新型多肽的制作方法

本公开内容涉及一种复合物，所述复合物包含对白介素-6(以下被称为IL-6)具有亲和力的工程化多肽以及抗体或其抗原结合片段，其中对IL-6具有亲和力的所述工程化多肽属于包含序列EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29的一类工程化多肽。本公开内容还涉及所述复合物作为治疗剂的用途。背景炎症是由细胞因子驱动的先天免疫系统的响应，以破坏例如病原体和损伤的细胞。在一些疾病状况诸如类风湿关节炎(RA)和克罗恩病中，炎性系统的调节被损害，导致组织损伤。其中研究最多的炎症诱导物是细胞因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)。对于临床应用，不同的TNF抑制剂是可用的，诸如抗TNF单克隆抗体阿达木单抗和英夫利昔以及TNF受体2-Fc融合物依那西普与IL-6受体α(IL-6Rα)而非细胞因子本身结合的抗体托珠单抗已被批准用于IL-6相关紊乱的临床使用。用于治疗RA的IL-6或TNF阻断抗炎治疗策略之间的选择并非不重要。而抗TNF策略到目前为止已被认为是标准(Taylor和Feldmann,2009,NatureReviewsRheumatology5:578-582)，最近在RA患者中的并列单一疗法阶段IV试验(shoulder-to-shouldermonotherapyphaseIVtrial,ADACTA)显示托珠单抗在减少RA相关症状方面比阿达木单抗更有效(Gabay等,2013,Lancet381:1541-1550)。人IL-6由具有21kDa的分子量的184个氨基酸的多肽单链组成，但是，可变化的糖基化模式导致在21-26kDa之间变化的大小。IL-6由很多种细胞类型分泌，包括T细胞、B细胞、单核细胞、成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞和角质细胞。下游信号传导引起从急性炎症向获得性免疫或慢性炎性疾病的转换。IL-6信号传导及其调节是复杂的并涉及很多因子和机制。IL-6经由经典IL-6信号传导途径传导信号，所述经典IL-6信号传导途径也被称为顺式信号传导途径(cis-signalingpathway)，或经由反式信号传导途径(trans-signalingpathway)传导信号。在经典IL-6信号传导途径中,循环IL-6与膜结合的IL-6受体α(IL-6Rα)结合，然后招募膜锚定的gp130辅助受体，导致三元复合体的形成。该复合体随后与第二毗邻三元复合体形成二聚体，导致经由gp130部分的信号转导(Boulanger等,2003,Science300(5628):2101-2104)。在循环中，IL-6还可与IL-6Ra的可溶胞外域结合存在。此类复合体负责反式信号传导机制，所述反式信号传导机制涉及表达辅助受体gp130但缺乏IL-6Ra的任何细胞的IL-6依赖性激活(Chalaris等,2011,EurJCellBiol90(6-7):484-494；Assier等,2010,JointBoneSpine77(6):532-6)。已暗示反式信号传导途径或促炎途径是与疾病状况最相关的途径，并因此对阻断所述途径是高度感兴趣的。相反，经典途径被认为负责重要的抗炎过程和再生过程(Scheller等,2011,BiochimBiophysActa1813(5):878-888)。除了托珠单抗之外，其他的药物候选物也正被开发,以解决不同的IL-6触发途径。这些药物候选物包括抗体CNTO136(sirukumab)(Xu等,2011,BrJClinPharmacol72(2):270-281；Zhuang等,2013,IntJClinPharmacolTher51(3):187-199)以及MEDI5117(Finch等,2011,JMolBiol411(4):791-807)，两者均与IL-6细胞因子自身以及旨在选择性地阻断反式信号传导途径的gp130-Fc融合物CR5/18结合(Kopf等,2010,NatRevDrugDiscov9(9):703-718；Chalaris等,2012,DigDis30(5):492-499)。最近，在开发具有与多于一种抗原结合的能力的抗体方面已取得显著的进展，例如通过工程化互补决定区(CDR)以在单个抗体组合位点中满足两种抗原(Bostrom等,2009,Science323(5921):1610-1614；Schaefer等,2011,CancerCell20(4):472-486),经由使用工程化的Fc单元构建异质二聚体抗体(Carter,2001,JImmunolMethods248(1-2):7-15；Schaefer等,2011,ProcNatlAcadSciUSA108(27):11187-11192)以及经由将辅助识别单元基因融合至全长抗体的轻链或重链的N末端或C末端(Kanakaraj等,2012,MAbs4(5):600-613；LaFleur等,2013,MAbs5(2):208-218)。因此，对确保开发通过阻断与炎症和自身免疫紊乱有关的多于一种因子治疗炎症和自身免疫紊乱的新模式存在高度未被满足的需求，所述自身免疫紊乱诸如例如多种形式的类风湿关节炎和银屑病。具有双重亲和力或甚至多重亲和力的剂，诸如对IL-6并对与炎症和自身免疫紊乱有关的一种或更多种另外的因子具有高亲和力的剂的批准是高度重要的。发明概述本公开内容的目的是提供可例如被用于治疗应用的新型多特异性剂，诸如双特异性剂。本公开内容的目的是提供对IL-6和至少一种另外的抗原具有亲和力的新型多特异性剂，诸如双特异性剂。本公开内容的目的是提供允许靶向多种形式的炎性疾病和自身免疫疾病同时减轻当前疗法的以上提到的和其他缺点的有效疗法的分子。对于领域技术人员由本公开内容是明显的这些目的和其他目的由如在所附权利要求书中要求保护的和如本文一般性公开的本发明的不同方面来满足。因此，在本公开内容的第一方面，提供了包含至少一种IL-6结合多肽和至少一种抗体或其抗原结合片段的复合物，其中所述IL-6结合多肽包含IL-6结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29其中，彼此独立地，X3选自A、F、H、K、Q、R、S、W和Y；X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W和Y；X11选自A、I、K、L、M、N、R、S、T和V；X16选自N和T；X17选自A、I、T和V；X18选自D、E、G、H、K、N、Q、R、S和T；X20选自I、L、M、R、T和V；X21选自A、S、T和V；X25选自I、M、Q、S、T、V和W；X26选自K和S；X28选自F、L、M和Y；且X29选自D和R；和ii)与在i)中定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。当在本文中用于表示本公开内容的第一方面时，术语“复合物”被意图指两个或更多个相关的多肽链，一个通过如以上定义的其IL-6结合基序的作用具有对IL-6的亲和力，并且另一个为抗体或其抗原结合片段。这些多肽链可各自包含不同的蛋白结构域，并且得到的多蛋白复合物可具有多种功能。“复合物”意图指由共价键连接的如以上定义的两个或更多个多肽，例如通过将其表达为重组的融合蛋白而由共价键连接或通过化学缀合而缔合的两个或更多个多肽链。序列相关的IL-6结合多肽的以上定义基于亲本支架的许多随机多肽变体的统计学分析，所述多肽变体在若干不同的选择实验中针对其与IL-6的相互作用来选择。所鉴定的IL-6结合基序，或“BM”相应于亲本支架的靶结合区域，所述区域构成在三螺旋束蛋白结构域内的2个α螺旋。在亲本支架中，两个BM螺旋的改变的氨基酸残基构成用于与抗体的恒定Fc部分相互作用的结合表面。在本公开内容中，结合表面残基的随机变化和随后的变体选择已将Fc相互作用能力替换为与IL-6相互作用的能力。如技术人员将认识到的，任何多肽的功能诸如本公开内容的多肽的IL-6结合能力取决于多肽的三级结构。因此，对多肽中的氨基酸序列作出微小改变而不影响其功能是可能的。因此，本公开内容包括IL-6结合多肽的修饰的变体，所述变体是IL-6结合特征被保留的变体。以这种方式，本公开内容还包括如本文定义的包含IL-6结合多肽的复合物，所述多肽包含与如i)中定义的多肽具有93％或更大的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可包含与如i)中定义的多肽至少96％同一的序列。例如，属于氨基酸残基的特定功能分组(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可被交换为来自相同功能组的另一个氨基酸残基是可能的。在一些实施方案中，此类变化可在如本文公开的IL-6结合多肽的序列的任何位置中做出。在其他实施方案中，此类变化可仅在非可变位置中，也称为支架氨基酸残基作出。在此类情况中，在可变位置，即序列i)中用“X”表示的位置中的改变不被允许。如在整个说明书中使用的术语“％同一性”可例如如下计算。使用CLUSTALW算法(Thompson等，NucleicAcidsResearch,22:4673-4680(1994))将查询序列与靶序列对齐。在相应于最短的对齐序列的窗口上进行比较。在某些例子中，最短的对齐序列可以是靶序列。在其他例子中，查询序列可构成最短的对齐序列。将每个位置处的氨基酸残基进行比较，并且在靶序列中具有相同的对应物的查询序列中的位置的百分比被报告为同一性％。如本文使用的“Xn”和“Xm”被用于表示如以上定义的序列i)中位置n和m中的氨基酸，其中n和m是表示从所述序列的N-末端计数所述序列内的氨基酸的位置的整数。例如，X3和X7分别表示从序列i)的N-末端起位置3和7中的氨基酸。在根据第一方面的实施方案中，提供了其中序列i)中的Xn独立地选自根据表1的一组可能的残基的复合物。技术人员将领会到Xn可选自所列出的可能的残基组中的任何一个并且该选择独立于Xm中的氨基酸的选择，其中n≠m。因此，表1中所列的位置Xn中的可能残基中的任一个可独立地与表1中所列的任何其他可变位置中的可能残基中的任一个组合。