通过不对称扩增确定初始模板浓度的定量方法与流程

技术特征：

1.用于在核酸扩增反应中定量核酸的方法，所述方法包括：

提供模板核酸和第一和第二扩增引物，其中所述第一引物以有限的量存在；

在合适的条件下进行不对称核酸扩增反应，从而在反应的初始阶段产生双链核酸产物，并且一旦限制性引物耗尽，在反应的后续阶段产生单链核酸产物；

提供对所述单链核酸产物特异的探针，并让所述探针与单链产物杂交；

一旦反应完成后续阶段，通过解链曲线分析的方式检测产生的双链核酸产物和单链核酸产物的相对量；

确定双链产物峰高度与单链产物峰高度的比例是否小于1；并且

如果所述比例小于1，则基于双链产物峰高度与单链产物峰高度的比例定量起始模板的量。

2.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是DNA或cDNA。

3.权利要求1或2所述的方法，其中将单链产物的量相对双链产物的量标准化。

4.任一前述权利要求所述的方法，其中如果双链产物与单链产物的比例大于1，则放弃单链产物的量。

5.任一前述权利要求所述的方法，其中，如果双链产物与单链产物的比例小于1，则所述方法还包含使用所述比例作为CT的指示物。

6.任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括通过解离或结合曲线分析确定双链和单链产物的量。

7.任一前述权利要求所述的方法，所述方法包括向所述反应引入可检测标签并且检测所述标签，以确定单链和双链核酸产物的相对量。

8.权利要求7所述的方法，其中所述标签是优选结合双链核酸的荧光染料；优选Green或相关染料。

9.权利要求7所述的方法，其中所述可检测标签包含结合到所述限制性引物中的标签。

10.权利要求7，8或9所述的方法，其中所述标签还包含结合到所述探针中的荧光染料。

11.任一前述权利要求所述的方法，其进一步包含下述步骤：预确定限制性引物的量，以提供预确定的双链核酸产物的量。

12.权利要求11所述的方法，其中预确定所述限制性引物的量以提供1∶15至1∶5的双链产物与单链产物的比例。

13.任一前述权利要求所述的方法，其中所述探针是可以用于区分靶序列的等位基因的探针；并且所述方法还包括检测所述探针与所述单链产物的杂交以确定所述模板核酸的基因型的步骤。

14.权利要求13所述的方法，其中所述探针以比其与第二等位基因杂交所用的解链温度低的解链温度(Tm)与第一等位基因杂交。

15.权利要求13所述的方法，其中所述探针具有由接头核酸序列分隔的锚区域和报告区域，所述锚区域和报告区域具有不相关的解链温度。