本发明涉及一种低危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,hpv）属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链dna病毒，基因组长约8000碱基对（bp），分为3个功能区，即早期转录区（e区）、晚期转录区（l区）和非转录区（长控制区，lcr）。hpv通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。hpv根据其基因组核苷酸序列不同，目前已经分离出130多种基因型，不同基因型别引起不同的临床表现。对于感染生殖道和肛门的hpv，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。低危型hpv一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌，其中最常见的基因型是6和11型，其次是40、42、43、44型。尖锐湿疣是国家卫生部规定要求监测的八大性传播疾病之一，它的发病率仅次于淋病，由于病情易反复发作，传染性极强，已经成为严重危及人们正常生活的常见性病之一。由于hpv病毒难于培养，目前临床上检测低危型hpv的常用方法依赖于分子生物学核酸检测方法，主要是荧光pcr法（cn101251469a）、膜杂交固相芯片法（蒋明军等，中华皮肤科杂志，2005,38（5）：262-264）和液相悬浮芯片法（cn100582239c），特别是taqman探针荧光pcr法，相对于其它两种方法，具有闭管检测污染少、操作简便快速、结果灵敏准确特异的优点，适用于尖锐湿疣样本中低危型hpv的快速检测，适合在基层临床机构推广使用。技术实现要素：本发明提供一种单管低危型人乳头瘤病毒（hpv）核酸检测试剂盒，其特征在于，试剂盒所用四对荧光pcr扩增引物序列为seqidno：1～seqidno：8，五条荧光探针序列为seqidno：9～seqidno：13，其中荧光探针seqidno：9和seqidno：10序列5’端标记fam荧光基团，荧光探针seqidno：11序列5’端标记joe或hex或vic荧光基团，荧光探针seqidno：12序列5’端标记rox荧光基团，荧光探针seqidno：13序列5’端标记cy5荧光基团，这五条探针3’端均标记bhq淬灭基团。本发明提供的低危型hpv核酸检测试剂盒能实现在单个反应管中通过荧光pcr反应，检测临床常见的低危型hpv，结果灵敏、准确、稳定、特异性高，对尖锐湿疣的诊断和早期预防具有较大的临床意义。技术方案通过对genbank中hpv基因型核苷酸序列查询，用vectornti、oligo等软件对各种hpv基因亚型的l1基因序列进行比对设计，按照taqman探针荧光pcr设计的原则，优选了四对引物扩增hpv6、11、40、42、43、44这六种临床常见的低危型hpv保守区域，并同时优选了五条荧光探针检测这六种hpv亚型，试剂盒中的这些引物和荧光探针核苷酸序列（5’->3’）如下：上游引物（seqidno：1）：agatgtggcggcctag；下游引物（seqidno：2）：gtctagaactgctrgcatg；上述这对引物扩增hpv6、11、44型基因片段。上游引物（seqidno：3）：atgaaaatcaagtatatttaccac；下游引物（seqidno：4）：gatgtcctatagtcagtaacc；上述这对引物扩增hpv40型基因片段。上游引物（seqidno：5）：caactatttaataaaccatattgg；下游引物（seqidno：6）：tgtatcaccagatgttgc；上述这对引物扩增hpv42型基因片段。上游引物（seqidno：7）：ttggcttttcagaaacaac；下游引物（seqidno：8）：ggttttcagtgtcatcatac；上述这对引物扩增hpv43型基因片段。荧光探针（seqidno：9）：cacagtatatgtgcctcctcc，序列5’端标记fam荧光基团，检测hpv6、11型；荧光探针（seqidno：10）：cgccccagtatccaaag，序列5’端标记fam荧光基团，检测hpv44型；荧光探针（seqidno：11）：acgcctgttgctaccattgttag，序列5’端标记joe或hex或vic荧光基团，检测hpv40型；荧光探针（seqidno：12）：caacaagcacaaggacacaata，序列5’端标记rox荧光基团，检测hpv42型；荧光探针（seqidno：13）：tggttacatcagacactcagc，序列5’端标记cy5荧光基团，检测hpv43型；这五条荧光探针序列3’端均标记bhq淬灭基团。上述引物和荧光探针辅以pcr反应成分一起组成反应体系，实现单管检测六种低危型hpv。所述扩增试剂反应体系各成分组成如下：10mmtris-hcl（ph8.3）、50mmkcl、0.2mmdntps（含datp、dgtp、dctp、dutp）、1.5～5mmmgcl2、各0.1～0.5μm引物和荧光探针（seqidno：1～4）、1～5utaqdna聚合酶和0.01～1uung酶，提取的模板10μl，总反应体积30μl。所述低危型hpv荧光pcr检测试剂盒扩增程序如下：50℃2min、95℃5min后按照95℃10sec、60℃40sec循环扩增40次，循环步骤中60℃时采集fam、joe、rox和cy5四个波长荧光信号。所述低危型hpv荧光pcr试剂盒对照品包括阴性对照、阳性对照各1个，阴性对照采用生理盐水；分别构建四个含有hpv6、40、42、43型扩增产物序列插入puc18t载体上的质粒大肠杆菌（各称为hpv6型质粒大肠杆菌、hpv40型质粒大肠杆菌、hpv42型质粒大肠杆菌、hpv43型质粒大肠杆菌），将这四种质粒大肠杆菌以相同浓度等体积混合（103copy/ml），作为试剂盒阳性对照。本发明提供了荧光pcr检测的试剂盒，优化了pcr反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光pcr的一般要求可以调整pcr反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。