源于霍氏格里蒙菌的重组胶原酶和细胞分离用酶剂的制作方法

本发明涉及源于霍氏格里蒙菌的重组胶原酶和细胞分离用酶剂。

背景技术：

胰脏中包含向十二指肠内分泌消化酶的外分泌腺和内分泌腺的胰岛。将对调节血糖浓度起重要作用的胰岛从胰脏分离并纯化，移植给处于胰岛素依赖状态的1型糖尿病等的患者的治疗方法称为胰岛移植。胰岛由于可以以点滴的方式注入体内，因此是低侵害性的，患者的身体负担低。

另一方面，胰脏的约九成是外分泌腺，分离胰岛的技术难，成功率极低。现在，作为细胞分离用的酶剂，包含源于溶组织棱状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)的称为胶原酶H(ColH)和胶原酶G(ColG)的亚型的混合物，用于从胰脏分离胰岛而在医疗现场被使用。但是，胰脏的组织结构因年龄、肥胖程度而不同，因此只有在胰岛分离用的酶剂与被提供的胰脏组织适合的情况下胰岛分离才会成功。

所述ColH和ColG是具有多个结构域构造的多结构域(multi-domain)蛋白质，其活性与结构域的组合和相对的配置有关(非专利文献1)。根据非专利文献1，源于棱菌属的胶原酶，共同地，包括催化结构域(以下有时称为CD)、多囊肾样结构域(以下有时称为PKD)、胶原结合结构域(以下有时称为CBD)3种，ColH是由1个CD、2个PKD、1个CBD形成的以CD-PKD-PKD-CBD表示的结构域构造，ColG是由1个CD、1个PKD、2个CBD形成的以CD-PKD-CBD-CBD表示的结构域构造。非专利文献1公开了：CBD的N末端侧结合钙，通过除掉钙，结构域的N末端部发生构造变化；钙对胶原的结合是重要的；钙有助于ColH的稳定化等。

另一方面，作为源于比活性高的微生物的胶原酶，有霍氏格里蒙菌源胶原酶(非专利文献2)。已知是包含前体区、催化结构域、接头区和前肽酶C末端结构域(以下也称为PPC)的、分子量84kDa的胶原酶，BLAST检索的结果是，与ColH、ColG的同源性低。另外，鉴于霍氏格里蒙菌源胶原酶难以低价获得的问题，还提出了构建使用了基因工程学手法的用于该胶原酶生产的技术的方法(专利文献1)。该专利文献1中记载了：制作包含霍氏格里蒙菌源胶原酶的完整编码区的基因的杆粒(bacmid)pCC1BAC-2的方法，使用杆粒pCC1BAC-2制作桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)重组体，由此制造霍氏格里蒙菌源胶原酶的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2010-263880号公报

非专利文献

非专利文献1:大林尚美、村山和隆，多结构域蛋白质胶原酶的分子内构象变化的解析，生化学，第85卷，第8号，pp692-699，2013年

非专利文献2:Teramura Naoko etc,Cloning of a Novel Collagenase Gene from the Gram-Negative Bacterium Grimontia(Vibrio)hollisae 1706B and Its Efficient Expression in Brevibacillus choshinensis,Journal of Bacteriology,June 2011vol.193no.12p.3049-3056.

技术实现要素：

本发明要解决的问题

在胰岛移植之外的医疗现场，使用容易得到的ColH和ColG的混合物。但是，ColH和ColG的结构域构造不同，根据ColH和ColG的配合比，性能会发生变化，因此活性不稳定。另一方面，不易调整配合比成为使胰岛分离的成功率降低的一个原因。因此，希望开发出不用混合、活性稳定的细胞分离用酶剂。

另一方面，所述非专利文献1公开的霍氏格里蒙菌源胶原酶的比活性高，专利文献1中也公开了使用了基因工程学的霍氏格里蒙菌源胶原酶的生产方法。但是，源于霍氏格里蒙菌的胶原酶的比活性有时会发生变动。如果每个制造批次的比活性不同，则难以以相同的方案来使用不同批次的产品。进而，如果经时活性降低，则有时由于使用量变化因而细胞收量变化，或者有时通过进行过度的分解处理从而给予细胞负荷。另一方面，霍氏格里蒙菌源胶原酶的结构域的详细情况还不清楚，比活性降低的原因也不明。因此，渴望开发出来源于比活性稳定的霍氏格里蒙菌的胶原酶的重组胶原酶。

进而，细胞分离的请求不受胰岛限定。肝脏、心脏、肺、肾脏、脾脏、肾上腺、肌肉之外、甲状腺、唾液腺、腮腺腺胞、乳腺组织等腺组织、骨、软骨等骨组织、内皮细胞、上皮细胞、脂肪组织等有时也可以在分离细胞后使用。对于良好地维持分离细胞的移植性等来说，细胞的损伤少，移植率高是重要的。因此，希望开发出各种细胞的分离性优异，且移植率优异的细胞分离剂。

