业。而大白菜(Brassica rapa L.ssp.Pekinensis)是我国栽培面积最大的蔬菜作物，在我国菜篮子工程中的作用举足轻重。同时由于白菜为杂交作物、重组率高、遗传多样性丰富、以及较好的基因组学研究基础而成为遗传学研究的模式植物。

随着我国育种工作的快速发展，通过国家和各省审定的品种剧增，尤其是如白菜这种较大蔬菜作物，每年新推出的品种数以百计，而在众多的品种中还存在一系列近似品种，大量存在“同种多名、同名多种”的问题，导致我国蔬菜种子市场“多乱杂”，市场监管和品种保护非常困难。另一方面，由于种质资源日趋狭窄，少数骨干亲本被集中应用，在原品种基础上仅改良少数甚至单个性状的依赖性派生品种增多，品种间的遗传差异越来越小，如何有效地管理和甄别数量庞大的白菜品种成为品种管理的难题。造成这些问题的主要原因是我国缺乏高水准的育种和种检技术体系，而国外育种公司、国际种子联盟ISF等均建立了功能强大的蔬菜品种核酸指纹鉴定技术，能够准确迅速进行品种创制与鉴定，为种子质量监控和知识产权保护提供了有力武器。因此，我国亟需建立开展白菜及其它蔬菜种子DNA指纹鉴定，规范蔬菜种子市场秩序，强化知识产权保护。

鉴于此，从DNA水平对我国白菜品种进行管理，对快速、准确的查处不真实品种行为具有重要意义。近年来，蔬菜作物的高通量基因组测序和基因分型科技发展迅速。2011年，白菜基因组测序完成，继而完成了多份白菜作物核心种质的重测序工作，建立了白菜遗传变异的大数据，为开发覆盖全基因组的SSR、InDel和SNP等特异分子标记奠定了重要基础。与此同时，高通量基因分型技术也得到了快速发展，我国多个企业机构引进了高通量基因分型的技术和平台，为开展多位点、多样品的分子检测工作提供了重要支撑。

SNP(single nucleotide polymorphism)是由单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，作为第三代分子标记，与其它标记技术相比具有无可比拟的优势，因此在品种分子检测方面被推荐为更新换代的标记。与此同时，高通量基因分型技术也得到了快速发展，为开展多位点、多样品的分子检测工作提供了重要支撑。与传统的SSR核酸指纹分析技术相比，SNP标记有诸多优势：①遗传变异稳定；②适于高通量规模化筛选和易于准确基因分型；③在样品DNA的使用量上，仅需要ng级的DNA，而且适用于多个方法提取的DNA(包括NaOH法等快速提取方法)，可以实现全程高通量检测分型。

核心引物对遗传多样性分析、种质资源鉴定、品种纯度和真实性检测、指纹图谱构建等研究具有重要价值。但我国还没有利用SNP标记技术进行结球白菜DNA指纹数据库构建和品种鉴定的有关报道。本研究利用英国LGC(Laboratory of the Government Chemist，政府化学家实验室)有限公司的KASP技术，基于10个白菜核心资源的重测序，发掘了白菜全基因组的序列变异，筛选了一套适于大白菜品种核酸指纹数据库构建的96组SNP核心引物。利用96对SNP核心引物对329个结球白菜品种进行基因分型，获得了不同品种的SNP分型数据；利用GGT2.0对上述数据进行分析，形成了各个品种的SNP指纹代码；进而使用PowerMarkerV3.25和MEGA6.06软件对不同品种进行聚类分析，结果可以将这些品种完全分开。利用KASP技术，我们建立了结球白菜标准化、高通量、低成本的分子检测技术平台，提供的SNP位点和检测方法可实现高通量、低成本、标准化和稳定可靠品种真实性检测，实际操作过程还可获得实验数据的全程记录和清晰的可视化效果，从而为高效、准确的进行大白菜品种的真实性和特异性鉴定奠定了基础。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供大白菜基因组中的96个SNP位点或检测大白菜基因组中的96个SNP位点的物质的新用途。

