本发明涉及蛋白纯化领域，特别涉及一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法。
背景技术：
：蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生变性。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有关系，最常见的是半胱氨酸，蛋白质对溶液pH、空气中的氧等外界因素都较为敏感，容易发生结构的转变，影响活性。钙调磷酸酶(Calcineurin,CN)是目前所知唯一一种依赖Ca2+/CaM(钙调素)的蛋白磷酸酶，由A，B亚基以1：1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，B亚基(CNB)是调节亚基。CN在免疫激活通路中发挥重要作用，示T细胞活化的关键没。CN作为大分子酶蛋白，易失活，不稳定，而CNB作为该酶的调节亚基，能促进CAN的活性，且相对分子质量小，性质稳定。由研究表明CNB能刺激T细胞和NK细胞增殖以及增强NK细胞的杀伤活性，增强巨噬细胞吞噬能力等免疫功能，且重组人钙调磷酸酶B亚基(RecombinanthumanCalcineurinBsubunit,rhCNB)是开发中的基因工程创新肿瘤药物。rhCNB具有明显的杀伤肿瘤细胞的作用，单体是一种含有巯基结构的蛋白，主要成分为rhCNB二聚体，含有少量单体和多聚体，在生产、放置等过程中，易受温度、pH值、氧化等因素影响形成多聚体结构，造成各组分比例不稳定。影响质量指标纯度的控制。因此，提供一种有效检测重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法具有重要的现实意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法。本发明对rhCNB原液进行系统适用性试验、方法的专属性、耐用性均符合验证可接受标准，验证通过。本方法适合于rhCNB原液中纯度的测定。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法，包括如下步骤：步骤1：取rhCNB原液制备获得供试品溶液；步骤2：取所述供试品溶液经反相高效液相色谱法测定rhCNB的纯度；所述反相高效液相色谱法的流动相包括：A相：0.1％(v/v)三氟乙酸-水；B相：0.1％(v/v)三氟乙酸-乙腈；所述流动相梯度洗脱配比为：A相：65％→5％、B相：35％→95％。在本发明的一些具体实施方案中，所述rhCNB原液的制备方法为：rhCNB工程菌经种子扩增、表达培养、得到有rhCNB表达的湿菌体。湿菌体经破碎、离心分离，得到蛋白含量不低于0.5％的离心分离上清液。将离心分离上清液经疏水层析、DEAE层析得到rhCNB粗纯化液。再经氧化、分子排阻色谱分离得到高纯度终纯化液。高纯度终纯化液经除菌过滤，得到rhCNB原液。在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的流动相梯度洗脱的流速为1.2～1.5mL/min。在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的流动相梯度洗脱在24分钟内B相从35％→95％。在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的检测波长为214-280nm。在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的检测温度为25℃～30℃。在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的固定相为丁基硅烷键合硅胶。在本发明的一些具体实施方案中，所述供试品溶液的蛋白质含量为2.0mg/ml。在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的空白对照溶液为枸橼酸盐溶液；所述枸橼酸溶液的制备方法为称取枸橼酸0.252g、枸橼酸钠2.59g，加水适量溶解，再加水稀释至1000ml。在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法中重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基峰理论塔板数不低于5000。在本发明的一些具体实施方案中，所述反相高效液相色谱法的所述流动相A相溶液的制备方法为量取1.0mL三氟乙酸加水至1000mL；所述流动相B相溶液的制备方法为量取1.0mL三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000mL。本发明提供了一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法，包括如下步骤：步骤1：取rhCNB原液制备获得供试品溶液；步骤2：取所述供试品溶液经反相高效液相色谱法测定rhCNB的纯度；所述反相高效液相色谱法的流动相包括：A相：0.1％(v/v)三氟乙酸-水；B相：0.1％(v/v)三氟乙酸-乙腈；所述流动相梯度洗脱配比为：A相：65％→5％、B相：35％→95％。