技术人员将领会到表1应被如下解读：在根据第一方面的一个实施方案中，提供了如本文定义的包含至少一种IL-6结合多肽的复合物，其中序列i)中的“Xn”选自“可能的残基”。因此，表1公开了本公开内容的第一方面的若干个特定且个体化的实施方案。例如，在根据第一方面的一个实施方案中，提供了其中序列i)中的X3选自A、H、K、Q、R和Y的复合物，并且在根据第一方面的另一个实施方案中，提供了其中序列i)中的X3选自A、K、Q、R和Y的复合物。为了避免疑问，所列的实施方案在其他实施方案可自由地组合。例如，一个如此组合的实施方案是其中X3选自A、K、R和Y，而X4选自H和K，且X11选自A、I、L和T的复合物。表1：本公开内容的第一方面的实施方案在根据第一方面的一个实施方案中，提供了如本文定义的包含至少一种IL-6结合多肽的复合物，其中在序列i)中，X3选自A、H、K、Q、R和Y；X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、T、V、W和Y；X11选自A、I、K、L、N、S、T和V；X16为T；X17选自A、I、T和V；X18选自D、E、H、K、N、Q、R、S和T；X20选自I、L、M、R和V；X21选自A、S和V；X25选自I、Q、S、T、V和W；X26为K；X28选自F、L、M和Y；且X29为D。在定义包含至少一种IL-6结合多肽的复合物的亚类的更特定的实施方案中，序列i)满足以下11个条件I-XI中的至少6个：I.X3选自K和R；II.X11选自A和L；III.X16为T；IV.X17选自I和V；V.X18选自D和E；VI.X20为M；VII.X21为A；VIII.X25选自S和T；IX.X26为K；X.X28为F；以及XI.X29为D。在根据第一方面的所述复合物的一些实例中，序列i)满足11个条件I-XI中的至少7个。更特别地，序列i)可满足11个条件I-XI中的至少8个，诸如11个条件I-XI中的至少9个，诸如11个条件I-XI中的至少10个,诸如11个条件I-XI的全部。在根据第一方面的复合物的一些实施方案中，所述复合物包含至少一个IL-6结合多肽，其中在序列i)中X17X20X21选自VMA和IMA。在一些实施方案中，序列i)中的X20X21X28为MAF。在一些实施方案中，序列i)中的X17X20X28选自VMF和IMF。在一些实施方案中，序列i)中的X17X21X28选自VAF和IAF。如在以下实验部分中详细描述的，IL-6结合多肽变体的选择已导致鉴定出大量个体IL-6结合基序(BM)序列，所述个体IL-6结合基序(BM)序列构成序列i)的不同实施方案。包含序列i)的所述不同实施方案的复合物构成根据第一方面的复合物的个体实施方案。个体IL-6结合基序的序列相应于图1中展示的SEQIDNO:1-1551中的氨基酸位置8-36。因此，在根据该方面的复合物的一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-1551组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-1502组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-152组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在另一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-150组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在仍然另一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-14组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-5组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于SEQIDNO:1512中从位置8至位置36的序列。在特定的个体实施方案中，序列i)单独地相应于SEQIDNO:1-14中的任一个从位置8至位置36的序列。在本公开内容的一些实施方案中，如以上定义的BM“形成”三螺旋束蛋白结构域“的一部分”。这被理解为意指将BM的序列“插入”进原始三螺旋束结构域的序列中或“移植”在原始三螺旋束结构域的序列上，使得BM替代原始结构域中的相似结构基序。例如，不希望受理论的束缚，BM被认为构成三螺旋束的三个螺旋中的两个，并因此可替代任何三螺旋束内的这种双螺旋基序。如本领域技术人员将认识到的，三螺旋束结构域的两个螺旋被两个BM螺旋的替代必须被进行，以便不影响多肽的基本结构。即，根据本发明的该实施方案的多肽的Cα骨架的整体折叠与其形成部分的三螺旋束蛋白结构域的整体折叠基本上一致，例如以相同顺序具有二级结构的相同元件等。因此，如果根据该方面的该实施方案的多肽具有与原始结构域相同的折叠，根据本公开内容的BM“形成”三螺旋束结构域“的一部分”，意味着共享基本结构特性，例如，导致相似CD光谱的那些特性。本领域技术人员知道相关的其他参数。在特定的实施方案中，如本文中定义的复合物包含至少一个IL-6结合基序(BM)，所述至少一个IL-6结合基序(BM)形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。例如，BM可基本上构成所述三螺旋束蛋白结构域内具有互相连接的环的两个α螺旋。在具体的实施方案中，所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体蛋白的结构域。此类结构域的非限制性实例是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的蛋白A的五个不同的三螺旋结构域，诸如结构域B，及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域是蛋白Z的变体，所述蛋白Z源自葡萄球菌蛋白A的结构域B。在如本文中描述的复合物的一些实施方案中，其中所述IL-6结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分，所述复合物包含至少一个IL-6结合多肽，所述至少一个IL-6结合多肽继而包含结合模块(BMod)，所述结合模块的氨基酸序列选自以下：iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ；其中[BM]为如本文定义的IL-6结合基序，条件是X29为D；Xa选自A和S；Xb选自N和E；Xc选自A、S和C；Xd选自E、N和S；Xe选自D、E和S；Xf选自A和S；以及iv)iv)与由iii)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中可以是有益的是，复合物作为一个整体或复合物的至少一部分诸如IL-6结合多肽在产生和贮存期间以及在体内表现出高的结构稳定性，诸如对异构化、对化学修饰、对物理条件的改变以及对蛋白水解的耐受。因此，在其中如本文公开的IL-6结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分的其他实施方案中，复合物包含至少一个IL-6结合多肽，所述至少一个IL-6结合多肽继而包含结合模块(BMod)，所述结合模块的氨基酸序列选自以下：v)K-[BM]-QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ，其中[BM]为如本文定义的IL-6结合基序，条件是X29为R；Xa选自A和S；Xb选自N和E；Xc选自A、S和C；Xd选自E、N和S；Xe选自D、E和S；Xf选自A和S；以及vi)与由v)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。如以上所讨论的，与以上的氨基酸序列相比，包含不很大程度上影响多肽的三级结构及功能的微小变化的IL-6结合多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如本文定义的复合物包含至少一个IL-6结合多肽，所述至少一个IL-6结合多肽包含序列iv)或vi)，序列iv)或vi)分别与由iii)和v)定义的序列具有至少93％，诸如至少95％，诸如至少97％的同一性。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xa为A。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xa为S。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xb为N。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xb为E。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为A。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为S。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为C。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为E。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为N。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为S。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为D。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为E。