本发明提供了大白菜基因组中的96个SNP位点或检测大白菜基因组中的96个SNP位点的物质在如下任一中的应用：

(1)大白菜品种进行基因分型；

(2)构建大白菜DNA指纹数据库；

(3)大白菜种质资源遗传多样性分析和/或进化分析和/或聚类分析；

(4)鉴别或辅助鉴别大白菜品种；

(5)检测任意两个大白菜的相似性；

所述96个SNP位点如下：

SNP位点1为A01染色体上的第1248141位核苷酸；

SNP位点2为A01染色体上的第4225329位核苷酸；

SNP位点3为A01染色体上的第7102966位核苷酸；

SNP位点4为A01染色体上的第9716212位核苷酸；

SNP位点5为A01染色体上的第14897192位核苷酸；

SNP位点6为A01染色体上的第16592150位核苷酸；

SNP位点7为A01染色体上的第18635734位核苷酸；

SNP位点8为A01染色体上的第22449302位核苷酸；

SNP位点9为A01染色体上的第24456539位核苷酸；

SNP位点10为A01染色体上的第26752589位核苷酸；

SNP位点11为A02染色体上的第751652位核苷酸；

SNP位点12为A02染色体上的第2421548位核苷酸；

SNP位点13为A02染色体上的第6035955位核苷酸；

SNP位点14为A02染色体上的第9423555位核苷酸；

SNP位点15为A02染色体上的第11181828位核苷酸；

SNP位点16为A02染色体上的第14862673位核苷酸；

SNP位点17为A02染色体上的第18425637位核苷酸；

SNP位点18为A02染色体上的第21426261位核苷酸；

SNP位点19为A02染色体上的第23096858位核苷酸；

SNP位点20为A02染色体上的第23181920位核苷酸；

SNP位点21为A02染色体上的第25360564位核苷酸；

SNP位点22为A03染色体上的第128271位核苷酸；

SNP位点23为A03染色体上的第3151130位核苷酸；

SNP位点24为A03染色体上的第4471683位核苷酸；

SNP位点25为A03染色体上的第7828461位核苷酸；

SNP位点26为A03染色体上的第12523505位核苷酸；

SNP位点27为A03染色体上的第15431305位核苷酸；

SNP位点28为A03染色体上的第18277222位核苷酸；

SNP位点29为A03染色体上的第21003111位核苷酸；

SNP位点30为A03染色体上的第23890389位核苷酸；

SNP位点31为A03染色体上的第26316567位核苷酸；

SNP位点32为A03染色体上的第30080620位核苷酸；

SNP位点33为A04染色体上的第1223515位核苷酸；

SNP位点34为A04染色体上的第6933634位核苷酸；

SNP位点35为A04染色体上的第8662680位核苷酸；

SNP位点36为A04染色体上的第9741929位核苷酸；

SNP位点37为A04染色体上的第11311194位核苷酸；

SNP位点38为A04染色体上的第12579896位核苷酸；

SNP位点39为A04染色体上的第13764622位核苷酸；

SNP位点40为A04染色体上的第14413900位核苷酸；

SNP位点41为A05染色体上的第487586位核苷酸；

SNP位点42为A05染色体上的第1283352位核苷酸；

SNP位点43为A05染色体上的第2835432位核苷酸；

SNP位点44为A05染色体上的第4379811位核苷酸；

SNP位点45为A05染色体上的第8088873位核苷酸；

SNP位点46为A05染色体上的第10705210位核苷酸；

SNP位点47为A05染色体上的第14960042位核苷酸；

SNP位点48为A05染色体上的第16182627位核苷酸；

SNP位点49为A05染色体上的第19009544位核苷酸；

SNP位点50为A05染色体上的第22962829位核苷酸；

SNP位点51为A06染色体上的第18887位核苷酸；

SNP位点52为A06染色体上的第6403261位核苷酸；

SNP位点53为A06染色体上的第13545093位核苷酸；

SNP位点54为A06染色体上的第14701558位核苷酸；

SNP位点55为A06染色体上的第16193195位核苷酸；

SNP位点56为A06染色体上的第18685199位核苷酸；

SNP位点57为A06染色体上的第21632076位核苷酸；

SNP位点58为A06染色体上的第23153503位核苷酸；

SNP位点59为A06染色体上的第24717886位核苷酸；

SNP位点60为A07染色体上的第246275位核苷酸；

SNP位点61为A07染色体上的第1028346位核苷酸；

SNP位点62为A07染色体上的第2970833位核苷酸；

SNP位点63为A07染色体上的第6101124位核苷酸；

SNP位点64为A07染色体上的第11498098位核苷酸；

SNP位点65为A07染色体上的第14523031位核苷酸；

SNP位点66为A07染色体上的第18060124位核苷酸；

SNP位点67为A07染色体上的第19894600位核苷酸；

SNP位点68为A07染色体上的第24460147位核苷酸；

SNP位点69为A08染色体上的第100717位核苷酸；

SNP位点70为A08染色体上的第2374634位核苷酸；

SNP位点71为A08染色体上的第8933259位核苷酸；

SNP位点72为A08染色体上的第10869244位核苷酸；

SNP位点73为A08染色体上的第15287418位核苷酸；

SNP位点74为A08染色体上的第16162051位核苷酸；

SNP位点75为A08染色体上的第17179902位核苷酸；

SNP位点76为A08染色体上的第20716882位核苷酸；

SNP位点77为A09染色体上的第583658位核苷酸；

SNP位点78为A09染色体上的第3817906位核苷酸；

SNP位点79为A09染色体上的第5122605位核苷酸；

SNP位点80为A09染色体上的第8876252位核苷酸；

SNP位点81为A09染色体上的第8877380位核苷酸；

SNP位点82为A09染色体上的第16265081位核苷酸；

SNP位点83为A09染色体上的第18332606位核苷酸；

SNP位点84为A09染色体上的第21636788位核苷酸；

SNP位点85为A09染色体上的第26520788位核苷酸；

SNP位点86为A09染色体上的第31873135位核苷酸；

SNP位点87为A09染色体上的第34559009位核苷酸；

SNP位点88为A09染色体上的第37238042位核苷酸；

SNP位点89为A10染色体上的第617354位核苷酸；

SNP位点90为A10染色体上的第5601251位核苷酸；

SNP位点91为A10染色体上的第6477381位核苷酸；

SNP位点92为A10染色体上的第8425118位核苷酸；

SNP位点93为A10染色体上的第12492205位核苷酸；

SNP位点94为A10染色体上的第13127812位核苷酸；

SNP位点95为A10染色体上的第13859895位核苷酸；

SNP位点96为A10染色体上的第15835648位核苷酸。

上述应用中，所述检测大白菜基因组中的96个SNP位点的物质为如下96组引物：

(1)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点1的引物组1，

所述引物组1由序列1所示的正向引物、序列2所示的正向引物和序列3所示的反向引物组成；

(2)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点2的引物组2，

所述引物组2由序列4所示的正向引物、序列5所示的正向引物和序列6所示的正向引物组成；

(3)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点3的引物组3，

所述引物组3由序列7所示的正向引物、序列8所示的正向引物和序列9所示的正向引物组成；

(4)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点4的引物组4，

所述引物组4由序列10所示的正向引物、序列11所示的正向引物和序列12所示的正向引物组成；

(5)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点5的引物组5，

所述引物组5由序列13所示的正向引物、序列14所示的正向引物和序列15所示的正向引物组成5；

(6)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点6的引物组6，

所述引物组6由序列16所示的正向引物、序列17所示的正向引物和序列18所示的正向引物组成；