胰岛移植的成功率也依赖于被分离的胰岛中残留的酶量，残留酶量越多移植率越低。优选细胞清洗后残留酶少，这在其他脏器、细胞中也是同样的。因此，期待清洗组织后，可以迅速从组织分离，或者降低残留在清洗组织中时的胶原酶活性，能够避免或减少细胞障碍的新型胶原酶。

在此种状況下，本发明的目的是提供胶原酶活性优异且源于比活性稳定的新型霍氏格里蒙菌的重组胶原酶。

本发明的目的还在于提供使用了由此得到的源于新型霍氏格里蒙菌的重组胶原酶的细胞分离用酶剂。

解决问题的方法

本发明人等对霍氏格里蒙菌源胶原酶的基因进行详细研究后，发现：如果前体区为分泌信号序列、即使除去PPC也具有高的胶原酶活性、如果连结CD和PPC的接头区序列的C末端起第3个氨基酸残基为甘氨酸的话，则可以维持稳定的胶原活性等，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种源于霍氏格里蒙菌的重组胶原酶，其特征在于，是来自于从N末端向C末端包含胶原酶催化结构域、接头区序列和前肽酶C末端结构域的霍氏格里蒙菌源胶原酶的重组胶原酶，至少不包含所述前肽酶C末端结构域。

另外，本发明提供上述霍氏格里蒙菌来源的重组胶原酶，其特征在于，所述接头区是被任一的酰胺键切断的接头片段。

另外，本发明提供上述霍氏格里蒙菌来源的重组胶原酶，其特征在于，所述接头片段的C末端起第3个氨基酸残基是甘氨酸。

另外，本发明提供上述霍氏格里蒙菌来源的重组胶原酶，其特征在于，所述接头片段是所述接头区中所含的由-G₁-X₁-Y₁-G₂-X₂-Y₂-表示的氨基酸序列的Y₁与G₂之间被切断了的接头片段，式中，G₁和G₂表示甘氨酸，X₁、Y₁、X₂和Y₂各自表示可以相同也可以不同的氨基酸残基。

另外，本发明提供上述霍氏格里蒙菌来源的重组胶原酶，其特征在于，是所述接头片段的C末端为-Gly-Asp-Ser、-Gly-Asn-Glu、-Gly-Glu-Ser、或-Gly-Asn-Thr中的任一种的重组胶原酶。

另外，本发明提供包含上述重组胶原酶的细胞分离用酶剂。

另外，本发明提供上述细胞分离用酶剂，其特征在于，用于选自由胰岛、肝脏、心脏、肺、肾脏、脾脏、肾上腺、肌肉、甲状腺、唾液腺、腮腺腺胞、乳腺组织、骨、软骨、内皮细胞、上皮细胞、脂肪组织和纤维芽细胞组成的组中的1种以上细胞的分离。

发明效果

通过本发明，能够提供源于比活性稳定的霍氏格里蒙菌的重组胶原酶。如果用包含该重组胶原酶的细胞分解用酶剂培养摘出的脏器，则可以高效地分离细胞。

附图说明

图1是说明霍氏格里蒙菌源胶原酶的结构域构造、接头区的序列、以及编码重组60kDa胶原酶、重组62kDa胶原酶的氨基酸序列的图。

图2表示实施例1的结果的图，是表示纯化酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图的图。74kDa表示74kDa胶原酶，62kDa表示重组62kDa胶原酶，60kDa表示重组60kDa胶原酶，M表示标记物。

图3是表示实施例2中，测定74kDa胶原酶、重组62kDa胶原酶和重组60kDa胶原酶刚刚纯化后的比活性的经时变化的结果的图。

图4是表示实施例3中，将重组62kDa胶原酶在温度4℃保存后的比活性的经时变化的图。

图5是表示实施例4的结果的图，是表示酶液中所含的重组62kDa胶原酶的浓度与分解组织量和非分解组织量的变化的图。

图6是表示实施例5和比较例1的结果的图，是表示使用重组62kDa胶原酶、或源于棱菌属的胶原酶(Liberase)进行胰脏消化实验，分解而得到的胰岛的个数与IEQ的结果的图。胰岛的个数的结果示于图6A，IEQ的结果示于图6B。

图7是表示实施例5中，使用重组62kDa胶原酶分离出的胰岛的光学显微镜照片的图。

图8是表示实施例6的结果的图，是表示移植胰岛后的STZ诱导糖尿病小鼠与未移植的小鼠的血糖值的推移、和摘出的胰岛移植肾、组织染色的结果的图。小鼠的血糖值的推移的结果示于图8A，摘出的胰岛移植肾、组织染色的结果示于图8B。

图9是表示实施例7中分离的肝细胞的相差显微镜照片图像的图。

图10是表示实施例8、比较例2的结果的图，图10A是表示对重组62kDa胶原酶对胶原纤维的结合能力的结果，图10B是表示棱菌属来源的胶原酶(Liberase)对胶原纤维的结合能力的结果。

图11是表示实施例8、比较例2的结果的图，是表示清洗后的胶原纤维被残留的胶原酶经时分解后的状况的图。

图12是表示实施例10的结果的图，是表示使重组62kDa胶原酶作用于I型、II型、III型、IV型、V型、和VI型胶原后的电泳像的图。

具体实施方式

本发明的第一方面是一种源于霍氏格里蒙菌的重组胶原酶，其特征在于，是来自于从N末端向C末端包含胶原酶催化结构域、接头区序列和前肽酶C末端结构域的霍氏格里蒙菌源胶原酶的重组胶原酶，至少不包含所述前肽酶C末端结构域。