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为S。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe选自EE、ES、SE、SD和SS。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为ES。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为SE。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为SD。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xf为A。在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为ND且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为ND且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ND且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为ND且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为SE且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为SE且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为SE且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为SE且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为SD且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为SD且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为SD且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为SD且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为ES且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为ES且Xf为A。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ES且Xf为S。在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为ES且Xf为S。在所述复合物的仍然另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由图1中展示的SEQIDNO:1-1551组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-1502组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-152组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-150组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在仍然另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-14组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-5组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于SEQIDNO:1512中从位置7至位置55的序列。在特定的个体实施方案中，序列iii)单独地相应于SEQIDNO:1-14的任一个中从位置7至位置55的序列。另外，在另外的实施方案中，提供了如本文定义的包含至少一个IL-6结合多肽的复合物，其中所述IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：vii)YA-[BMod]-AP；其中[BMod]是如以上定义的IL-6结合模块；和viii)与由vii)定义的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。可选地，提供了如本文定义的包含至少一个IL-6结合多肽的复合物，其中所述IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：ix)FN-[BMod]-AP；其中[BMod]是如以上定义的IL-6结合模块；和x)与由ix)定义的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。如以上所讨论的，与以上的氨基酸序列相比包含不很大程度上影响多肽的三级结构及功能的微小变化的IL-6结合多肽也落在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，序列viii)和x)可分别与由vii)和ix)定义的序列例如至少92％，诸如至少94％，诸如至少96％，诸如至少98％同一。在一些实施方案中，如本文定义的复合物包含IL-6结合基序，所述IL-6结合基序形成包含选自以下的氨基酸序列的多肽的一部分：ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；以及AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；其中[BM]为如以上定义的IL-6结合基序。在一个实施方案中，如本文定义的复合物包含IL-6结合基序，所述IL-6结合基序包含选自以下的氨基酸序列：xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；其中[BM]为如以上定义的IL-6结合基序；以及xii)与xi)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，如本文定义的复合物包含IL-6结合基序，所述IL-6结合基序包含选自以下的氨基酸序列：xiii)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；其中[BM]为如以上定义的IL-6结合基序；以及xiv)与xiii)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。再次，与以上的氨基酸序列相比包含不很大程度上影响多肽的三级结构及功能的微小变化的多肽也落在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，序列xii)和xiv)可分别例如与由xi)和xiii)定义的序列至少91％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少96％，诸如至少98％同一。此类多肽中的序列xi)可选自由SEQIDNO:1-1551组成的组。在另一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-1502组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-152组成的组。在另一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-150组成的组。在仍然另一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQIDNO:1-14组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由从SEQIDNO:1-5组成的组。在一个实施方案中，序列xi)是SEQIDNO:1512。在特定的个体实施方案中，序列xi)单独地为SEQIDNO:1-14中的任一个。技术人员将理解，可对如本文定义的IL-6结合多肽，对抗体或其抗原结合片段，或对如本文定义的复合物作为一个整体进行多种修饰和/或添加，以对特定应用定制复合物而不偏离本公开内容的范围。因此，在一个实施方案中，提供了如本文定义的复合物，其中所述IL-6结合多肽和/或所述抗体或其抗原结合片段或所述复合物作为一个整体在至少一个C-末端和/或N-末端包含另外的氨基酸。此类复合物应被理解为在IL-6结合多肽和/或在抗体或其抗原结合片段的多肽链中的N-末端位置和/或C-末端位置处具有一个或更多个另外的氨基端残基的复合物。可选地，如果复合物被表达为融合蛋白，所述复合物应被理解为在复合物作为一个整体的N-末端位置和/或C-末端位置处具有一个或更多个另外的氨基酸残基。因此，所述复合物可包含任何合适数目的另外的氨基酸残基，例如至少一个另外的氨基酸残基。每个另外的氨基酸残基可单独或共同地被添加，以例如改进复合物的产生、纯化、体内或体外稳定、偶联或检测。此类另外的氨基酸残基可包含出于化学偶联的目的添加的一个或更多个氨基酸残基。这样的一个实例是添加半胱氨酸残基。另外的氨基酸残基还可提供用于多肽的纯化或检测的“标签”，诸如His6标签、(HisGlu)3标签(“HEHEHE”标签)或“myc”(c-myc)标签或“FLAG”标签，用于与对标签特异性的抗体相互作用或在His6标签的情况中用于固定化金属亲和层析(IMAC)。如以上讨论的另外的氨基酸可通过化学缀合(使用已知的有机化学方法)的方法或通过任何其他方法与如本文定义的IL-6结合多肽、与抗体或其抗原结合片段或与所述复合物作为一个整体偶联，所述其他方法诸如经由将IL-6结合多肽、抗体或其抗原结合片段或复合物表达为融合蛋白，或以任何其他方式直接或经由接头例如氨基酸接头连接。