(7)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点7的引物组7，

所述引物组7由序列19所示的正向引物、序列20所示的正向引物和序列21所示的正向引物组成；

(8)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点8的引物组8，

所述引物组8由序列22所示的正向引物、序列23所示的正向引物和序列24所示的正向引物组成；

(9)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点9的引物组9，

所述引物组9由序列25所示的正向引物、序列26所示的正向引物和序列27所示的正向引物组成；

(10)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点10的引物组10，

所述引物组10由序列28所示的正向引物、序列29所示的正向引物和序列30所示的正向引物组成；

(11)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点11的引物组11，

所述引物组2由序列31所示的正向引物、序列32所示的正向引物和序列33所示的反向引物组成；

(12)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点12的引物组12，

所述引物组12由序列34所示的正向引物、序列35所示的正向引物和序列36所示的反向引物组成；

(13)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点13的引物组13，

所述引物组13由序列37所示的正向引物、序列38所示的正向引物和序列39所示的反向引物组成；

(14)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点14的引物组14，

所述引物组14由序列40所示的正向引物、序列41所示的正向引物和序列42所示的反向引物组成；

(15)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点15的引物组15，

所述引物组15由序列43所示的正向引物、序列44所示的正向引物和序列45所示的反向引物组成；

(16)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点16的引物组16，

所述引物组16由序列46所示的正向引物、序列47所示的正向引物和序列48所示的反向引物组成；

(17)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点17的引物组17，

所述引物组17由序列49所示的正向引物、序列50所示的正向引物和序列51所示的反向引物组成；

(18)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点18的引物组18，

所述引物组18由序列52所示的正向引物、序列53所示的正向引物和序列54所示的反向引物组成；

(19)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点19的引物组19，

所述引物组19由序列55所示的正向引物、序列56所示的正向引物和序列57所示的反向引物组成；

(20)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点20的引物组20，

所述引物组20由序列58所示的正向引物、序列59所示的正向引物和序列60所示的反向引物组成；

(21)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点21的引物组21，

所述引物组21由序列61所示的正向引物、序列62所示的正向引物和序列63所示的正向引物组成；

(22)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点22的引物组22，

所述引物组22由序列64所示的正向引物、序列65所示的正向引物和序列66所示的反向引物组成；

(23)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点23的引物组23，

所述引物组23由序列67所示的正向引物、序列68所示的正向引物和序列69所示的反向引物组成；

(24)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点24的引物组24，

所述引物组24由序列70所示的正向引物、序列71所示的正向引物和序列72所示的反向引物组成；

(25)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点25的引物组25，

所述引物组25由序列73所示的正向引物、序列74所示的正向引物和序列75所示的反向引物组成；

(26)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点26的引物组26，

所述引物组26由序列76所示的正向引物、序列77所示的正向引物和序列78所示的反向引物组成；

(27)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点27的引物组27，

所述引物组27由序列79所示的正向引物、序列80所示的正向引物和序列81所示的反向引物组成；

(28)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点28的引物组28，

所述引物组28由序列82所示的正向引物、序列83所示的正向引物和序列84所示的反向引物组成；

(29)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点29的引物组29，

所述引物组29由序列85所示的正向引物、序列86所示的正向引物和序列87所示的反向引物组成；

(30)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点30的引物组30，

所述引物组30由序列88所示的正向引物、序列89所示的正向引物和序列90所示的反向引物组成；

(31)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点31的引物组31，

所述引物组31由序列91所示的正向引物、序列92所示的正向引物和序列93所示的反向引物组成；

(32)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点32的引物组32，

所述引物组32由序列94所示的正向引物、序列95所示的正向引物和序列96所示的正向引物组成；

(33)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点33的引物组33，

所述引物组33由序列97所示的正向引物、序列98所示的正向引物和序列99所示的反向引物组成；

(34)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点34的引物组34，

所述引物组34由序列100所示的正向引物、序列101所示的正向引物和序列102所示的反向引物组成；

(35)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点35的引物组35，

所述引物组35由序列103所示的正向引物、序列104所示的正向引物和序列105所示的反向引物组成；

(36)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点36的引物组36，

所述引物组36由序列106所示的正向引物、序列107所示的正向引物和序列108所示的反向引物组成；

(37)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点37的引物组37，

所述引物组37由序列109所示的正向引物、序列110所示的正向引物和序列111所示的反向引物组成；

(38)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点38的引物组38，

所述引物组2由序列112所示的正向引物、序列113所示的正向引物和序列114所示的反向引物组成；

(39)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点39的引物组39，

所述引物组39由序列115所示的正向引物、序列116所示的正向引物和序列117所示的反向引物组成；

(40)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点40的引物组40，