(1)霍氏格里蒙菌

作为产生胶原酶的微生物，已知棱菌属(Chrostridium sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)等，但本发明使用的胶原酶来自于格里蒙菌属(Grimontia sp.)。这里，霍氏格里蒙菌例如可以作为ATCC No.33564或ATCC No.33565而购入。

(2)霍氏格里蒙菌源胶原酶

霍氏格里蒙菌源胶原酶的氨基酸序列的结构域构造示于图1A。“84kDa胶原酶”所表示的结构域构造是对应于霍氏格里蒙菌源胶原酶的全衣壳序列的结构域构造。从N末端向C末端，氨基酸编号1～87是前体区，氨基酸编号88～615是催化结构域区域(CD)，氨基酸编号616～687是接头区，氨基酸编号688～749是PPC结构域区域(PPC)。由767个氨基酸构成，分子量是84kDa。作为霍氏格里蒙菌源胶原酶的一例，霍氏格里蒙菌1706B株的胶原酶的氨基酸序列示于序列号1，完整编码区的DNA序列示于序列号2。这里，判明了所述前体区是分泌信号序列。只不过，不明确分泌信号序列是否是在翻译的任一阶段中脱离。本发明中，将具有前体区的胶原酶和缺失前体区的胶原酶两者作为霍氏格里蒙菌源胶原酶。缺失前体区的霍氏格里蒙菌源胶原酶的分子量是74kDa。该结构域构造作为“74kDa胶原酶”而示于图1A。

(3)源于霍氏格里蒙菌的重组胶原酶

本发明的源于霍氏格里蒙菌的重组胶原酶来自于霍氏格里蒙菌。其结构域构造只要是至少不含PPC的构造即可。例如，就所述图1A的84kDa胶原酶所示的结构域构造而言，是氨基酸编号688以后的序列缺失，从N末端向C末端由前体区、CD、接头区构成的重组胶原酶。还可以是缺失前体区，由CD和接头区形成的重组胶原酶。如后述的实施例所示，确定了即使缺失PPC也能发挥出高的胶原酶活性，且胶原酶活性稳定。进而，本发明的霍氏格里蒙菌来源的重组胶原酶，如后述实施例所示，清洗后的胶原酶活性降低，细胞障碍降低。

本发明的霍氏格里蒙菌来源的重组胶原酶的接头区也可以是其氨基酸序列的一部分缺失的接头片段。本发明中的“接头片段”，意味着接头区的任一酰胺键被切断后的物质。例如，图1A的84kDa胶原酶所示的结构域构造中，第616～687的接头区的任一的酰胺键被切断后的构造。图1A的“重组62kDa胶原酶”是具有由第616～646的31个氨基酸形成的接头片段的例子，图1A的“重组60kDa胶原酶”是具有由第616～624的9个氨基酸形成的接头片段的例子。

所述接头片段的C末端起第3个氨基酸残基优选是甘氨酸。C末端起第3个氨基酸残基是甘氨酸的重组胶原酶，如后述的实施例所示，胶原酶活性的稳定性优异。所述接头区，如序列号1所示，包含由-G₁-X₁-Y₁-G₂-X₂-Y₂-(式中，G₁和G₂表示甘氨酸，X₁、Y₁、X₂和Y₂各自表示可以相同也可以不同的氨基酸残基。)表示的氨基酸序列。接头区如果在所述氨基酸序列的Y₁和G₂之间被切断，则C末端起第3个氨基酸成为甘氨酸。

为了方便，图1A所示的“84kDa胶原酶”的接头区的氨基酸序列的一部分示于图1B。“60kDa”表示“重组60kDa胶原酶”的C末端，“62kDa”表示“重组62kDa胶原酶”的C末端。重组60kDa胶原酶的C末端是接头区的由-GDSGAG-表示的序列的S与G之间被切断了的胶原酶，重组62kDa胶原酶是由-GNTGLP-表示的序列的T与G之间被切断了的胶原酶。其结果是，C末端起第3个氨基酸残基均成为甘氨酸。这里，所述接头区中的所述-G₁X₁Y₁G₂X₂Y₂-中的切断，如图1B所示，也可以是第637与第638之间、第642与第643之间被切断了。

本发明的重组胶原酶的C末端优选为由所述-G₁-X₁-Y₁-G₂-X₂-Y₂-(式中、G₁和G₂表示甘氨酸，X₁、Y₁、X₂和Y₂各自表示可以相同也可以不同的氨基酸残基。)表示的氨基酸序列的Y₁与G₂之间被切断了的接头片段。这是因为，具有Y₁与G₂之间被切断了的接头片段的重组胶原酶的比活性经历长时间也是稳定的。因此，C末端，例如优选是-GDS、-GNE、-GES和-GNT中的任一种。图1B所示的序列中，如果所述氨基酸序列的Y₁与G₂之间被切断，则C末端成为上述序列。