在一个实施方案中，提供了如本文定义的复合物，其中所述IL-6结合多肽为多聚体形式。所述多聚体被理解为包含至少两个如本文公开的IL-6结合多肽作为单体单元，所述单体单元的氨基酸序列可相同或不同。多聚体形式的多肽可包括合适数目的结构域，每个结构域具有IL-6结合基序，并且每个结构域形成多聚体内的单体。这些结构域可具有相同的氨基酸序列，但可选地，它们可具有不同的氨基酸序列。换言之，根据本公开内容的复合物可包含同多聚体或异多聚体例如同二聚体或异二聚体形式的IL-6结合多肽。在一个实施方案中，提供了如本文定义的复合物，其中IL-6结合多肽单体单元共价偶联在一起。在另一个实施方案中，所述IL-6结合多肽单体单元被表达为融合蛋白。在一个实施方案中，提供了二聚体形式的IL-6结合多肽。本方面提供了包含抗体或其抗原结合片段的复合物。如被熟知的，抗体为能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点与靶(抗原)特异性结合的免疫球蛋白分子，所述靶诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽或其他。如本文使用的，术语“抗体或其抗原结合片段”不仅包括全长或完整的多克隆抗体或单克隆抗体，还包括：其抗原结合片段，诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fab3、Fv及其变体；包含一个或更多个抗体部分的融合蛋白；人源化抗体；嵌合抗体；微型抗体(minibodies)；双链抗体(diabodies)；三链抗体(triabodies)；四链抗体(tetrabodies)；线性抗体；单链抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及免疫球蛋白分子的包含所需特异性的抗原识别位点的任何其他修饰的构造，包括抗体的糖基化变体，抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。修饰的抗体及其抗原结合片段的另外的例子包括纳米抗体、AlbudAb、DART(双亲和重靶向)、BiTE(双特异性T细胞衔接器(bispecificT-cellengager))、TandAb(串联双链抗体)、DAF(双重作用Fab)、二合一抗体(two-in-oneantibodies)、SMIP(小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceuticals))、FynomAb(与抗体融合的fynomer)、DVD-Ig(双重可变结构域免疫球蛋白)、CovX-body(肽修饰的抗体)、duobody和triomAb。抗体及其抗原结合片段的变体的该列举不被认为是限制性的，并且技术人员知道其他合适的变体。全长抗体包括两个重链和两个轻链。每个重链包含重链可变区(VH)和第一恒定区、第二恒定区和第三恒定区(CH1、CH2和CH3)。每个轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。取决于抗体的重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体被指定为不同的类别。存在6大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY，并且这些抗体中的若干种可被进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。如本文使用的术语“全长抗体”指任何类别的抗体，诸如IgD、IgE、IgG、IgA、IgM或IgY(或其任何亚类)。不同类别的抗体的亚基结构和三维构造是熟知的。“抗原结合片段”是抗体分子的保留了相应全长抗体的所有或重要的抗原结合部分的部分或区域，或其衍生物。抗体结合片段可包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)，或两者。VH和VL的每个通常包含3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。VH和VL中的3个CDR的侧翼为框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)。如以上简要地列出的，抗原结合片段的例子包括但不限于：(1)Fab片段，所述Fab片段为具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)Fab’片段，所述Fab’片段为具有重链铰链区的Fab片段，(3)F(ab′)2片段，所述F(ab′)2片段为通过重链铰链区连接，例如在铰链区通过二硫桥连接的Fab’片段的二聚体；(4)Fc片段；(5)Fv片段，所述Fv片段为具有抗体的单臂的VL和VH结构域的最小抗体片段；(6)单链Fv(scFv)片段，所述单链Fv(scFv)片段为其中scFv的VH和VL结构域通过肽接头连接的多肽单链；(7)(scFv)2，所述(scFv)2包含通过两个VH结构域经由二硫桥缔合的两个VH结构域和两个VL结构域以及(8)结构域抗体，所述结构域抗体可以是特异性地结合抗原的抗体单可变结构域(VH或VL)多肽。抗原结合片段可以经由常规方法制备。例如，F(ab′)2片段可通过全长抗体分子的胃蛋白酶消化产生，并且Fab片段可通过还原F(ab′)2片段的二硫桥生成。可选地，片段可经由重组技术通过在合适的宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞、酵母菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞)中表达重链片段和轻链片段并使它们组装以在体内或体外形成期望的抗原结合片段来制备。单链抗体可经由重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。例如，可在两个可变区之间掺入柔性接头。技术人员知道用于制备全长抗体及其抗原结合片段两者的方法。因此，在一个实施方案中，本公开内容的该方面提供了如本文定义的复合物，其中所述至少一个抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab′)2片段、Fc片段、Fv片段、单链Fv片段、(scFv)2和结构域抗体。在一个实施方案中，所述至少一个抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab片段和scFv片段。在一个特定的实施方案中，所述至少一个抗体或其抗原结合片段为全长抗体。在如本文定义的所述复合物的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体及其抗原结合片段。如本文使用的术语“单克隆抗体”指具有单价亲和力的抗体，意指单克隆抗体的样品中的每个抗体分子与抗原上的同一表位结合，而如本文使用的术语“多克隆抗体”指对特定的抗原起反应的抗体集合，但在该集合中可存在例如鉴定抗原上的不同表位的不同抗体分子。多克隆抗体通常通过接种合适的哺乳动物产生并从哺乳动物的血清纯化。单克隆抗体由为唯一的亲本细胞的克隆(例如杂交瘤细胞系)的相同的免疫细胞产生。如本文使用的术语“人抗体”指具有基本上相应于或源自从人受试者获得的抗体的可变区和恒定区的抗体。如本文使用的术语“嵌合抗体”指重组抗体或遗传上工程化的抗体，诸如例如包含来自不同的物种例如人类的多肽或结构域的鼠单克隆抗体，所述来自不同的物种的多肽或结构域被引入以减少抗体的免疫原性。术语“人源化抗体”指来自非人类物种，其蛋白序列已被修饰以增加它们与在人类中天然产生的抗体变体的相似性以降低免疫原性的抗体。对于如本文定义的复合物，除了能够结合IL-6之外，靶向至少一个另外的抗原可以是有益的。在一个实施方案中，所述另外的抗原与免疫系统的疾病或紊乱有关。在另一个实施方案中，所述另外的抗原与癌症有关。因此，在一个实施方案中，提供了如本文定义的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段具有对另外的抗原的亲和力，所述另外的抗原例如与免疫系统的疾病或紊乱有关或与癌症有关。非限制性实例包括与免疫系统的IL-6相关紊乱有关的抗原，以及与任何其他的IL-6相关紊乱有关的抗原。在一个实施方案中，抗原选自由以下组成的组：血管生成蛋白2(Ang-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、胰岛素样生长因子(IGF)、白介素1α(IL-1α)、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)、白介素17A(IL-17)、白介素12(IL-12)、白介素23(IL-23)、白介素33(IL-33)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、高迁移率族蛋白B1(high-mobilitygroupproteinB1，HMGB1)、脂多糖(LPS)、toll样受体4(TLR4)、神经生长因子(NGF)、趋化因子C-C基序配体19(CCL19)、趋化因子C-C基序配体21(CCL21)、趋化因子C-X-C基序配体4(CXCL4)和干扰素α。在一个特定的实施方案中，所述抗原选自由以下组成的组：IL-1β、TNF、GM-CSF、G-CSF、IL-12、IL-23、IL-17、HMGB1、LPS和TLR4。在一个实施方案中，所述抗原为例如选自由以下组成的组的细胞因子：IL-1β、TNF、GM-CSF、G-CSF、IL-12、IL-23和IL-17。在一个特定的实施方案中，所述抗原为TNF。在一个实施方案中，所述抗体或其片段选自由以下组成的组：阿达木单抗、英夫利昔、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(certolimumabpegol)及其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段为选自由以下组成的组的全长抗体：阿达木单抗、英夫利昔、戈利木单抗和赛妥珠单抗。