所述引物组40由序列118所示的正向引物、序列119所示的正向引物和序列120所示的反向引物组成；

(41)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点41的引物组41，

所述引物组41由序列121所示的正向引物、序列122所示的正向引物和序列123所示的反向引物组成；

(42)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点42的引物组42，

所述引物组42由序列124所示的正向引物、序列125所示的正向引物和序列126所示的反向引物组成；

(43)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点43的引物组43，

所述引物组43由序列127所示的正向引物、序列128所示的正向引物和序列129所示的正向引物组成；

(44)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点44的引物组44，

所述引物组44由序列130所示的正向引物、序列131所示的正向引物和序列132所示的反向引物组成；

(45)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点45的引物组45，

所述引物组45由序列133所示的正向引物、序列134所示的正向引物和序列135所示的反向引物组成；

(46)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点46的引物组46，

所述引物组46由序列136所示的正向引物、序列137所示的正向引物和序列138所示的反向引物组成；

(47)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点47的引物组47，

所述引物组47由序列139所示的正向引物、序列140所示的正向引物和序列141所示的反向引物组成；

(48)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点48的引物组48，

所述引物组48由序列142所示的正向引物、序列143所示的正向引物和序列144所示的反向引物组成；

(49)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点49的引物组49，

所述引物组49由序列145所示的正向引物、序列146所示的正向引物和序列147所示的反向引物组成；

(50)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点50的引物组50，

所述引物组50由序列148所示的正向引物、序列149所示的正向引物和序列150所示的反向引物组成；

(51)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点51的引物组51，

所述引物组51由序列151所示的正向引物、序列152所示的正向引物和序列153所示的反向引物组成；

(52)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点52的引物组52，

所述引物组52由序列154所示的正向引物、序列155所示的正向引物和序列156所示的反向引物组成；

(53)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点53的引物组53，

所述引物组53由序列157所示的正向引物、序列158所示的正向引物和序列159所示的反向引物组成；

(54)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点54的引物组54，

所述引物组54由序列160所示的正向引物、序列161所示的正向引物和序列162所示的反向引物组成；

(55)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点55的引物组55，

所述引物组55由序列163所示的正向引物、序列164所示的正向引物和序列165所示的反向引物组成；

(56)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点56的引物组56，

所述引物组56由序列166所示的正向引物、序列167所示的正向引物和序列168所示的反向引物组成；

(57)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点57的引物组57，

所述引物组57由序列169所示的正向引物、序列170所示的正向引物和序列171所示的反向引物组成；

(58)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点58的引物组58，

所述引物组58由序列172所示的正向引物、序列173所示的正向引物和序列174所示的反向引物组成；

(59)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点59的引物组59，

所述引物组59由序列175所示的正向引物、序列176所示的正向引物和序列177所示的反向引物组成；

(60)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点60的引物组60，

所述引物组60由序列178所示的正向引物、序列179所示的正向引物和序列180所示的反向引物组成；

(61)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点61的引物组61，

所述引物组61由序列181所示的正向引物、序列182所示的正向引物和序列183所示的反向引物组成；

(62)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点62的引物组62，

所述引物组62由序列184所示的正向引物、序列185所示的正向引物和序列186所示的反向引物组成；

(63)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点63的引物组63，

所述引物组63由序列187所示的正向引物、序列188所示的正向引物和序列189所示的反向引物组成；

(64)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点64的引物组64，

所述引物组64由序列190所示的正向引物、序列191所示的正向引物和序列192所示的反向引物组成；

(65)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点65的引物组65，

所述引物组65由序列193所示的正向引物、序列194所示的正向引物和序列195所示的反向引物组成；

(66)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点66的引物组66，

所述引物组66由序列196所示的正向引物、序列197所示的正向引物和序列198所示的反向引物组成；

(67)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点67的引物组67，

所述引物组67由序列199所示的正向引物、序列200所示的正向引物和序列201所示的反向引物组成；

(68)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点68的引物组68，

所述引物组68由序列202所示的正向引物、序列203所示的正向引物和序列204所示的反向引物组成；

(69)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点69的引物组69，

所述引物组69由序列205所示的正向引物、序列206所示的正向引物和序列207所示的反向引物组成；

(70)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点70的引物组70，

所述引物组70由序列208所示的正向引物、序列209所示的正向引物和序列210所示的反向引物组成；

(71)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点71的引物组71，

所述引物组71由序列211所示的正向引物、序列212所示的正向引物和序列213所示的反向引物组成；

(72)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点72的引物组72，

所述引物组72由序列214所示的正向引物、序列215所示的正向引物和序列216所示的反向引物组成；

(73)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点73的引物组73，