将缺失所述前体区和PPC、具有规定的接头片段、氨基酸编号第88～第624的氨基酸序列的重组60kDa胶原酶的氨基酸序列示于序列号3，氨基酸编号第88～第646的氨基酸序列的重组62kDa胶原酶的氨基酸序列示于序列号4。进而，将具有从84kDa胶原酶缺失前体区后的氨基酸编号第88～第767的氨基酸序列的胶原酶设为74kDa胶原酶，将其氨基酸序列示于序列号5。

本发明的重组胶原酶的保存稳定性优异的理由不明确。但是，对具有PPC的74kDa胶原酶和没有PPC的重组胶原酶的比活性和稳定性进行了评价，由于74kDa胶原酶具有更高的比活性，因此存在PPC自身有胶原结合能力，辅助CD的胶原酶活性的可能性。可以推定：本发明的重组胶原酶，通过缺失辅助胶原酶活性的PPC，胶原酶活性稳定，且增加了通过清洗而从组织分离的分离性。这里，本发明的重组胶原酶，若缺失PPC，则也可以是缺失接头区的酶。

(4)重组胶原酶的制造方法

作为制备本发明的重组胶原酶时的转化用DNA，是至少将对应于CD的氨基酸序列编码的DNA，更优选是将包括CD和接头区的一部分的氨基酸序列编码的DNA。进而，也可以是在N末端侧具有对应于前体区的氨基酸序列的DNA。接头区的C末端可以优选使用由接头区序列中所含的-G₁X₁Y₁G₂X₂Y₂-表示的序列的Y₁与G₂之间被切断了的序列。作为能够用于制作不含PPC、C末端起第3个是甘氨酸的重组胶原酶的DNA，可以使用编码下述(I)所示的氨基酸序列的DNA。

式(I)：

AVEQCDLSQFQTTSSNQLMAAIRQQGASCVNALFSADTGVQEAAFSSNHMYNVAQYTRTLAQQYAGGGSDELEALYLYLRAGYYAEFYNSNITFLSWVTPAVKGAVDAFVQNAHFYDNGDAHGKVLNEVIITMDSAGLQHAYLDVVTQWLTRWNAQYAEHWYMRNAVNGVFTLLFGGQWNNQYTSLIGEQTALVTALQAFALDRTKVNSPTEFMAANAARELGRLARYTDATIAPKVTEGLTAIFGQYPSYGDGDAIWLGAADTASYYADCSQFNICGFEDALRDAALNQTFICSDTIKIRSQDMSQAQHLAACDKMAYEESFFHTTLETGNQPVADDHNTQLQVNIFNSDTDYGKYAGPIFGIDTNNGGMYLEGNPANVGNIPNFIAYEASYANPDHFVWNLEHEYVHYLDGRFNMYGDFGTPTELVVWWSEGVAEYVSRVNDNPQAIATIQDGSTYTLAQVFDTTYDGFDVDRIYRWGYLAVRFMFERHPDEVQRMLSATRQGRWAEYKAIISGWANQYQSEFAQW-X

其中，X是由TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT或TEALAKGDS表示的多肽。序列号3是X为TEALAKGDS时的氨基酸序列，序列号4是X为TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT时的氨基酸序列。这里，上述式所使用的字母表示以下的氨基酸。A:丙氨酸、C:半胱氨酸、D:天冬氨酸、E:谷氨酸F：苯丙氨酸、G：甘氨酸、H:组氨酸、I:异亮氨酸、K:赖氨酸、L:亮氨酸、M:蛋氨酸、N:天冬酰胺、P:脯氨酸、Q:谷氨酰胺、R:精氨酸、S:丝氨酸、T:苏氨酸、V:缬氨酸、W:色氨酸、Y:酪氨酸。

为了制备本发明的重组胶原酶，制备包含将上述氨基酸序列编码的DNA的重组载体，在所述重组载体进行转化，制备具有胶原酶活性的宿主细胞，培养所述宿主细胞而使其产生具有胶原酶活性的基因产物即可。这样的重组蛋白质的制造方法可以使用基因工程的技术来进行。例如，从霍氏格里蒙菌的基因组文库中选择含霍氏格里蒙菌源胶原酶基因的克隆体，在将该克隆体作为模板而编码所述序列号3、序列号4的DNA片段的5’侧附加Nco I位点，在3’侧附加Hind III位点，通过Expand High Fidelity PCR System(罗氏)进行扩增，将扩增后的片段通过Nco I-Hind III进行处理回收，将回收后的该DNA片段插入质粒载体等来制备重组质粒，使用它来转化例如桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)HPD31-SP3株等，制作桥石短芽孢杆菌重组体。或者，也可以将在以含霍氏格里蒙菌源胶原酶基因的克隆体作为模板，在编码所述序列号3、序列号4的DNA片段的两端，附加了与插入的直链状表达载体的两末端相同的15碱基对的序列的DNA片段进行制备和扩增，将该扩增后的DNA片段和直链状表达载体混合后，用新Tris-PEG法导入桥石短芽孢杆菌HPD31-SP3株等来制作重组质粒和重组体。如果将如此得到的桥石短芽孢杆菌重组体进行培养，则可以使培养上清中产生霍氏格里蒙菌源胶原酶基因产物。