在一个特定的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为阿达木单抗或其抗原结合片段，例如全长阿达木单抗。由如本文定义的复合物结合的另外的靶的其他非限制性实例为延长半衰期的靶。当复合物与此类靶结合时，复合物的体内半衰期被延长。在一个特定的实施方案中，另外的靶为白蛋白。在一个实施方案中，所述白蛋白结合活性通过将链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域或其衍生物包括进如本文定义的复合物来提供。如本文定义的复合物与IL-6的结合可在体内或在体外干扰经由IL-6的经典顺式信号传导和/或反式信号传导。因此，在一个实施方案中，提供了如本文定义的复合物，所述复合物能够阻断经由顺式信号传导途径的IL-6依赖性信号传导。在另一个实施方案中，如本文定义的复合物能够阻断经由反式信号传导途径的IL-6依赖性信号传导。在另一个实施方案中，如本文定义的复合物能够阻断经由顺式信号传导途径和反式信号传导途径两者的IL-6依赖性信号传导。半最大抑制浓度(IC50)是物质在抑制特定的生物或生化功能方面的效力的测量。该定量测量指示需要多少特定的物质以以半数抑制给定的生物过程，并且是本领域经常使用的。在一个特定的实施方案中，提供了如本文定义的能够阻断IL-6信号传导的复合物，以使得阻断的半最大抑制浓度(IC50)为至多1x10-6M，诸如至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。该阻断可以是顺式信号传导途径或反式信号传导途径。在一个实施方案中，所述复合物能够阻断IL-6/IL-6Rα与gp130的相互作用。在以下部分，TNF被用作如以上描述的另外的抗原的示例性实例并因此不应被认为是限制性的。因此，用于测量亲和力的方法同样适合于测量如本文描述的复合物对任何其他合适的另外的抗原的亲和力。如本文使用的术语“IL-6结合”、“对IL-6的结合亲和力”、“TNF结合”和“对TNF的结合亲和力”是指如本文定义的多肽或复合物的可例如通过ELISA或利用表面等离子体共振(SPR)技术测试的特性。例如，如在以下实施例中描述的，结合亲和力可在如下实验中被测试：其中多肽的样品在抗体包被的ELISA板上被捕获，并加入生物素化的IL-6(或生物素化的TNF)，随后是链霉亲和素缀合的HRP。添加TMB底物，并使用多孔板读取器，诸如Victor3(PerkinElmer)来测量在450nm处的吸光度。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，以至少建立复合物对IL-6(或TNF)的结合亲和力的定性测量。如果定量测量是期望的，例如，以确定相互作用的EC50值(半最大有效浓度)，也可使用ELISA。多肽针对生物素化的IL-6(或生物素化的TNF)的稀释系列的响应利用如以上描述的ELISA来测量。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，且EC50值可利用例如GraphPadPrism5和非线性回归从结果计算。IL-6结合亲和力或对另外的抗原诸如TNF的亲和力也可在表面等离子体共振(SPR)实验中测试。将IL-6(或TNF)或其片段固定在表面等离子体共振(SPR)仪器的传感器芯片上，并使包含待测试的复合物的样品在芯片上通过。可选地，将待被测试的复合物固定在设备的传感芯片上，并使包含IL-6(或TNF)或其片段的样品在芯片上通过。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，以至少建立复合物对IL-6(或TNF)的结合亲和力的定性测量。如果定量测量是期望的，例如以确定相互作用的KD值，也可使用表面等离子体共振方法。例如，结合值可以在Biacore(GEHealthcare)或ProteOnXPR36(Bio-Rad)仪器中来定义。将IL-6(或TNF)适当地固定在仪器的传感器芯片上，并且其亲和力待被确定的复合物的样品通过连续稀释来制备并以随机顺序被注射。然后，KD值可利用例如由仪器制造商提供的BIAevaluation4.1软件的1:1Langmui结合模型，或其他合适的软件从结果计算。在一个实施方案中，对于本文定义的复合物，其能够与IL-6结合，以使得相互作用的EC50值为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。在一个实施方案中，复合物能够与IL-6结合，以使得相互作用的KD值为至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M，诸如至多1x10-11M。如本文定义的复合物与另外的抗原的结合可在体内或在体外干扰涉及所述抗原的信号传导途径。例如，当所述另外的抗原是TNF时，所述复合物与TNF的结合可在体内或在体外干扰TNF信号传导。因此，在一个实施方案中，提供了如本文定义的复合物，所述复合物能够阻断TNF依赖性信号传导。在一个特定的实施方案中，提供了如本文定义的能够阻断TNF信号传导的复合物，以使得阻断的半最大抑制浓度(IC50)为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M，诸如至多1x10-11M。在一个实施方案中，复合物能够与TNF结合，以使得相互作用的KD值为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M，诸如至多1x10-11M，诸如至多1x10-12M。如本文描述的复合物可例如以融合蛋白或缀合物的形式存在。因此，所述至少一个IL-6结合多肽和所述至少一个抗体或其抗原结合片段可通过化学缀合的方法(使用已知的有机化学方法)或通过任何其他方法诸如将复合物表达为融合蛋白而被偶联，或以其它方式直接地或经由接头例如氨基酸接头而被连接。因此，在一个实施方案中，提供了如本文定义的复合物，其中所述复合物为融合蛋白或缀合物。在一个实施方案中，所述复合物为融合蛋白。在另一个实施方案中，所述复合物为缀合物。在所述复合物的一个实施方案中，所述IL-6结合多肽被附连至所述抗体或其抗原结合片段的重链的N末端或C末端。在另一个实施方案中，所述IL-6结合多肽被附连至所述抗体或其抗原结合片段的轻链的N末端或C末端。在一个实施方案中，所述IL-6结合多肽被附连至所述抗体或其抗原结合片段的轻链和重链的N末端和/或C末端。例如，IL-6结合多肽可被附连至所述抗体或其抗原结合片段的仅重链的N末端、仅轻链的N末端、仅重链的C末端、仅轻链的C末端、重链的N末端和C末端两者、轻链的N末端和C末端两者、仅轻链的C末端和重链的N末端、仅重链的C末端和轻链的N末端。技术人员知道融合蛋白的构建往往涉及在待被融合的功能部分之间应用接头，并且存在具有不同特性的不同种类的接头，诸如柔性的氨基酸接头、刚性的氨基酸接头和可裂解的氨基酸接头。接头已被用来例如增加稳定性或改善融合蛋白的折叠，以增加融合蛋白的表达、改善融合蛋白的生物活性、使融合蛋白能够靶向或改变融合蛋白的药代动力学。因此，在一个实施方案中，所述复合物还包含至少一个接头，诸如选自以下的至少一个接头：柔性的氨基酸接头、刚性的氨基酸接头和可裂解的氨基酸接头。在一个实施方案中，所述接头被布置在所述IL-6结合多肽和所述抗体或其抗原结合片段之间。柔性的接头常在连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时被用于本领域，并且在复合物的一些实施方案中可以是特别有用的。此类接头通常包括小的、非极性氨基酸(例如G)或极性氨基酸(例如S或T)。一些柔性的接头主要由G和S残基的延伸组成，例如(GGGGS)p。调节“p”的拷贝数允许接头的优化，以实现功能部分之间的适当分离或以保持必要的内部部分相互作用。除了G和S接头之外，其他的柔性接头是本领域已知的，诸如包含另外的氨基酸残基的G和S接头,所述另外的氨基酸残基诸如T和A以保持柔性，以及极性氨基酸残基以改善溶解性。被构思用于本文描述的复合物的柔性接头的实例还包括KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSEKST和GSAGSAAGSGEF。因此，在一个实施方案中，所述接头是包含甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和/或苏氨酸(T)残基的柔性接头。在一个实施方案中，所述接头具有选自(GnSm)p和(SmGn)p的通式，其中，独立地，n＝1-7、m＝0-7、n+m≤8且p＝1-7。在一个实施方案中，n＝1-5。在一个实施方案中，m＝0-5。在一个实施方案中，p＝1-5。在一个更特别的实施方案中，n＝4、m＝1且p＝1-4。在甚至更特定的实施方案中，所述接头为(GGGGS)3。在另一个特别的实施方案中，所述接头为GGGGS。在另一个特别的实施方案中，所述接头为VDGS。在另一个特别的实施方案中，所述接头为ASGS。在本公开内容的另外的方面，提供了编码如本文描述的复合物的多核苷酸；包含所述多核苷酸的表达载体；和包含所述表达载体的宿主细胞。本公开内容还包括产生如以上描述的复合物的方法，所述方法包括在容许所述多肽从其表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，和分离多肽。本公开内容的复合物或其亚组分多肽部分的任何一个或更多个，例如IL-6结合多肽或抗体的抗原结合片段可可选地使用氨基酸和/或具有保护的反应性侧链的氨基酸衍生物通过非生物肽合成来产生，所述非生物肽合成包括-将所述氨基酸和/或所述氨基酸衍生物逐步偶合以形成具有保护的反应性侧链的根据所述第一方面的多肽，-从所述多肽的反应性侧链除去所述保护基团，和-在水溶液中折叠所述多肽。所述复合物还可通过如本文描述的将至少一个IL-6结合多肽缀合至至少一个抗体或其抗原结合片段来产生。