所述引物组73由序列217所示的正向引物、序列218所示的正向引物和序列219所示的反向引物组成；

(74)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点74的引物组74，

所述引物组74由序列220所示的正向引物、序列221所示的正向引物和序列222所示的反向引物组成；

(75)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点75的引物组75，

所述引物组75由序列223所示的正向引物、序列224所示的正向引物和序列225所示的反向引物组成；

(76)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点76的引物组76，

所述引物组76由序列226所示的正向引物、序列227所示的正向引物和序列228所示的反向引物组成；

(77)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点77的引物组77，

所述引物组77由序列229所示的正向引物、序列230所示的正向引物和序列231所示的反向引物组成；

(78)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点78的引物组78，

所述引物组78由序列232所示的正向引物、序列233所示的正向引物和序列234所示的反向引物组成；

(79)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点79的引物组79，

所述引物组79由序列235所示的正向引物、序列236所示的正向引物和序列237所示的反向引物组成；

(80)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点80的引物组80，

所述引物组80由序列238所示的正向引物、序列239所示的正向引物和序列240所示的反向引物组成；

(81)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点81的引物组81，

所述引物组81由序列241所示的正向引物、序列242所示的正向引物和序列243所示的反向引物组成；

(82)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点82的引物组82，

所述引物组82由序列244所示的正向引物、序列245所示的正向引物和序列246所示的反向引物组成；

(83)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点83的引物组83，

所述引物组83由序列247所示的正向引物、序列248所示的正向引物和序列249所示的反向引物组成；

(84)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点84的引物组84，

所述引物组84由序列250所示的正向引物、序列251所示的正向引物和序列252所示的反向引物组成；

(85)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点85的引物组85，

所述引物组85由序列253所示的正向引物、序列254所示的正向引物和序列255所示的反向引物组成；

(86)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点86的引物组86，

所述引物组86由序列256所示的正向引物、序列257所示的正向引物和序列258所示的反向引物组成；

(87)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点87的引物组87，

所述引物组87由序列259所示的正向引物、序列260所示的正向引物和序列261所示的反向引物组成；

(88)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点88的引物组88，

所述引物组88由序列262所示的正向引物、序列263所示的正向引物和序列264所示的反向引物组成；

(89)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点89的引物组89，

所述引物组89由序列265所示的正向引物、序列266所示的正向引物和序列267所示的反向引物组成；

(90)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点90的引物组90，

所述引物组90由序列268所示的正向引物、序列269所示的正向引物和序列270所示的反向引物组成；

(91)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点91的引物组91，

所述引物组91由序列271所示的正向引物、序列272所示的正向引物和序列273所示的反向引物组成；

(92)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点92的引物组92，

所述引物组92由序列274所示的正向引物、序列275所示的正向引物和序列276所示的反向引物组成；

(93)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点93的引物组93，

所述引物组93由序列277所示的正向引物、序列278所示的正向引物和序列279所示的反向引物组成；

(94)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点94的引物组95，

所述引物组94由序列280所示的正向引物、序列281所示的正向引物和序列282所示的反向引物组成；

(95)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点95的引物组95，

所述引物组95由序列283所示的正向引物、序列284所示的正向引物和序列285所示的反向引物组成；

(96)用于检测大白菜基因组DNA的SNP位点96的引物组96，

所述引物组96由序列286所示的正向引物、序列287所示的正向引物和序列288所示的反向引物组成。

本发明的第二个目的是提供一种检测大白菜96个SNP位点的物质、或一种对大白菜品种进行基因分型的物质、或构建大白菜DNA指纹库的物质、或大白菜种质资源聚类分析的物质、或鉴别或辅助鉴别大白菜品种的物质。

本发明提供的对检测大白菜96个SNP位点的物质、或一种对大白菜品种进行基因分型的物质、或构建大白菜DNA指纹库的物质、或大白菜种质资源聚类分析的物质、或鉴别或辅助鉴别大白菜品种的物质为上述应用中的96组引物。

本发明的第三个目的是提供一种对大白菜品种进行基因分型和/或构建大白菜DNA指纹数据库和/或大白菜种质资源聚类分析和/或鉴别或辅助鉴别大白菜品种的成套PCR试剂。

本发明提供的对大白菜品种进行基因分型和/或构建大白菜DNA指纹数据库和/或大白菜种质资源聚类分析和/或鉴别或辅助鉴别大白菜品种的成套PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7、PCR试剂8、PCR试剂9、PCR试剂10、PCR试剂11、PCR试剂12、PCR试剂13、PCR试剂14、PCR试剂15、PCR试剂16、PCR试剂17、PCR试剂18、PCR试剂19、PCR试剂20、PCR试剂21、PCR试剂22、PCR试剂23、PCR试剂24、PCR试剂25、PCR试剂26、PCR试剂27、PCR试剂28、PCR试剂29、PCR试剂30、PCR试剂31、PCR试剂32、PCR试剂33、PCR试剂34、PCR试剂35、PCR试剂36、PCR试剂37、PCR试剂38、PCR试剂39、PCR试剂40、PCR试剂41、PCR试剂42、PCR试剂43、PCR试剂44、PCR试剂45、PCR试剂46、PCR试剂47、PCR试剂48、PCR试剂49、PCR试剂50、PCR试剂51、PCR试剂52、PCR试剂53、PCR试剂54、PCR试剂55、PCR试剂56、PCR试剂57、PCR试剂58、PCR试剂59、PCR试剂60、PCR试剂61、PCR试剂62、PCR试剂63、PCR试剂64、PCR试剂65、PCR试剂66、PCR试剂67、PCR试剂68、PCR试剂69、PCR试剂70、PCR试剂71、PCR试剂72、PCR试剂73、PCR试剂74、PCR试剂75、PCR试剂76、PCR试剂77、PCR试剂78、PCR试剂79、PCR试剂80、PCR试剂81、PCR试剂82、PCR试剂83、PCR试剂84、PCR试剂85、PCR试剂86、PCR试剂87、PCR试剂88、PCR试剂89、PCR试剂90、PCR试剂91、PCR试剂92、PCR试剂93、PCR试剂94、PCR试剂95和PCR试剂96组成；