有益效果本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成低危型hpv核酸检测试剂盒，其主要优点和在用于低危型hpv检测时的有益效果如下：（1）通过序列比对，精简设计优选了四对特异性扩增引物和五条特异性荧光探针，在荧光pcr仪四个波长实现了六种低危型hpv的检测，具有准确性、特异性高的优点。（2）六种低危型hpv能在单个反应管中实现闭管一步法快速检测，无需后处理步骤，提高了工作效率。（3）扩增体系中的dutp－ung酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性，提高了试剂盒检测的准确度。（4）试剂盒采用磁珠法原理提取样本核酸，适合仪器自动化操作，节约人力成本，简便快速，可在2小时内报告检测结果。试剂盒的上述特点，均为采用特异性设计的低危型hpv引物探针并与荧光pcr技术组合应用而直接引起，获得的检测结果可以用于判断临床尖锐湿疣患者常见低危型hpv感染病情提供参考依据，对尖锐湿疣的诊断和早期预防具有较大的临床意义。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1：低危型hpv核酸检测试剂盒引物探针的设计根据ncbigenbank数据库中查询的各种基因型hpvl1基因序列，采用vectornti、oligo等引物设计软件，扩增各低危型hpvl1基因上123～147bp型特异性片段，优选获得的引物探针序列如表1所示。表1设计的低危型hpv试剂盒引物探针以上引物探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实施例2：低危型hpv核酸检测试剂盒配制试剂盒扩增试剂，即pcr反应缓冲液为自行配制，按表2各成分浓度和体积配制32人份试剂盒pcr反应缓冲液，配制的反应缓冲液每个反应分装用量为20μl，加入模板10μl后总反应体积为30μl。表2试剂盒反应缓冲液配制各组分体积组分初始浓度反应终浓度（30μl）32人份体积（μl）tris-hcl(ph8.3)1000mm10mm9.6kcl500mm50mm96datp100mm0.2mm1.92dgtp100mm0.2mm1.92dctp100mm0.2mm1.92dutp100mm0.2mm1.92mgcl2100mm3.5mm33.6seqidno:150μm0.3μm5.76seqidno:250μm0.3μm5.76seqidno:350μm0.25μm4.8seqidno:450μm0.25μm4.8seqidno:550μm0.25μm4.8seqidno:650μm0.25μm4.8seqidno:750μm0.25μm4.8seqidno:850μm0.25μm4.8seqidno:950μm0.2μm3.84seqidno:1050μm0.15μm2.88seqidno:1150μm0.2μm3.84seqidno:1250μm0.2μm3.84seqidno:1350μm0.2μm3.84热启动taq酶5u/μl2u/反应12.8ung酶1u/μl0.5u/反应16水----405.76总体积----640试剂盒阴性对照采用生理盐水，阳性对照为含hpv6、40、42、43型质粒大肠杆菌混合菌液，浓度2.0x103copy/ml，阴性对照和阳性对照按照400μl/管分装。通过上述配制的低危型hpv核酸检测试剂盒，扩增试剂与对照品要求-20℃保存和运输。试剂盒病毒核酸提取试剂采用上海星耀医学科技发展有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂盒，它包括裂解缓冲液、磁珠、清洗缓冲液w1和w2、洗脱缓冲液5个组分，使用时试剂盒阴性对照、阳性对照、标本均采用该试剂盒提取核酸。试剂盒扩增程序为：50℃2min、95℃10min后按照95℃10sec、60℃40sec循环扩增40次，循环步骤中60℃时采集fam、joe、rox、cy5四个波长荧光信号。实施例3：试剂盒检测性能指标测定（1）样品模板准备分别取试剂盒构建的hpv6、40、42、43型质粒大肠杆菌，采用生理盐水10倍连续梯度稀释到4x103copy/ml、4x102copy/ml、4x101copy/ml，吸取上述稀释梯度样本各5份、以及试剂盒阴性对照和阳性对照各1份，每份样品体积400μl，采用上海星耀医学科技发展有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂盒在核酸提取仪上进行核酸提取，每个样品取样体积400μl，提取后获得核酸各50μl。采用中国食品药品检定研究院人乳头瘤病毒l1基因分型国家参考品（批号360002-201001）评价试剂盒检测准确性和特异性，该国家参考品由30个经过序列测定的hpv基因亚型参考品组成，包括hpv6、11、16、18、36、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、83，cp8304基因型，其中高危型14种、中危型3种、其余为低危型，可直接作为模板扩增，无需核酸提取。（2）荧光pcr检测将实施例2中试剂盒扩增试剂（反应缓冲液）从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到pcr反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照和阳性对照、hpv各亚型质粒大肠杆菌稀释梯度样品提取的模板、以及中国食品药品检定研究院人乳头瘤病毒l1基因分型参考品各10μl，每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到abi7500荧光pcr仪上，设定每个反应管样本类型，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按95℃10秒→60℃40秒循环40次（在60℃采集fam、joe、rox、cy5四个波长荧光信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。