技术人员知道本领域已知的缀合方法，诸如例如使用带电荷的琥珀酰亚胺酯或碳化二亚胺的常规化合物缀合方法。应理解，如根据本公开内容公开的复合物可被用作用于至少抑制IL-6信号传导的治疗剂。所述复合物还可通过所述抗体或其抗原结合片段对为另外的信号传导途径的组分的另外的抗原的亲和力而被用于抑制所述另外的途径的信号传导。例如，所述抗体或其抗原结合片段可对TNF具有亲和力。在另一方面，提供了组合物，所述组合物包含如本文描述的复合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。在一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种另外的活性剂，诸如至少两种另外的活性剂，诸如至少三种另外的活性剂。可证明在此类组合物中有用的另外的活性剂的非限制性实例是免疫应答改变剂(immuneresponsemodifyingagent)和抗癌剂。可在根据该方面的组合物的实施方案中用作另外的活性剂的免疫应答改变剂的非限制性实例包括免疫抑制剂和免疫调节剂以及其他的抗炎剂。例如，如本文描述的复合物可与选自由以下组成的组的剂组合使用：病情改变抗风湿药物(disease-modifyingantirheumaticdrug，DMARD)，诸如金盐、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤和来氟米特；钙调磷酸酶抑制剂，诸如环孢菌素A或FK506；淋巴细胞再循环的调控剂；mTOR抑制剂，诸如雷帕霉素；具有免疫抑制特性的子囊霉素；糖皮质激素；皮质类固醇；环磷酰胺；免疫抑制单克隆抗体；粘附分子抑制剂，诸如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或ICAM-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；抗-TNF剂，诸如依那西普或TNF的单克隆抗体，例如英夫利昔、阿达木单抗、戈利木单抗和赛妥珠单抗；促炎细胞因子的阻断剂；IL-1阻断剂诸如阿那白滞素或IL-1陷阱；IL-17阻断剂；趋化因子阻断剂；非甾体抗炎药物(NSAID)诸如阿司匹林；以及抗感染剂和其他免疫应答调控剂，及其组合。可在根据该方面的组合物的实施方案中用作另外的活性剂的抗癌剂的非限制性实例包括选自由以下组成的组的剂：奥瑞他汀(auristatin)、蒽环霉素、刺孢霉素、考布他汀、阿霉素、倍癌霉素(duocarmycin)、CC-1065抗肿瘤抗生素、海鞘素(ecteinascidin)、格尔德霉素、美登醇(maytansinoid)、甲氨蝶呤、真菌毒素、紫杉醇、蓖麻毒素、bouganin、白树毒素、假单胞菌外毒素38(PE38)、白喉毒素(DT)、及其类似物，及其衍生物及其组合。技术人员将领会到细胞毒素剂的非限制性实例包括所述剂的所有可能的变型,例如剂奥瑞他汀包括例如奥瑞他汀E、奥瑞他汀F、奥瑞他汀PE及其衍生物。技术人员将领会到如本文描述的复合物或包含所述复合物的药物组合物可利用标准施用技术被施用至受试者，所述标准施用技术诸如口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用。因此，在一个实施方案中，提供了用于口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用的如本文描述的复合物或药物组合物。因此，在本公开内容的另一个方面，提供了如本文描述的复合物或组合物，用作药物。在一个实施方案中，所述复合物或组合物调控IL-6功能和另外的抗原的功能。所述另外的抗原可在体内与免疫系统的疾病或紊乱有关，或与癌症有关。在一个实施方案中，提供了本文描述的复合物，用作药物以体内调控IL-6功能。在一个实施方案中，提供了所述复合物或组合物，用作药物以调控IL-6功能和另外的抗原的功能，所述另外的抗原例如在体内与免疫系统的疾病或紊乱有关或与癌症有关的另外的抗原。在一个特定的实施方案中，提供了所述复合物或组合物，用作药物以体内调控IL-6功能和TNF功能。如本文使用的，术语“调控”指改变活性，诸如使IL-6功能或另外的抗原的功能部分丧失(hypomorph)、部分地抑制或完全地抑制IL-6功能或另外的抗原的功能。如本文使用的，术语“IL-6相关紊乱”指其中IL-6在信号传导途径中发挥调节作用的任何紊乱、疾病或状况。如本文使用的，术语“TNF相关紊乱”指其中TNF在疾病或紊乱涉及的信号传导途径中发挥调节作用的任何紊乱、疾病或状况。在一个实施方案中，提供了如本文描述的复合物或组合物，用于治疗IL-6相关紊乱，诸如与IL-6和TNF有关的紊乱。如本文描述的复合物或组合物对于其治疗可以有用的IL-6相关紊乱的非限制性列表包括：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌症、肿瘤疾病、糖尿病、神经性疾病、抑郁症，类风湿性关节炎(RA)、幼年RA、幼年特发性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、脉管炎、银屑病性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、慢性炎性肠疾病诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎、格雷夫斯病,贝赛特氏病、葡萄膜炎、巨细胞动脉炎、多发性硬化症(MS)、全身性硬化症、全身性红斑狼疮(SLE)、多肌炎、风湿性多肌痛(polymyalgiarheumatic)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、复发性多软骨炎、胰腺炎、腹膜炎、肾炎、川崎病(Kawasaki’sdisease)、干燥综合征、成人斯蒂尔病(adultStill’sdisease)、结肠炎相关性癌症、直肠癌、肾癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病(Castleman’sdisease)、乳腺癌、肺癌、阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。本领域已知用抗TNF剂治疗对于治疗除其他以外强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、斑块型银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎是有用的。另外，来自标签外(off-lable)使用抗TNF剂的数据表明TNF抑制可在一些情形诸如贝赛特氏病(disease)、非感染性眼部炎症、化脓性汗腺炎和坏疽性脓皮病中导致炎性过程的快速控制。另外，在难治性重性抑郁症、阿耳茨海默氏病、寻常型天疱疮、结节病的皮肤表现、中毒性表皮坏死松解症、扁平苔藓、包涵体肌炎和川崎病的治疗中存在与抗TNF剂的使用有关的正在进行的临床测试。(Karampetsou等,2010,InternationalJournalofMedicine,103卷，第12期.917-928)。因此，如本文描述的复合物或组合物对于其治疗在其中另外的剂是TNF的那些实施方案中是有用的TNF相关紊乱的非限制性列举包括：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、强直性脊柱炎,银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、斑块型银屑病、慢性炎性肠疾病诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎、贝赛特氏病、非感染性眼部炎症、化脓性汗腺炎、坏疽性脓皮病、抑郁症、阿耳茨海默氏病、寻常型天疱疮、结节病的皮肤表现、中毒性表皮坏死松解症、扁平苔藓、包涵体肌炎和川崎病。在一个实施方案中，所述紊乱选自由强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎和斑块型银屑病组成的组，诸如由强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎和斑块型银屑病组成的组，诸如由强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎和斑块型银屑病组成的组，诸如由强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、克罗恩氏病和类风湿性关节炎组成的组，诸如由强直性脊柱炎、银屑病性关节炎和类风湿性关节炎组成的组。在一个特定的实施方案中，所述紊乱选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(RA)、幼年RA、幼年特发性关节炎或全身性幼年特发性关节炎。在特定的实施方案中，所述紊乱是类风湿性关节炎(RA)。在另一个特定的实施方案中，所述紊乱是慢性炎性肠疾病，诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，所述紊乱为癌症或肿瘤疾病，诸如选自由以下组成的组的癌症或肿瘤疾病：结肠炎相关癌症、肾癌(renalcancer)、肾癌(kidneycancer)、前列腺癌、恶性淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、乳腺癌和肺癌。在另一个实施方案中，所述紊乱选自由以下组成的组：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。在相关的方面，提供了治疗IL-6相关紊乱的方法，包括对需要其的受试者施用有效量的如本文中描述的复合物或组合物。在所述方法的更特定的实施方案中，如本文中描述的复合物或组合物在体内调控IL-6功能。在一个实施方案中，所述复合物或组合物调控IL-6功能和另外的抗原的功能，所述另外的抗原例如在体内与免疫系统的疾病或紊乱有关的抗原或与癌症有关的抗原。在一个特定的实施方案中，其中所述另外的抗原为TNF，所述复合物或组合物在体内调控IL-6功能和TNF功能。