所述PCR试剂1包括上述引物组1；

所述PCR试剂2包括上述引物组2；

所述PCR试剂3包括上述引物组3；

所述PCR试剂4包括上述引物组4；

所述PCR试剂5包括上述引物组5；

所述PCR试剂6包括上述引物组6；

所述PCR试剂7包括上述引物组7；

所述PCR试剂8包括上述引物组8；

所述PCR试剂9包括上述引物组9；

所述PCR试剂10包括上述引物组10；

所述PCR试剂11包括上述引物组11；

所述PCR试剂12包括上述引物组12；

所述PCR试剂13包括上述引物组13；

所述PCR试剂14包括上述引物组14；

所述PCR试剂15包括上述引物组15；

所述PCR试剂16包括上述引物组16；

所述PCR试剂17包括上述引物组17；

所述PCR试剂18包括上述引物组18；

所述PCR试剂19包括上述引物组19；

所述PCR试剂20包括上述引物组20；

所述PCR试剂21包括上述引物组21；

所述PCR试剂22包括上述引物组22；

所述PCR试剂23包括上述引物组23；

所述PCR试剂24包括上述引物组24；

所述PCR试剂25包括上述引物组25；

所述PCR试剂26包括上述引物组26；

所述PCR试剂27包括上述引物组27；

所述PCR试剂28包括上述引物组28；

所述PCR试剂29包括上述引物组29；

所述PCR试剂30包括上述引物组30；

所述PCR试剂31包括上述引物组31；

所述PCR试剂32包括上述引物组32；

所述PCR试剂33包括上述引物组33；

所述PCR试剂34包括上述引物组34；

所述PCR试剂35包括上述引物组35；

所述PCR试剂36包括上述引物组36；

所述PCR试剂37包括上述引物组37；

所述PCR试剂38包括上述引物组38；

所述PCR试剂39包括上述引物组39；

所述PCR试剂40包括上述引物组40；

所述PCR试剂41包括上述引物组41；

所述PCR试剂42包括上述引物组42；

所述PCR试剂43包括上述引物组43；

所述PCR试剂44包括上述引物组44；

所述PCR试剂45包括上述引物组45；

所述PCR试剂46包括上述引物组46；

所述PCR试剂47包括上述引物组47；

所述PCR试剂48包括上述引物组48；

所述PCR试剂49包括上述引物组49；

所述PCR试剂50包括上述引物组50；

所述PCR试剂51包括上述引物组51；

所述PCR试剂52包括上述引物组52；

所述PCR试剂53包括上述引物组53；

所述PCR试剂54包括上述引物组54；

所述PCR试剂55包括上述引物组55；

所述PCR试剂56包括上述引物组56；

所述PCR试剂57包括上述引物组57；

所述PCR试剂58包括上述引物组58；

所述PCR试剂59包括上述引物组59；

所述PCR试剂60包括上述引物组60；

所述PCR试剂61包括上述引物组61；

所述PCR试剂62包括上述引物组62；

所述PCR试剂63包括上述引物组63；

所述PCR试剂64包括上述引物组64；

所述PCR试剂65包括上述引物组65；

所述PCR试剂66包括上述引物组66；

所述PCR试剂67包括上述引物组67；

所述PCR试剂68包括上述引物组68；

所述PCR试剂69包括上述引物组69；

所述PCR试剂70包括上述引物组70；

所述PCR试剂71包括上述引物组71；

所述PCR试剂72包括上述引物组72；

所述PCR试剂73包括上述引物组73；

所述PCR试剂74包括上述引物组74；

所述PCR试剂75包括上述引物组75；

所述PCR试剂76包括上述引物组76；

所述PCR试剂77包括上述引物组77；

所述PCR试剂78包括上述引物组78；

所述PCR试剂79包括上述引物组79；

所述PCR试剂80包括上述引物组80；

所述PCR试剂81包括上述引物组81；

所述PCR试剂82包括上述引物组82；

所述PCR试剂83包括上述引物组83；

所述PCR试剂84包括上述引物组84；

所述PCR试剂85包括上述引物组85；

所述PCR试剂86包括上述引物组86；

所述PCR试剂87包括上述引物组87；

所述PCR试剂88包括上述引物组88；

所述PCR试剂89包括上述引物组89；

所述PCR试剂90包括上述引物组90；

所述PCR试剂91包括上述引物组91；

所述PCR试剂92包括上述引物组92；

所述PCR试剂93包括上述引物组93；

所述PCR试剂94包括上述引物组94；

所述PCR试剂95包括上述引物组95；

所述PCR试剂96包括上述引物组96。

上述成套PCR试剂中，所述各PCR试剂中的每条所述正向引物和所述反向引物的物质的量比均为6：15。

本发明的第四个目的是提供含有上述物质或上述成套PCR试剂的试剂盒。

上述物质或上述成套PCR试剂或上述试剂盒在对大白菜品种进行基因分型和/或构建大白菜DNA指纹数据库和/或大白菜种质资源聚类分析和/或鉴别或辅助鉴别大白菜品种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第五个目的是提供一种对大白菜品种进行基因分型的方法。

本发明提供的对大白菜品种进行基因分型的方法包括如下步骤：用上述96组引物对待测大白菜基因组DNA进行PCR扩增，得到待测大白菜的PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行分析，确定所述待测大白菜的96个SNP位点的基因型；