（3）结果分析观察荧光pcr仪四个波长检测ct值结果，试剂盒对4x103copy/ml、4x102copy/ml、4x101copy/ml浓度的样品分别重复检测5次，前两个浓度样品重复测定结果均为阳性，而4x101copy/ml浓度样品中只有1-2个阳性，因此可以确定试剂盒检测灵敏度可以达到4x102copy/ml。同时，试剂盒对人乳头瘤病毒l1基因分型国家参考品30个hpv亚型检测结果中，6、11和44型参考品在fam波长为阳性、其余3个波长为阴性；40型参考品在joe波长阳性、其余3个波长为阴性；42型参考品在rox波长为阳性、其余3个波长为阴性；43型参考品在cy5波长阳性、其余3个波长为阴性；而这6个亚型以外的24个hpv亚型参考品在四个波长检测结果均为阴性，说明低危型hpv核酸检测试剂盒对hpv国家参考品其它基因亚型无交叉反应，试剂盒检测准确性、特异性良好。实施例4：试剂盒在尖锐湿疣标本低危型hpv检测中的应用（1）样本核酸提取取临床收集的尖锐湿疣患者泌尿生殖道分泌物标本10个，与试剂盒阴性对照、阳性对照一起采用实施例3中的磁珠法核酸提取试剂在核酸提取仪上进行病毒dna提取，每个样品取样体积400μl，提取后获得核酸各50μl。（2）荧光pcr检测将实施例2中试剂盒扩增试剂（反应缓冲液）从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到pcr反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照、阳性对照、以及标本提取的模板各10μl。每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到abi7500荧光pcr仪上，设定每个反应管样本类型，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按95℃10秒→60℃40秒循环40次（在60℃采集fam、joe、rox、cy5四个波长荧光信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。（3）结果分析采用本发明试剂盒检测10个尖锐湿疣泌尿生殖道标本，从提取到扩增耗时2小时，结果显示10个标本均为hpv6、11、44型阳性（fam通道），同时有42型复合感染样本2个，40和43型复合感染样本1个，说明本发明试剂盒在临床尖锐湿疣患者低危型hpv检测中具有显著的实用价值。核苷酸序列表sequencelisting<110>上海星耀医学科技发展有限公司吴大治,夏懿,吴梅<120>一种低危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒<130>lr-hpv<140>cn<141>2015-12-30<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>16<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:1<222>(1)..(16)<400>1agatgtggcggcctag16<210>2<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:2<222>(1)..(19)<400>2gtctagaactgctrgcatg19<210>3<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:3<222>(1)..(24)<400>3atgaaaatcaagtatatttaccac24<210>4<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:4<222>(1)..(21)<400>4gatgtcctatagtcagtaacc21<210>5<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:5<222>(1)..(24)<400>5caactatttaataaaccatattgg24<210>6<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:6<222>(1)..(18)<400>6tgtatcaccagatgttgc18<210>7<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:7<222>(1)..(19)<400>7ttggcttttcagaaacaac19<210>8<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:8<222>(1)..(20)<400>8ggttttcagtgtcatcatac20<210>9<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:9<222>(1)..(23)<223>b=fam;d=bhq<400>9bcacagtatatgtgcctcctccd23<210>10<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:10<222>(1)..(19)<223>b=fam;d=bhq<400>10bcgccccagtatccaaagd19<210>11<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:11<222>(1)..(25)<223>b=joeorhexorvic;d=bhq<400>11bacgcctgttgctaccattgttagd25<210>12<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:12<222>(1)..(24)<223>b=rox;d=bhq<400>12bcaacaagcacaaggacacaatad24<210>13<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:13<222>(1)..(23)<223>b=cy5;d=bhq<400>13btggttacatcagacactcagcd23当前第1页12