与特定的紊乱相关并在与如本文描述的复合物或组合物用于治疗有关的方面的上下文中公开的实施方案与该治疗方法方面同等地相关。为了简要的目的，紊乱的列举将不在此重复。施用治疗有效量的如本文描述的复合物或组合物和至少一种第二药物物质可以是有益的，所述至少一种第二药物物质诸如如以上描述的免疫应答调控剂或抗癌剂。如本文使用的，术语“共施用”包括相伴施用和顺序施用。因此，在一个实施方案中，提供了如以上定义的方法，所述方法还包括共施用如以上描述的免疫应答调控剂。在另一个实施方案中，提供了如以上定义的方法，所述方法还包括共施用如以上描述的抗癌剂。尽管本发明已参考多种示例性方面和实施方案被描述，但本领域技术人员将理解，可做出多种改变，且等同物可代替其要素而不偏离本发明的范围。另外，可进行很多修改以使特定的情况或分子适应本发明的教导而不偏离其实质范围。因此，意图本发明不限于构思的任何特定的实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书的范围内的所有实施方案。附图简述图1是IL-6结合Z变体多肽的实例(SEQIDNO:1-1551)、对照Z变体多肽(SEQIDNO:1552-1553)、白蛋白结合结构域(ABD)变体PP013(SEQIDNO:1554)、用于选择、筛选和、或表征的人IL-6(SEQIDNO:1555)和鼠IL-6(SEQIDNO:1556)、TNF结合单克隆抗体Ada和Ada2的两个不同的重链序列(HCAda和HC2Ada；SEQIDNO:1557和1559)和一个轻链序列(LCAda；SEQIDNO:1558)的氨基酸序列的列表。在IL-6结合多肽中，推断的IL-6结合基序(BM)在每个序列中从位置8延伸至位置36。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束(BMod)的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从位置7延伸到位置55。图2显示了如实施例2中描述的测定的，阻断hIL-6和hIL-6Rα之间的相互作用的结果。与被包括用于比较的hIL-6Rα结合抗体托珠单抗(黑色)相反，测试的IL-6结合Z变体(灰色)不干扰hIL-6与其受体hIL-6Rα的结合。图3显示了如实施例2中描述的测定的，阻断预混合的hIL-6/hIL-6Rα与hgp130的结合的结果。对于所有测试的初始IL-6结合Z变体(灰色)以及对于被包括用于比较的托珠单抗(黑色)，都观察到浓度依赖性阻断。计算的每种变体的IC50值被显示于表3中。图4显示了如实施例2中描述的测定的，在基于gp130表达人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的系统中IL-6介导的反式信号传导的浓度依赖性抑制。与ABD变体PP013(SEQIDNO:1554)C末端融合的IL-6结合Z变体抑制反式信号传导，而与PP013融合的对照Z变体Z03638(SEQIDNO:1552)并不。托珠单抗被包括用于比较。图5显示了如实施例7中描述的测定的，阻断预混合的hIL-6/hIL-6Rα与hgp130的结合的结果。对于所有测试的成熟IL-6结合Z变体(灰色)以及对于均被包括用于比较的托珠单抗(黑色)和初始结合物Z06814(SEQIDNO:1512；虚线)，都观察到浓度依赖性阻断。所有成熟IL-6结合Z变体显示出比在实施例2中测定的初始结合物更有效的阻断(比较图3)。图6显示了在实施例7中描述的TF-1细胞中和测定的结果。对于所有测试的IL-6结合Z变体(成熟Z变体以黑色显示；初始结合物Z06814(SEQIDNO:1512)显示为黑色填充的三角形)以及对于托珠单抗(灰色填充的正方形)，都观察到IL-6引起的TF-1细胞增殖的浓度依赖依赖性抑制，但对于阴性对照抗体hIgG(灰色填充的圆圈)并不。图7显示了如在实施例8中描述的通过在抗关节炎小鼠模型中测定IL-6触发的血清淀粉样蛋白-A(SAA)蛋白释放而评分的，与ABD变体PP013(SEQIDNO:1554)融合的Z变体Z06814(SEQIDNO:1512)的体内效力。四组小鼠被给予0mg/kg体重(实心正方形)、0.025mg/kg体重(空心圆点)、2.5mg/kg体重(空心三角形)或25mg/kg体重(实心三角形)的IL-6结合Z06814-ABD融合蛋白。作为对照，小鼠被给予25mg/kg的与ABD融合的对照Z变体(Z04726；SEQIDNO:1553)(被称为Z对照-ABD)(空心正方形)。用hIL-6注射小鼠并随后测量SAA蛋白的水平。两个另外的对照组小鼠分别接受PBS(实心圆)和25mg/kgZ06814-ABD(叉)，但无随后的IL-6注射。图8显示了设计如实施例9中描述的产生的根据本公开内容的4种复合物的示意图。“Z”表示IL-6靶向Z变体Z06814(SEQIDNO:1512)，在所有的构建体中其经由15残基(GGGGS)3接头与抗TNF单克隆抗体遗传融合。A)Z06814-HCAda：与Ada的重链的N末端融合的Z06814；B)Z06814-LCAda：与Ada的轻链的N末端融合的Z06814；C)LCAda-Z06814：与Ada的轻链的C末端融合的Z06814；和D)HCAda-Z06814：与Ada的重链的C末端融合的Z06814。图9显示了在图7中显示的复合物变体的SDS-PAGE分析的结果，所述复合物变体在CHO细胞中产生并通过蛋白A亲和层析纯化。泳道1：NovexSharp分子量标准(216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)；泳道2：Ada(非还原)；泳道3：Z06814-HCAda(非还原)；泳道4：Z06814-LCAda(非还原)；泳道5：HCAda-Z06814(非还原)；泳道6：LCAda-Z06814(非还原)；泳道7：如泳道1中的分子量标准；泳道8：Ada(还原)；泳道9：Z06814-HCAda(还原)；泳道10：Z06814-LCAda(还原)；泳道11：HCAda-Z06814(还原)和泳道12：LCAda-Z06814(还原)。图10显示了如实施例11中描述的并使用如标示的构建体和比较物测定的TF-1细胞增殖的抑制。A)用IL-6刺激TF-1细胞，B)用TNF刺激TF-1细胞，C)用IL-6和TNF两者刺激TF-1细胞。图11显示了在如实施例12中描述的测定IL-6触发的血清淀粉样蛋白-A(SAA)释放的抗关节炎小鼠模型中，与Ada(实心圆)相比Z06814-HCAda(正方形)的体内效力。以0.7mg/kg、7mg/kg和70mg/kg的剂量注射Z06814-HCAda和Ada。图12显示了在实施例13中描述的纯化的复合物的SDS-PAGE分析。A)非还原条件。B)还原条件。泳道M：分子量标准；泳道1：曲妥珠单抗(对照IgG)；泳道2：阿达木单抗(对照IgG)；泳道3：LCAda-GGGGS-Z14976；泳道4：Z14976-(GGGGS)-LCAda；泳道5：Z14976-(GGGGS)3-LCAda。B)中的箭头指示与Z14976融合的轻链。图13显示了如实施例13中描述的通过ELISA分析的标示的复合物与A)TNF和B)IL-6的结合。在两个测定中，TNF结合抗体阿达木单抗和无关的IgG被包括作为对照。实施例概述在炎性风湿性疾病中，已显示IL-6引起的效应的竞争性阻断是高度有效的。相似地，高亲和力抗人TNF单克隆抗体阿达木单抗被临床用于治疗TNF引起的炎症适应症，包括类风湿性关节炎。为了研究这两种抗炎效应是否可结合在一种分子中，如在以下实施例中描述的，设计、产生并体外和体内表征了基于IL-6靶向Z变体和与TNF靶向抗体阿达木单抗具有相同结合特异性的抗体“Ada”的不同融合分子。实施例1-8公开了靶向白介素6(IL-6)的新型Z变体分子的开发。如以下描述的利用噬菌体展示技术使用Z变体的噬菌体文库，IL-6结合Z变体的第一成熟文库和IL-6结合Z变体的第二成熟文库获得Z变体。对编码本文描述的IL-6结合多肽的基因测序，并且相应的氨基酸序列被列于图1中，并由标识符SEQIDNO:1-1551表示。产生所述IL-6结合多肽并在体外和在体内表征。实施例9-13公开了将选择的IL-6结合Z变体融合至抗TNF单克隆抗体以研究在同一分子内包含IL-6结合多肽和所述抗体的复合物的炎症阻断效应。设计、产生并体外和体内表征基于IL-6靶向Z变体和TNF靶向单克隆抗体的融合物。实施例1IL-6结合Z变体的选择和ELISA筛选在该实施例中，将人IL-6(hIL-6)和鼠IL-6(mIL-6)用作利用Z变体的噬菌体文库的噬菌体展示选择中的靶蛋白。对选择的克隆的DNA测序，并且克隆在大肠杆菌(E.coli)周质级分中产生并在ELISA(酶联免疫吸附测定)中针对IL-6测定。材料和方法靶蛋白人和鼠IL-6的生物素化:利用No-WeighEZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin(ThermoScientific,目录号21327)根据制造商的建议以12x摩尔过量将hIL-6和mIL-6(Peprotech,目录号分别为200-06和216-16)生物素化。反应在室温(RT)进行持续30分钟。然后，利用Slide-a-lyzer透析盒(ThermoScientific,目录号66333,3,500MWCO)根据制造商的指示进行缓冲液交换为磷酸缓冲的盐水(PBS，10mM磷酸盐、137mMNaCl、2.68mMKCl，pH7.4)。IL-6结合Z变体的噬菌体展示选择：基本上如等(2007)JBiotechnol,128:162-183中描述的在噬菌粒pAY02592中构建的被展示在噬菌体上的蛋白Z的随机变体的文库被用于选择IL-6结合Z变体。在该文库中，将白蛋白结合域(缩写为ABD，并且对应于来自链球菌(Streptococcus)菌株G148的G蛋白的GA3)用作对于Z变体的融合伴侣。该文库被表示为Zlib006Naive.II并具有1.5x1010个文库成员(Z变体)的大小。