从培养物中采集和纯化作为目标物质的重组胶原酶的方法，可以按照一般的酶的采集以及纯化手段来进行。例如，通过将培养物离心或过滤等将菌体分离，使用通常的分离手段例如基于有机溶剂沉淀法、盐析、超滤膜进行的浓缩等，通过柱色谱等从该培养滤液中进行纯化的方法。

另外，本发明的源于霍氏格里蒙菌的重组胶原酶，可以从用事前不含前体区的DNA转化后的宿主细胞生产重组胶原酶，也可以从用含前体区的DNA转化后的宿主细胞产生重组胶原酶，在翻译中或翻译后使前体区脱离。

(5)细胞分离用酶剂

用本发明的制造方法得到的重组胶原酶，可以与以往的胶原酶同样地使用，例如可以作为细胞分离用酶剂来使用。作为从摘出脏器分离细胞的对象，有胰岛、肝脏、心脏、肺、肾脏、脾脏、肾上腺、肌肉之外、甲状腺、唾液腺、腮腺腺胞、乳腺组织等腺组织、骨、软骨等骨组织、内皮细胞、上皮细胞、脂肪组织、纤维芽细胞等。不限于摘出组织，在胶原培养基内培养的培养细胞的分离中也是合适的。特别是本发明所得的重组胶原酶，由于比活性是稳定性的，因此可以适合作为用于从摘出的胰脏脏器分离胰岛的细胞分离用酶剂来使用。如后述的实施例所示，对清洗组织的胶原酶活性低，细胞损伤少。

本发明使用的细胞分离用酶剂中可以进一步含有金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等其他成分。作为金属蛋白酶，有嗜热菌蛋白酶、分散酶(dispase)、源于梭菌蛋白酶的中性蛋白酶等。作为丝氨酸蛋白酶，有胰蛋白酶、弹性蛋白酶等，作为半胱氨酸蛋白酶，有木瓜凝乳蛋白酶等。

(6)细胞分离方法

在摘出的脏器、动物组织中添加本发明的细胞分离用酶剂，培养预定时间。若将摘出物用添加有上述细胞分离用酶剂、进而在添加有其他成分的培养液中培养，则可以将所述摘出组织的细胞外基质、细胞间结合分离，分离出细胞。从组织分离出的细胞浮游在培养液中的情况下，通过过滤、离心等从培养液回收分离出的细胞即可。

本发明中，使用胰脏脏器作为摘出脏器，可以将胰岛分离。胰岛通过胶原与胰脏内的其他组织结合，因此通过用胶原酶培养，可以将胰岛从其他组织游离。例如，从摘出的胰脏脏器的胰管注入本发明的细胞分离用酶剂，培养预定时间。培养时间根据使用的组织的状态、细胞分离用酶剂中所含的重组胶原酶量等来适当选择即可。胰岛比其他组织轻，因此可以在培养后通过密度梯度离心分离法等进行纯化。另外，不限于胰岛，可以适合用于肝脏、心脏、肺、肾脏、脾脏、肾上腺、肌肉之外、甲状腺、唾液腺、腮腺腺胞、乳腺组织等腺组织、骨、软骨等骨组织、内皮细胞、上皮细胞、脂肪组织、纤维芽细胞等任一的细胞分离。

实施例

下面，举出实施例来具体说明本发明，但这些实施例对本发明没有任何限制。

(实施例1)

将含霍氏格里蒙菌源胶原酶的完整编码区的基因的杆粒pCC1BAC-2(保藏编号；NITE BP-00739：保藏日(原保藏)；2009年4月28日：保藏机构的名称；独立行政法人产品评定技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD)：保藏机构地址；日本国2920818千叶县木更津市上总镰足2-5-8)作为模板，在由序列号5的肽序列诱导的该胶原酶基因的部分序列(长度2040bp)的5’侧附加Nco I位点，在3’侧附加Hind III位点，通过Expand High Fidelity PCR System(罗氏)进行扩增。PCR反应中使用下述引物组。引物的序列之中，下划线表示制限酶位点。

Fwd:AAACCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(序列号6)

Rvs:AAAAAGCTTTTACTGACGACACTGGTTAC(序列号7)

对扩增后的片段用Nco I-Hind III进行处理回收，将回收后的该DNA片段插入质粒载体pNY326的克隆位点，制作pNY326-Col.74。用该重组质粒转化桥石短芽孢杆菌HPD31-SP3株，制作重组体。

另外，将含霍氏格里蒙菌源胶原酶的完整编码区的基因的杆粒pCC1BAC-2(NITE BP-00739)作为模板，使用下述引物组利用PCR反应，将由所述序列号3的肽序列诱导的该胶原酶基因的部分序列(长度1611bp)分离。引物的序列之中，下划线表示与直链状载体两端的序列相同的序列。

引物：

Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(序列号8)

Rvs:CATCCTGTTAAGCTTACTGTCGCCCTTCGCCAGC(序列号9)