所述96个SNP位点如下：

SNP位点1为A01染色体上的第1248141位核苷酸；

SNP位点2为A01染色体上的第4225329位核苷酸；

SNP位点3为A01染色体上的第7102966位核苷酸；

SNP位点4为A01染色体上的第9716212位核苷酸；

SNP位点5为A01染色体上的第14897192位核苷酸；

SNP位点6为A01染色体上的第16592150位核苷酸；

SNP位点7为A01染色体上的第18635734位核苷酸；

SNP位点8为A01染色体上的第22449302位核苷酸；

SNP位点9为A01染色体上的第24456539位核苷酸；

SNP位点10为A01染色体上的第26752589位核苷酸；

SNP位点11为A02染色体上的第751652位核苷酸；

SNP位点12为A02染色体上的第2421548位核苷酸；

SNP位点13为A02染色体上的第6035955位核苷酸；

SNP位点14为A02染色体上的第9423555位核苷酸；

SNP位点15为A02染色体上的第11181828位核苷酸；

SNP位点16为A02染色体上的第14862673位核苷酸；

SNP位点17为A02染色体上的第18425637位核苷酸；

SNP位点18为A02染色体上的第21426261位核苷酸；

SNP位点19为A02染色体上的第23096858位核苷酸；

SNP位点20为A02染色体上的第23181920位核苷酸；

SNP位点21为A02染色体上的第25360564位核苷酸；

SNP位点22为A03染色体上的第128271位核苷酸；

SNP位点23为A03染色体上的第3151130位核苷酸；

SNP位点24为A03染色体上的第4471683位核苷酸；

SNP位点25为A03染色体上的第7828461位核苷酸；

SNP位点26为A03染色体上的第12523505位核苷酸；

SNP位点27为A03染色体上的第15431305位核苷酸；

SNP位点28为A03染色体上的第18277222位核苷酸；

SNP位点29为A03染色体上的第21003111位核苷酸；

SNP位点30为A03染色体上的第23890389位核苷酸；

SNP位点31为A03染色体上的第26316567位核苷酸；

SNP位点32为A03染色体上的第30080620位核苷酸；

SNP位点33为A04染色体上的第1223515位核苷酸；

SNP位点34为A04染色体上的第6933634位核苷酸；

SNP位点35为A04染色体上的第8662680位核苷酸；

SNP位点36为A04染色体上的第9741929位核苷酸；

SNP位点37为A04染色体上的第11311194位核苷酸；

SNP位点38为A04染色体上的第12579896位核苷酸；

SNP位点39为A04染色体上的第13764622位核苷酸；

SNP位点40为A04染色体上的第14413900位核苷酸；

SNP位点41为A05染色体上的第487586位核苷酸；

SNP位点42为A05染色体上的第1283352位核苷酸；

SNP位点43为A05染色体上的第2835432位核苷酸；

SNP位点44为A05染色体上的第4379811位核苷酸；

SNP位点45为A05染色体上的第8088873位核苷酸；

SNP位点46为A05染色体上的第10705210位核苷酸；

SNP位点47为A05染色体上的第14960042位核苷酸；

SNP位点48为A05染色体上的第16182627位核苷酸；

SNP位点49为A05染色体上的第19009544位核苷酸；

SNP位点50为A05染色体上的第22962829位核苷酸；

SNP位点51为A06染色体上的第18887位核苷酸；

SNP位点52为A06染色体上的第6403261位核苷酸；

SNP位点53为A06染色体上的第13545093位核苷酸；

SNP位点54为A06染色体上的第14701558位核苷酸；

SNP位点55为A06染色体上的第16193195位核苷酸；

SNP位点56为A06染色体上的第18685199位核苷酸；

SNP位点57为A06染色体上的第21632076位核苷酸；

SNP位点58为A06染色体上的第23153503位核苷酸；

SNP位点59为A06染色体上的第24717886位核苷酸；

SNP位点60为A07染色体上的第246275位核苷酸；

SNP位点61为A07染色体上的第1028346位核苷酸；

SNP位点62为A07染色体上的第2970833位核苷酸；

SNP位点63为A07染色体上的第6101124位核苷酸；

SNP位点64为A07染色体上的第11498098位核苷酸；

SNP位点65为A07染色体上的第14523031位核苷酸；

SNP位点66为A07染色体上的第18060124位核苷酸；

SNP位点67为A07染色体上的第19894600位核苷酸；

SNP位点68为A07染色体上的第24460147位核苷酸；

SNP位点69为A08染色体上的第100717位核苷酸；

SNP位点70为A08染色体上的第2374634位核苷酸；

SNP位点71为A08染色体上的第8933259位核苷酸；

SNP位点72为A08染色体上的第10869244位核苷酸；

SNP位点73为A08染色体上的第15287418位核苷酸；

SNP位点74为A08染色体上的第16162051位核苷酸；

SNP位点75为A08染色体上的第17179902位核苷酸；

SNP位点76为A08染色体上的第20716882位核苷酸；

SNP位点77为A09染色体上的第583658位核苷酸；

SNP位点78为A09染色体上的第3817906位核苷酸；

SNP位点79为A09染色体上的第5122605位核苷酸；

SNP位点80为A09染色体上的第8876252位核苷酸；

SNP位点81为A09染色体上的第8877380位核苷酸；

SNP位点82为A09染色体上的第16265081位核苷酸；

SNP位点83为A09染色体上的第18332606位核苷酸；

SNP位点84为A09染色体上的第21636788位核苷酸；

SNP位点85为A09染色体上的第26520788位核苷酸；

SNP位点86为A09染色体上的第31873135位核苷酸；

SNP位点87为A09染色体上的第34559009位核苷酸；

SNP位点88为A09染色体上的第37238042位核苷酸；

SNP位点89为A10染色体上的第617354位核苷酸；

SNP位点90为A10染色体上的第5601251位核苷酸；

SNP位点91为A10染色体上的第6477381位核苷酸；

SNP位点92为A10染色体上的第8425118位核苷酸；

SNP位点93为A10染色体上的第12492205位核苷酸；

SNP位点94为A10染色体上的第13127812位核苷酸；

SNP位点95为A10染色体上的第13859895位核苷酸；

SNP位点96为A10染色体上的第15835648位核苷酸。

上述方法在鉴别或辅助鉴别多个待测大白菜品种或构建大白菜DNA指纹数据库或对白菜种质资源进行聚类分析中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第六个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别多个待测大白菜品种的方法。

本发明提供的鉴别或辅助鉴别多个待测大白菜品种的方法包括如下步骤：根据上述方法确定所有待测大白菜品种在所述96个SNP位点的基因型，根据所得基因型数据，鉴别多个待测大白菜品种。

本发明的第七个目的是提供一种构建大白菜DNA指纹数据库的方法。

本发明提供的构建大白菜DNA指纹数据库的方法包括如下步骤：根据上述方法确定所有待测大白菜品种在所述96个SNP位点的基因型，所得基因型数据即构成大白菜DNA指纹数据库；

本发明的第八个目的是提供一种对大白菜种质资源进行聚类分析的方法。

本发明提供的对大白菜种质资源进行聚类分析的方法包括如下步骤：根据上述方法确定待测大白菜种质资源在所述96个SNP位点的基因型，根据所得基因型数据，建立聚类树状图，从而实现对大白菜种质资源进行聚类分析。

上述大白菜品种为表4中所示。

表4、328份大白菜品种信息

上述96个SNP位点的物理位置是基于大白菜品种Brassica rapa pekinensis的全基因组序列比对确定的，所述大白菜品种Brassica rapa pekinensis的全基因组序列的版本号为V1.5(下载地址http://brassicadb.org/brad)。上述96个SNP位点的物理位置及碱基信息具体如表5所示：

表5、96个SNP位点的物理位置及碱基

本发明基于10个白菜核心资源的重测序，发掘了白菜全基因组的序列变异，筛选了一套适于大白菜品种核酸指纹数据库构建的96组SNP核心引物。通过实验证明：本发明的96组SNP核心引物分布于白菜整个基因组，具有较高的多态性信息量(PIC值)、最小等位基因频率(MAF值)以及较低的期望杂合度，绝大部分位点位于基因的编码区，能够准确进行育种材料的遗传多样性分析和品种鉴别，并且基因分型结果稳定，有利于进行大白菜核酸指纹数据库构建和品种鉴定等方面的研究。本发明提供的SNP位点和检测方法可实现高通量、低成本、标准化和稳定可靠品种真实性检测，实际操作过程还可获得实验数据的全程记录和清晰的可视化效果，为建立标准化、高通量、低成本的分子检测技术平台奠定了良好基础，可用于构建大白菜主栽品种和核心育种材料的核酸指纹数据库，从而高效、准确的进行大白菜品种的真实性和特异性鉴定。