用反相高效液相色谱法-丁基硅烷键合硅胶(C4)做固定相测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度，通常的蛋白质纯度测定是采用十八硅烷键合硅胶(C18)为固定相，而C18柱对于本品的测定达不到中国药典的规定要求。通过本发明，能有效解决测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度问题,通过系统适应性试验和方法学验证结果显示，各项指标如分离度、理论板数、重复性、拖尾因子以及方法学验证指标均符合现行版中国药典的要求。使用本发明，能解决重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的检测问题，通过方法学验证，建立重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度测定的质量标准。研究者参照国家药品审评中心[S]GPH1-1《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》的要求测定rhCNB纯度。方法的原理是利用rhCNB分子在214nm处具有紫外吸收的特性，采用HPLC方法对rhCNB原液纯度进行分析测定。该方法用于rhCNB原液在放行及稳定性试验中纯度的测定。为了评价实验室的仪器、人员、环境等能否满足rhCNB原液纯度测定的要求，按照2010年版药典附录<化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则>的要求，对分析方法进行了验证，验证的项目包括系统适用性试验、专属性、耐用性。验证结果表明，每个验证项目均符合验证标准。rhCNB纯度的分析方法适合于rhCNB原液中主成分二聚体的测定和控制。验证结果摘要如下：1、系统适用性试验结果及评价：在系统适用性溶液的色谱图中，以rhCNB二聚体峰计算色谱柱的理论塔板数N为18425，大于5000；rhCNB二聚体峰的拖尾因子T为0.917，小于2.0；标准溶液连续进样5次，其主峰面积的RSD为1.6％，小于2.0％。2.专属性验证结果及评价：枸橼酸及枸橼酸盐与rhCNB二聚体的分离度大于1.5，强力破坏性试验的产物有单体和二聚体，rhCNB二聚体能与单体有效分离，分离度大于1.5。强破坏试验产生的高温降解和光降解产物对rhCNB二聚体的测定没有干扰，表明rhCNB二聚体与上述物质分离度均符合要求。方法的专属性符合验证标准3.耐用性验证结果及评价：供试品溶液稳定性试验符合分析时间要求。综上，对rhCNB原液进行系统适用性试验、方法的专属性、耐用性均符合验证可接受标准，验证通过。本方法适合于rhCNB原液中纯度的测定。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例2中C4柱的色谱图；图2示实施例2中C8柱的色谱图；图3示实施例2中C18柱的色谱图；图4示实施例3中流速为1.2ml/min的色谱图；图5示实施例3中流速为1.5ml/min的色谱图；图6示实施例4中检测波长为214nm的色谱图；图7示实施例4中检测波长为280nm的色谱图；图8示实施例5中柱温为室温(25℃)的色谱图；图9示实施例5中柱温为30℃的色谱图；图10示实施例6中A/B相梯度为1号的色谱图；图11示实施例6中A/B相梯度为2号的色谱图；图12示实施例7中系统适用性色谱图；图13示实施例7中重复性试验第一次进样色谱图；图14示实施例7中重复性试验第二次进样色谱图；图15示实施例7中重复性试验第三次进样色谱图；图16示实施例7中重复性试验第四次进样色谱图；图17示实施例7中重复性试验第五次进样色谱图；图18示实施例7中专属性测定中对照品溶液色谱图；图19示实施例7中专属性测定中供试品溶液色谱图；图20示实施例7中专属性测定中枸橼酸和枸橼酸钠缓冲盐溶液色谱图；图21示实施例8中热破坏色谱图；图22示实施例8中光破坏色谱图；图23示实施例9中溶液稳定性试验中0h进样色谱图；图24示实施例9中溶液稳定性试验中1h进样色谱图；图25示实施例9中溶液稳定性试验中2h进样色谱图；图26示实施例9中溶液稳定性试验中3h进样色谱图；图27示实施例10中第一批原液色谱图；图28示实施例10中第二批原液色谱图；图29示实施例10中第三批原液色谱图。具体实施方式本发明公开了一种测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了通过反相高效液相法检测重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(以下简称rhCNB)纯度的方法。其特征在于，具体步骤如下：(1)色谱条件：色谱柱采用丁基硅烷键合硅胶(C4)为固定相的色谱柱；流动相为：A相0.1％三氟乙酸-水(65％～5％)和B相0.1％三氟乙酸-乙腈(35％～95％)；检测波长为214-280nm；流速1.2ml/min；梯度洗脱；紫外检测器检测。(2)采用水将样品配为含rhCNB2mg/ml的溶液。(3)测定，记录色谱图。本发明能准确测定rhCNB的纯度，分离度、理论板数、拖尾因子、重复性能达到中国药典要求。其特点是采用C4柱做为固定相，而通常使用的是C18柱。具体的：色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用丁基硅烷键合硅胶为填充剂，以A相(三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀)为流动相，在室温(25℃)条件下，进行梯度洗脱(在24分钟内B相从35％→95％)。