另外，使用下述引物组利用PCR反应来制备直链状表达载体pNY326。引物的序列之中，用下划线表示与插入的DNA片段两端的序列相同的序列。

引物：

Fwd:AAGCTTAACAGGATGCGGGG(序列号10)

Rvs:AGCGAAAGCCATGGGAGCAA(序列号11)

通过上述，将编码序列号3的重组60kDa胶原酶的DNA片段(1611bp)和直链状表达载体pNY326以摩尔比2：1进行混合后，用新Tris-PEG法导入感受态细胞并且将桥石短芽孢杆菌HPD31-SP3株转化，制作质粒pNY326-Col.60和重组体。

同样地进行操作，使用以下引物组，利用PCR反应将由上述序列号4的肽序列诱导的该胶原酶基因的部分序列(长度1677bp)分离。引物的序列之中，用下划线表示与直链状载体两端的序列相同的序列。

引物：

Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(序列号12)

Rvs:CATCCTGTTAAGCTTAGGTATTACCACCAGATTCA(序列号13)

接着，进行与上述同样的操作来制备直链状表达载体pNY326，制作包含编码序列号4的重组62kDa胶原酶的DNA片段(1677bp)的质粒pNY326-Col.62和重组体。通过上述操作，制作3种桥石短芽孢杆菌重组体。

将所述3种桥石短芽孢杆菌重组体各自在100ml的2SYN培养基(20g/L葡萄糖、40g/L Bacto大豆胨、5g/L Bacto酵母粉、0.15g/L CaCl₂·2H₂O、50μg/mL新霉素)中于30℃培养48小时。将含霍氏格里蒙菌源胶原酶基因产物的培养液离心，将得到的上清用0.2μm过滤器过滤灭菌。接着，将上清用HPLC系统纯化，分级。HPLC系统通过使用了DEAE-Sepharose的阴离子交换柱色谱进行。将各培养上清供于柱而使胶原酶吸附后，使NaCl浓度从0.2至1M连续地上升，同时使50mM的Bis-Tris HCl缓冲液(pH7)流过，使胶原酶分离溶出。将溶出液按溶出顺序每次4ml地进行采集，分级。然后，通过超滤除去30kDa以下的物质，用含0.2M的NaCl和5mM的CaCl₂的4℃的50mM Tris HCl缓冲液进行透析，得到精制后的74kDa胶原酶、重组62kDa胶原酶和重组60kDa胶原酶。

精制酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图示于图2。74kDa表示74kDa胶原酶，62kDa表示重组62kDa胶原酶，60kDa表示重组60kDa胶原酶。

(实施例2)

按下述方法测定实施例1中所得的74kDa胶原酶、重组62kDa胶原酶和重组60kDa胶原酶的比活性的经时变化。测定结果示于图3。74kDa在刚刚纯化后为18,000(U/mg)的活性，但在24小时后降低至11,500(U/mg)，活性经时降低。与此相对，重组62kDa胶原酶和重组60kDa胶原酶从刚刚纯化后到24小时时，均在12,000(U/mg)前后变化，胶原酶活性稳定。

胶原酶的比活性测定：在包含用荧光标记后的I型胶原(FITC-胶原)0.05％、5mM的CaCl₂、200mM的NaCl的50mM的Tris HCl(pH7.5)中混合胶原酶0.5μg，加热到30℃。30分钟后，添加EDTA使酶反应停止。在反应液中添加含有等量的70％乙醇的50mM的Tris HCl(pH9.5)，提取分解物，用荧光分光光度计测定荧光强度。图中1单位(U)的意思是将胶原1μg在30℃用1分钟进行分解的活性。

(实施例3)

对于将实施例1中所得的重组62kDa胶原酶以温度4℃保存时的比活性的经时变化进行了评价。第0天的比活性值设为100％时的相对值示于图4。如图4所示，在100天的期间中能够稳定地维持高的比活性。这里，重组60kDa胶原酶也显示出同样的稳定性。

(实施例4)

使用实施例1中所得的重组62kDa胶原酶进行了胰脏消化实验。从小鼠分离出胰脏，从胰管向HBSS缓冲液1ml中注入包含重组62kDa胶原酶0.00625～0.20mg和嗜热菌蛋白酶(罗氏应用科学公司制、商品名“LiberaseC/T”的内包物)0.012mg的酶液，在37℃孵育15分钟。之后，对通过了开孔1mm筛的部分(分解组织)和残留在筛上的(非分解组织)的蛋白量进行测定。依赖于酶液中所含的重组62kDa胶原酶的浓度，分解组织量增加，与其相伴，非分解组织量降低。结果示于图5。如图5所示，重组62kDa胶原酶的浓度为0.05mg/ml，反应达到平稳期。

(实施例5)

与实施例4同样地，使用实施例1中所得的重组62kDa胶原酶进行胰脏消化实验，测定分解得到的胰岛的个数，评价IEQ(胰岛当量(Islet Equivalent)：将直径为150μm的胰岛规定为1的、表示胰岛的体积的国际单位)。将重组62kDa胶原酶的浓度的差异引起的胰岛个数的结果示于图6A，将IEQ的结果示于图6B。另外，分离出的胰岛的光学显微镜照片示于图7。