附图说明

图1为BrSNPA10032引物对328份大白菜品种的分型效果图。

图2为328份大白菜品种在96个SNP位点中的基因型指纹，图中标记的顺序从上到下依次为引物编号1～96。

图3为利用96对SNP核心引物分析328份大白菜品种的聚类图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、一套适于大白菜品种核酸指纹数据库构建的SNP引物组

一、96组SNP核心引物

本发明基于96个SNP位点设计了96组适于大白菜品种核酸指纹数据库构建的SNP核心引物，每组引物由3条引物序列组成。96个SNP位点的物理位置、差异碱基及96组SNP核心引物的核苷酸序列如表1所示。表1中的1-96分别代表96个SNP位点，连锁群代表染色体号，物理位置代表该SNP位点对应染色体上的位数，差异碱基代表该SNP位点的的碱基，如SNP位点1位于A01号染色体上第1248141位，其碱基为T或C。

上述96个SNP位点的物理位置是基于大白菜品种Brassica rapa pekinensis的全基因组序列比对确定的，所述大白菜品种Brassica rapa pekinensis的全基因组序列的版本号为V1.5(下载地址http://brassicadb.org/brad)。

表1、96组SNP核心引物

实施例2、适于大白菜品种核酸指纹数据库构建的SNP引物组的应用

1、基因组DNA的提取

分别提取表2中53个省市单位的328份的大白菜待测品种的基因组DNA，提取方法可采用常规CTAB法或快速高通量提取植物基因组DNA的方法。本发明采用常规CTAB法提取基因组DNA。具体步骤如下：

先每份材料各取4～5粒种子催芽2～3天，把长出两片绿色子叶的小芽单个装入2mL离心管中，加入1粒0.4mm的钢珠后写清编号，放入液氮中冷冻5-10min，再使用组织研磨机打碎。每管加入800μL 65℃预热的CTAB缓冲液，迅速振荡混匀，放入65℃水浴锅水浴30min，期间至少颠倒混匀一次。再向离心管中加入800μL氯仿/异戊醇(氯仿：异戊醇为24：1)，振荡混匀，静止5min后，12000r/min离心10min。吸600μL上清液转入另一只2mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀，放于-20℃冰箱冷却20min，然后10000r/min离心5min，弃上清。用800μL 75％乙醇漂洗2次，每次10000r/min离心5min，弃上清液收集沉淀，最后室温下吹干沉淀，加入50μL ddH2O溶解DNA。

表2、328份大白菜品种信息

通过1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对提取得到的基因组DNA的质量进行检测，合格的DNA要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。根据英国LGC公司的KASP检测技术和白菜基因组大小换算出DNA用量为4～10ng/每样品，稀释DNA浓度成为4～10ng/μl，备用。

2、引物的合成和引物预混液的配制

委托北京生工生物工程有限公司合成实施例1中的96组SNP引物，且在每组引物中的引物名1的序列的5’端需加上如下所示的接头序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，引物名2的序列的5’端需加上如下所示的接头序列：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，引物名3的序列不用改变。

分别将各组SNP引物中的引物链均稀释成10μmol，并按照体积比为6:6:15(引物名1：引物名2：引物名3)的比例混匀，分别得到96组引物预混液(各组540μl)。

3、基因分型

基于实施例1中的96个SNP位点利用KASP技术对328份大白菜品种进行SNP基因分型，SNP基因分型过程按照LGC公司提供的KASP技术的实验流程进行，以下使用的试剂、耗材和仪器没有特殊说明的均由LGC公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南KASP user guide and manual(www.lgcgenomics.com)进行，反应在384孔板(Part No.KBS-0750-001)或1536微孔板(Part No.KBS-0751-001)中进行，反应体系为3ul或1ul。具体步骤如下：

首先利用K-pette分液工作站将步骤1稀释好的待测DNA模板(4～10ng/μl)1.5ul和空白对照(No template control,NTC)分别加入384孔或者1536孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(384孔板货号Part No.KBS-1016-002或1536微孔板货号Part No.KBS-1016-011)与96组引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。每一轮最多进行14块PCR反应板(384和1536)，384孔板或1536孔板的反应体系如表3所示。

表3、384孔板或1536孔板的反应体系

注：Meridian在分液过程中为排气泡每加1对引物时需损失230μl的反应液，即2x Master mix和ddH2O各115μl。

PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全，从Kraken软件中导出实验结果。

基因分型结果显示：每一组引物对待测大白菜的分型效果均很好。其中，BrSNPA10032引物对328份大白菜品种的分型效果图如图1所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中红色圆点表示该位点是纯合基因型“TT”；蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“GG”；绿色圆点表示该位点是杂合基因型“GT”或“TG”；黑色圆点表示NTC，即为水对照。

4、SNP指纹图谱

利用GGT2.0软件构建328份大白菜品种的SNP指纹图谱。

结果如图2所示，图2中每种颜色对应于一个字母或符号，用于区分不同的基因型，其中，“A”代表基因型“AA”；“C”代表基因型“CC”；“G”代表基因型“GG”；“K”代表基因型“GT或TG”；“M”代表基因型“AC或CA”；“R”代表基因型“AG或GA”；“S”代表基因型“GC或CG”；“T”代表基因型“TT”；“W”代表基因型“AT或TA”；“Y”代表基因型“CT或TC”和“？”代表缺失或不确定的基因型。从图中可以看出，本发明的96组SNP引物可以应用于大白菜品种DNA指纹数据库构建和品种的真实性检测。

5、聚类分析

使用PowerMarkerV3.25和MEGA6.06软件对328份大白菜品种进行聚类分析。

聚类结果如图3所示，从图中可以看出，96个SNP引物组能够把来源于53个省市单位的328份大白菜品种完全区分开，表明本发明的SNP核心引物组的鉴别能力较好。