供试品进样量为20μl，检测波长为214nm。重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基峰理论塔板数应不低于5000。测定法精密称取供试品适量，加水定量稀释制成蛋白质含量为2.0mg/ml的供试品溶液。照高效液相色谱法，依次精密量取供试品溶液和溶剂定位溶液(称取枸橼酸0.252g、枸橼酸钠2.59g，加水适量溶解，再加水稀释至1000ml)各20μl注入液相色谱仪，线性梯度洗脱，记录色谱图，按面积归一化法计算供试品的纯度。用反相高效液相色谱法-丁基硅烷键合硅胶(C4)做固定相测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度，通常的蛋白质纯度测定是采用十八硅烷键合硅胶(C18)为固定相，而C18柱对于本品的测定达不到中国药典的规定要求。通过本发明，能有效解决测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度问题,通过系统适应性试验和方法学验证结果显示，各项指标如分离度、理论板数、重复性、拖尾因子以及方法学验证指标均符合现行版中国药典的要求。使用本发明，能解决重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的检测问题，通过方法学验证，建立重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度测定的质量标准。本发明提供的测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基纯度的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。本发明所述rhCNB原液的制备方法为rhCNB工程菌经种子扩增、表达培养、得到有rhCNB表达的湿菌体。湿菌体经破碎、离心分离，得到蛋白含量不低于0.5％的离心分离上清液。将离心分离上清液经疏水层析、DEAE层析得到rhCNB粗纯化液。再经氧化、分子排阻色谱分离得到高纯度终纯化液。高纯度终纯化液经除菌过滤，得到rhCNB原液。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1色谱条件仪器：高效液相色谱仪日本岛津公司LC-2010CHTC2021-1试剂：乙腈(色谱纯)，三氟乙酸(分析纯)，纯化水工作对照品及供试品rhCNB工作对照品，批号：D20140201。所述rhCNB工作对照品的制备方法为：rhCNB菌种，经种子扩增、表达培养、破碎、离心分离、粗纯化、氧化、终纯化得rhCNB原液，rhCNB原液按暂定标准检测，符合要求后，加适量稳定剂分装制得，经标定后，作为企业工作对照品或参考品)。rhCNB原液供试品，本公司制备，批号SY20140301；SY20140302；SY20140303。所述rhCNB原液的制备方法为：rhCNB工程菌经种子扩增、表达培养、得到有rhCNB表达的湿菌体。湿菌体经破碎、离心分离，得到蛋白含量不低于0.5％的离心分离上清液。将离心分离上清液经疏水层析、DEAE层析得到rhCNB粗纯化液。再经氧化、分子排阻色谱分离得到高纯度终纯化液。高纯度终纯化液经除菌过滤，得到rhCNB原液。系统适应性试验条件的筛选：流动相的配制：A相：三氟乙酸1.0ml→水溶液1000ml(65～5％)B相：三氟乙酸1.0ml→乙腈1000ml(35～95％)。配制方法：A相：用1ml刻度吸管量取三氟乙酸1.0ml至1000ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，充分混匀。在超声波上脱气10分钟，0.45μ滤膜过滤，即得。B相：用1ml刻度吸管量取三氟乙酸1.0ml至1000ml容量瓶中，加色谱纯乙腈稀释至刻度，摇匀，充分混匀。在超声波上脱气10分钟，0.45μ滤膜过滤，即得。系统适用性试验溶液的制备：精密称取rhCNB工作对照品适量，用水制成含rhCNB约为2.0mg/ml的溶液，作为系统适用性试验溶液。实施例2色谱柱选择：按照实施例1进行试验：见色谱图1、2、3。结果：经用三种即C4柱、C8柱、C18柱测得的各图谱比较，选择C4柱测得的结果满意。实施例3流速的选择：见色谱图4、5。结果：经选用1.2ml/min和1.5ml/min两种流速，结果选用1.5ml/min流速得到的峰形较满意。实施例4检测波长的选择：见色谱图6、7。结果：经与280nm色谱图比较，选择214nm得到的峰形较好，基线平稳，峰面积大，使测量误差减少。实施例5柱温选择：选择室温(25℃)和30℃条件测量结果比较色谱图峰形优劣，见色谱图8、9。结果：两种条件所得图谱数据均较好，从节约能源考虑选择室温条件更适宜。实施例6A/B相梯度洗脱表配比选择见色谱图10、11。编号见表1。表1A/B相梯度洗脱表结果：2号梯度洗脱峰形较差，且保留时间延后约5分钟，使检测时间延长，故选择第一组梯度条件。