(比较例1)

代替实施例1中所得的重组62kDa胶原酶，使用棱菌属来源的胶原酶(罗氏应用科学公司制、商品名“LiberaseC/T”)，除此以外，进行与实施例5同样的操作，评价胰岛的个数和IEQ。将结果一并记载于图6A、图6B。实施例1中所得的重组62kDa胶原酶，与以往的市售品同样地，可以从胰脏组织分离出胰岛。

(实施例6)

将实施例5中所得的胰岛移植到STZ诱导糖尿病小鼠的肾皮膜下，经时地测定血糖值。在未移植胰岛的对照组(n＝3：STZ-1、STZ-2、STZ-3)中，显示高血糖值，与此相对，胰岛移植组(n＝5：STZ/islet-1～STZ/islet-5)中，移植后血糖值很快降低至正常水平。移植后第39天摘出移植了胰岛的肾脏，则血糖值再次上升。结果示于图8A。摘出的胰岛移植肾及其局部放大照片示于图8B的左端的上下2行。另外，进行了摘出了胰岛移植肾的苏木精-伊红染色(H&E染色)时，在肾皮膜下对胰岛进行确认，进而用抗胰岛素抗体将胰岛染色(图8B)。这些显示：通过实施例1中所得的重组62kDa胶原酶，可以分离出保持了胰岛功能的胰岛。

(实施例7)

使用实施例1中所得的重组62kDa胶原酶进行了肝脏消化实验。将麻酔后的大鼠肝脏在HBSS缓冲液灌流下脱血而除去钙，接着在肝脏内将重组62kDa胶原酶0.05mg/ml和嗜热菌蛋白酶0.01mg/ml灌流10分钟而添加钙后，摘出肝脏。将摘出肝脏进行冰冷却，用手术刀切碎，用纱布和滤网过滤。除去死细胞后将肝脏细胞离心回收。肝细胞的相差显微镜照片示于图9。将该肝细胞培养7天后，生存率为98％。

(实施例8)

对实施例1中所得的重组62kDa胶原酶与胶原纤维的结合能力和清洗后残留于胶原纤维的胶原酶活性进行评价。

将猪皮胶原纤维5mg和400μl的含0.2M的NaCl、5mM的CaCl₂的Tris HCl缓冲液(pH7.5)加入内置过滤器的离心柱(spin column)，以10,000rpm进行2分钟的离心，用所述缓冲液清洗胶原纤维，进行总共5次的离心分离。

将清洗液废弃，向所述离心柱的过滤器上的胶原纤维中添加酶混合液(包含重组62kDa胶原酶0.2mg/ml、卵白蛋白0.2mg/ml、邻二氮杂菲4mM、NaCl0.2M、CaCl₂5mM的Tris HCl缓冲液(pH7.5))100μl，于4℃静置30分钟，使重组62kDa胶原酶与胶原纤维结合。

接着，以10,000rpm进行2分钟的离心分离，将所述过滤器上的胶原纤维与通过过滤器的混合液分离。将该混合液的一部分用SDS-PAGE分析。另外，为了比较，不添加猪皮胶原纤维、进行与上述同样的处理而得到的混合液也用SDS-PAGE分析。结果以图10A的“混合液/胶原纤维“-”、“+””表示。就重组62kDa胶原酶的条带而言，“+”为变淡，“-”为变浓。重组62kDa胶原酶如果与胶原纤维混合，则表示与胶原纤维结合。这里，图10中，M表示标记物。

接着，将离心柱内的胶原酶所结合的胶原纤维回收到2ml管中，加入包含0.2M的NaCl、5mM的CaCl₂、0.1mg/ml的胶原肽、4mM的邻二氮杂菲的Tris HCl缓冲液(pH7.5)，于4℃静置10分钟后，以10,000rpm进行2分钟的离心，用所述胶原肽含有缓冲液清洗沉淀物，进行总共5次的离心分离。5次清洗上清分别用SDS-PAGE分析。结果以图10A的“酶结合胶原纤维的胶原肽清洗上清/1，2，3，4，5”表示。数值表示上清的清洗次数。清洗第1次至第5次期间均显示为：重组62kDa胶原酶的条带淡，结合于胶原纤维的重组62kDa胶原酶即使用胶原肽清洗也残留在胶原纤维中。

另外，向通过离心分离而得的胶原酶所结合的胶原纤维中，添加500μl的包含0.2M的NaCl、5mM的CaCl₂、2μg/ml的ZnSO₄·7H₂O的Tris HCl缓冲液，于37℃静置。静置开始时、开始后1小时、3小时、5小时、7小时、17小时、20小时后目视观察。聚集在2ml管底部的胶原纤维的经时变化示于图11。另外，静置20小时后的上清用SDS-PAGE分析。SDS-PAGE的结果示于图10A的“清洗后纤维上清/20h”。静置20小时后的上清，出现浓的胶原分解物的条带，与胶原纤维结合的胶原酶表现出即使清洗也残留于胶原纤维、发挥胶原酶活性。这里，“清洗后纤维上清/20h”中，与胶原分解物的条带一同出现了浓的62kDa的条带，显示胶原分解后胶原酶迅速分离。