综合实施例2～实施例6以上各条件的筛选试验研究，确定系统适用性试验条件为：固定相选用C4(用丁基硅烷键合硅胶为填充剂(5～10μm))；流动相配比为A相：三氟乙酸1.0ml→水溶液1000ml(65～5％)；B相：三氟乙酸1.0ml→乙腈1000ml(35～95％)；流速选用1.5ml/min；洗脱梯度选用：B相(35～95％)；检测波长选用：214nm；柱温选用：室温(25℃)；上样量选用：20μl。实施例7系统适用性试验按经研究确定的色谱条件，待仪器平衡后，开始进样操作。A、取系统适用性溶液进样，记录色谱图见图12，谱图数据见表2。以rhCNB二聚体峰计算色谱柱的理论塔板数N，应不少于5000；rhCNB二聚体峰的拖尾因子T为0.95～2.0，分离度大于1.5。重复性RSD不大于2.0％。按面积归一化法计算，rhCNB二聚体主峰面积与单体峰之和应不低于总面积的97.0％。表2图12的谱图数据B、重复性:取系统适用性溶液进样5次，记录色谱图(见图13～17)，计算主峰面积的RSD。色谱数据见表3系统适用性试验数据：表3系统适用性试验数据验证合格标准1)以rhCNB二聚体峰计算色谱柱的理论塔板数N，应不少于5000；2)rhCNB二聚体峰的拖尾因子T，不大于2.0；3)分离度大于1.54)标准溶液连续进样5次，其rhCNB二聚体主峰面积的RSD不大于2.0％。结论：系统适应性试验符合验证合格标准。实施例8专属性检测对照品溶液制备与测定：精密称取rhCNB工作对照品适量，用水制成含rhCNB约为2.0mg/ml的溶液，混合均匀。按经研究确定的色谱条件操作，进样20μl，记录色谱图18。供试品溶液制备与测定：称取rhCNB样品适量，精密称定，加水稀释制成约为2.0mg/ml的溶液，混合均匀。按经研究确定的色谱条件操作，进样20μl，记录色谱图19。枸橼酸和枸橼酸钠缓冲盐溶液制备与测定：取处方量的枸橼酸0.0252g和枸橼酸钠0.259g,置100ml容量瓶中，加水振摇溶解并稀释至刻度。按经研究确定的色谱条件操作，进样20μl，记录色谱图20。谱图数据见表4。表4图20的谱图数据强力破坏性试验溶液制备与测定：强力破坏性试验的目的是验证药品在遭遇极端的气候和环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分离、测定。破坏追求的目标是：在可产生降解产物的条件下，主成分保留70％～80％量。本品强力破坏性试验遵循世界卫生组织公布的最新方法进行即：热破坏：取原液加溶剂配成1:1溶液后，在37℃放置10天，按经研究确定的色谱条件操作，进样20μl，记录色谱图21。谱图数据见表5。表5图21的谱图数据峰号保留时间面积高度面积％拖尾因子分离度理论塔板数16.577515628150391422.382----1075327.03517881421119835477.618--1.5526994总计230377011702268100.000光解破坏：取原液适量，置4500lx光照条件下放置10天，按经研究确定的色谱条件操作，进样20μl，记录色谱图22。谱图数据见表6。表6图22的谱图数据峰号保留时间面积高度面积％拖尾因子分离度理论塔板数17.108211708511834139100.0000.922--12315总计211708511834139100.000专属性评价标准a枸橼酸及枸橼酸盐应对rhCNB的测定无明显干扰。b强力破坏性试验的降解产物应能与rhCNB二聚体有效分离，分离度应大于1.5结论：专属性试验符合专属性评价标准。实施例9耐用性的检测定义:是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。中国药典2010年版二部附录XIXA《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》中耐用性研究项下说明：液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成比例或pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速及检测波长等。以上所述典型的变动因素已在系统适用性研究项下进行了研究，本耐用性试验主要以溶液稳定性试验为主要验证内容。溶液稳定性试验：称取SY20140302批rhCNB原液样品适量，精密称定，加水稀释制成约2.0mg/ml的溶液，混合均匀。按经研究确定的色谱条件操作，分别于0、1、2、3h进样20μl，计算4次进样峰面积RSD为1.17％。色谱图见23～26。表7耐用性试验验证结果时间(h)0123平均值峰面积1573737716265939160319151581618115962853标准偏差S22547430308669052146672186074.5RSD％1.411.890.430.921.17耐用性试验验证结果(见表7)及评价:供试品溶液在3小时内稳定，满足分析时间要求。实施例10三批原液纯度检测供试品溶液制备与测定：称取rhCNB样品适量，精密称定，加水稀释制成约为2.0mg/ml的溶液，混合均匀。按经研究确定的色谱条件操作，进样20μl，记录色谱图见图27、28、29。原液3批纯度检测结果见表8：表8原液3批纯度检测结果批号SY20140301SY20140302SY20140303纯度100.0100.0100.0经按以上优选方案，纯度的分析方法简便，快速，准确，完成一次纯度分析仅需60分钟，适合于rhCNB原液生产中主成分二聚体的测定与控制。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3