(比较例2)

代替重组62kDa胶原酶，使用同量的棱菌属来源的胶原酶(罗氏应用科学公司制、商品名“LiberaseC/T”)，除此以外，与实施例8同样地进行操作。结果示于图10B和图11。

如图10B所示，存在胶原纤维的“+”的柱中，Liberase(胶原酶)的条带淡，Liberase与胶原纤维结合的情况，用胶原肽清洗胶原酶结合胶原纤维时的清洗上清在清洗1～5期间，Liberase的条带淡，胶原酶即使用胶原肽清洗也残留于胶原纤维的情况等，显示出与重组62kDa胶原酶相同的倾向。

另一方面，如图11所示，观察到残留于胶原纤维的胶原酶的酶活性在重组62kDa胶原酶和Liberase之间而并不相同。图11中，残留酶的胶原酶活性越高，胶原纤维量降低越快。关于胶原纤维量降低的程度，重组62kDa胶原酶的比Liberase低。胰岛分离等处理中，通过残留酶而产生细胞障碍，因此优选分离出胰岛后，酶不残留、即使存在残留酶胶原酶活性也降低。如图10A和图10B所示，重组62kDa胶原酶和Liberase与胶原纤维结合，即使用胶原肽将其清洗5次，其一部分也残存于胶原纤维上。但是，残留的酶的活性与两者并不相同，与Liberase相比，重组62kDa胶原酶的胶原酶活性降低。虽然详细原因不明确，但推定一个原因是重组62kDa胶原酶与Liberase不同，没有与胶原纤维结合的“CBD”。由于不存在“CBD”，因此与胶原纤维的结合不紧密，基于残留酶的胶原酶活性可能会产生差异。

(实施例9)

对于实施例1中所得的重组62kD胶原酶和棱菌属来源的胶原酶(罗氏应用科学公司制、商品名“LiberaseC/T”)的、对荧光标记后的I型胶原(以下、称为FITC-胶原。)和合成基质N-(3[2-呋喃]丙烯酰基)-Leu-Gly-Pro-Ala(以下、称为FALGPA。)的分解活性进行评价。

FITC-胶原使用包含0.2M的NaCl、5mM的CaCl₂的50mM的Tris-HCl(pH7.5、30℃)缓冲液，FALGPA使用包含0.4M的NaCl、40mM的CaCl₂的50mM二甲苯胺(pH7.5、30℃)。以FITC-胶原作为基质时，添加上述胶原酶0.5μg，以FALGPA作为基质时，添加重组62kD胶原酶1.0μg、或LiberaseC/T2.5μg。用酶标仪对FALGPA进行检测和定量，评价FALGPA分解活性。在反应体系1ml中，1mg酶每1分钟分解1μmole的所述肽的活性作为比活性1U/mg而算出，将得到的比活性示于表1。重组62kD胶原酶不仅能够分解胶原，而且对合成基质FALGPA的分解活性优异，因此有不仅对胶原而且对明胶的分解性也优异的启示。

[表1]

(实施例10)

使用实施例1中所得的重组62kDa胶原酶，评价针对I型、II型、III型、IV型、V型、和VI型胶原的活性。向0.5mg/ml的上述胶原中添加溶解于含有0.2M的NaCl和5mM的CaCl₂的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中的1μg/ml的胶原酶，在30℃下培养，培养开始时、1小时后、3小时后、5小时后取样，通过电泳进行分析。另外，为了进行比较，使用棱菌属来源的胶原酶(罗氏应用科学公司制、商品名“LiberaseC/T”)进行同样的操作。结果示于图12。这里，图12中，62kDa表示使用了重组62kDa胶原酶的柱，Liberase表示使用了棱菌属来源的胶原酶的柱。

I型胶原中，由α1(I)和α2(I)的3小时后、5小时后的条带的消失的程度，推定与Liberase相比，重组62kDa胶原酶更迅速地分解I型胶原。该倾向在II型、III型、IV型、V型、VI型胶原中也同样被观察到。特别是IV型和V型胶原，相比使用重组62kDa胶原酶反应3小时或5小时反应后的条带变淡，在Liberase中，条带没有消失。关于VI型胶原，相比使用重组62kDa胶原酶使其反应72小时后的条带变淡，在Liberase中的条带没有消失。有重组62kDa胶原酶对于Liberase不容易分解的胶原也可能能够分解的启示。

在不脱离本发明的广义精神和范围的情况下，本发明能够进行各种设施方式和变形。另外，上述实施方式用于说明本发明，不限定本发明的范围。即，本发明的范围不是实施方式，而是如权利要求书所示。而且，权利要求书的范围以及与其同等发明意义范围内实施的各种变形都视为本发明的范围。

本发明以2014年3月6日提出申请的日本国特愿2014-044205号为基础。本说明书中将日本国特愿2014-044205号的说明书、权利要求书、附图全部作为参照而引入。

工业上的可利用性

根据本发明，可以提供比活性稳定的重组胶原酶和含该重组胶原酶的细胞分离用酶剂，是有用的。

保藏编号

NITE BP-00739