将来自包含噬菌粒文库Zlib006Naive.II的甘油储备液的大肠杆菌RRIΔM15细胞(Rüther等，(1982)NucleicAcidsRes10:5765-5772)接种在补充有100μg/ml氨苄青霉素的20l限定的不含脯氨酸的培养基[7g/l磷酸氢二钾、1g/l柠檬酸三钠二水合物、0.02g/l尿嘧啶、6.7g/lYNB(DifcoTM不含氨基酸的酵母氮源基础，BectonDickinson)、5.5g/l一水合葡萄糖、0.3g/lL-丙氨酸、0.24g/lL-精氨酸单盐酸盐、0.11g/lL-天冬酰胺一水合物、0.1g/lL-半胱氨酸、0.3g/lL-谷氨酸、0.1g/lL-谷氨酰胺、0.2g/l甘氨酸、0.05g/lL-组氨酸、0.1g/lL-异亮氨酸、0.1g/lL-亮氨酸、0.25g/lL-赖氨酸单盐酸盐、0.1g/lL-甲硫氨酸、0.2g/lL-苯丙氨酸、0.3g/lL-丝氨酸、0.2g/lL-苏氨酸、0.1g/lL-色氨酸、0.05g/lL-酪氨酸、0.1g/lL-缬氨酸]中。使培养物在发酵罐(BelachBioteknik,BR20)中在37℃生长。当细胞达到0.75的在600nm(OD600)处的光密度时，将约2.6l的培养物使用10x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体(NewEnglandBiolabs，目录号N0315S)来感染。将细胞孵育持续30分钟，届时将发酵罐用补充有100μM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)用于诱导表达和25μg/ml卡那霉素和12.5μg/ml羧苄青霉素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物；30g/lTSB、5g/l酵母提取物)填充至20l。使细胞在30℃生长持续22h并将培养物中的细胞通过以15,900g离心来沉淀。如在等，同上中描述的，将噬菌粒在PEG/NaCl(聚乙二醇/氯化钠)中从上清液沉淀两次，过滤并溶解在PBS和甘油中。使噬菌体储备液在使用前贮存于-80℃。选择程序和噬菌体储备液制备基本上如WO2009/077175中针对另一种生物素化的靶的选择所描述的来进行。为了减少背景结合物(binders)的量，通过将噬菌体储备液与SA-珠在RT孵育持续30分钟进行预选择。用补充有5％BSA的PBS来预封闭在选择中使用的所有管和珠。在补充有3％BSA和0.1％Tween20的PBS中在RT在2h的期间进行选择，然后使用1mg珠/1.6μg生物素化的hIL-6或mIL-6在M-280链霉亲和素(SA-珠,Invitrogen,目录号11206D)上捕获靶结合噬菌体。将大肠杆菌菌株XL1-Blue(Agilenttechnologies,目录号200268)用于噬菌体扩增。在被划分在四个不同的最终轨道中的四个循环中进行针对生物素化的hIL-6和mIL-6的选择：循环1中的轨道(1)被划分在第二循环或第四循环中，导致在循环2中共3个轨道(1-1至1-3)，在循环3中3个轨道(1-1-1至1-3-1)，和在循环4中四个轨道(1-1-1-1至1-3-1-2)。在洗涤之后，使用500μl0.1M甘氨酸-HCl、pH2.2从选择轨道洗脱结合的噬菌体，随后立即用50μl1MTris-HCl、pH8.0和450μlPBS中和。在表2中显示了选择策略和使用的参数的概览，描述了在选择轨道中在降低的靶浓度和增加的洗涤次数方面的不同。表2：用于初始选择的策略的概览测序：使用标准PCR程序和以下引物从单菌落扩增PCR片段：AFFI-21(5’-tgcttccggctcgtatgttgtgtg；SEQIDNO:1560)和AFFI-22(5’-cggaaccagagccaccaccgg；SEQIDNO:1561)。使用生物素化的寡核苷酸AFFI-72(5’-生物素-cggaaccagagccaccaccgg；SEQIDNO:1562)和根据制造商的建议使用的Terminatorv3.1循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)进行扩增的片段的测序。测序反应物利用Magnatrix8000(MagneticBiosolution)仪器通过与磁性链霉亲和素包被的珠(DetachStreptavidinBeads，Nordiag,目录号2012-01)结合来纯化，并在ABI3130xl遗传分析仪(PEAppliedBiosystems)上分析。用于ELISA的Z变体的产生：通过在深孔板(Nunc，目录号278752)中将来自选择的单菌落接种到补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1mMIPTG的1mlTSB-YE培养基中来产生测序的Z变体。将板在37℃孵育持续24小时。使细胞通过离心形成团块，在200μl的0.05％PBST(补充有0.05％Tween-20的PBS)中重悬，在-80℃冷冻并在水浴中解冻以释放细胞的周质级分。重复冷冻-解冻程序5次。将样品用PBST0.05％稀释至总共800μl并通过离心使细胞形成团块。周质提取物的上清液包含作为与ABD的融合的Z变体，表示为AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG等人，同上)。Z#####是指单独的58个氨基酸残基Z变体。Z变体的ELISA分析：在ELISA测定中分析Z变体与IL-6的结合。在4℃用2μg/ml在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH9.6；Sigma,目录号C3041)中稀释的抗ABD山羊抗体(内部产生的)包被半区96孔ELISA板(Costar,目录号3690)过夜。倾倒掉抗体溶液并在RT用100μl的PBSC(补充有0.5％酪蛋白的PBS；Sigma，目录号C8654)封闭孔持续1.5小时。丢弃封闭溶液并将50μl周质溶液添加到孔中并在RT在缓慢震荡下孵育持续1.5h。倾倒掉上清液并用0.05％PBST洗涤孔4次。然后，将PBSC中的7.7nM浓度的50μl生物素化的hIL-6添加到每个孔中。将板在RT孵育持续1.5h，然后如以上描述的洗涤。将链霉亲和素缀合的HRP(ThermoScientific，目录号N100)在PBSC中1:30000稀释并添加至孔，然后孵育45分钟。如以上描述的洗涤后，将50μlImmunoPureTMB底物(ThermoScientific，目录号34021)加入至孔中，并将板根据制造商的建议进行处理。结合特定的不相关蛋白的Z变体通过针对该特定的不相关蛋白测定而被用作阳性对照，并且通过针对hIL-6测定而被用作阴性对照。作为空白对照，添加PBST0.05％，而非周质样品。使用多孔板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。结果IL-6结合Z变体的噬菌体展示选择：在4个循环的针对生物素化的hIL-6和mIL-6的噬菌体展示选择后，制备个体克隆。测序：对从第四轮选择随机挑取的克隆进行测序。每个Z变体被赋予了唯一的标识号#####且个体变体被称为Z#####。58个残基长Z变体的氨基酸序列在图1中和序列表中被列为SEQIDNO:1503-1551。在每个序列中推断的IL-6结合基序(BM)从位置8延伸到位置36。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束(BMod)的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从位置7延伸到位置55。Z变体的ELISA分析：在四个选择循环之后获得的克隆在96孔板中产生并在ELISA中针对hIL-6结合活性筛选。以相应于至少3x阴性对照的信号给出响应的所有克隆被认为是阳性IL-6结合物。对不相关蛋白特异性的对照分子给出针对特异性蛋白的阳性信号，然而针对hIL-6没有获得信号。实施例2IL-6结合Z变体的产生和体外表征在该实施例中，将Z变体的亚组亚克隆、产生并在竞争ELISA和细胞测定中进行功能测定。分别应用两个不同的ELISA测定来研究IL-6结合Z变体是否能够阻断IL-6和IL-6Rα之间或IL-6和gp130受体之间的特异相互作用。利用分别模拟经典顺式信号传导途径和反式信号传导途径的两个不同的细胞测定来测定Z变体多肽的效价。最后，对Z变体的亚组进行圆二色性(CD)光谱学，以研究其二级结构并确定其熔解温度Tm。材料和方法Z变体的亚克隆:从文库载体pAY02592扩增以下13个IL-6结合Z变体的DNA：Z06777(SEQIDNO:1503)、Z06779(SEQIDNO:1504)、Z06789(SEQIDNO:1505)、Z06791(SEQIDNO:1506)、Z06792(SEQIDNO:1507)、Z06799(SEQIDNO:1508)、Z06802(SEQIDNO:1509)、Z06805(SEQIDNO:1510)、Z06809(SEQIDNO:1511)、Z06814(SEQIDNO:1512)、Z06829(SEQIDNO:1513)、Z06834(SEQIDNO:1514)、Z06844(SEQIDNO:1515)。利用标准分子生物学技术(基本上如WO2009/077175中针对结合另一种靶的Z变体描述的)来应用用于构建具有N-末端His6标签的单体Z变体分子的亚克隆策略。将Z基因片段亚克隆进表达载体pAY01448，导致编码序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。将五个IL-6结合Z变体的亚组Z06789、Z06799、Z06809、Z06814和Z06829以及结合不相关靶的两个对照Z变体Z03638(SEQIDNO:1552)和Z04726(SEQIDNO:1553)以与ABD变体PP013(SEQIDNO:1554)融合来亚克隆。由表达载体编码的构建体为MGSSLQ-[Z#####]-VDGS-PP013。培养和纯化:用包含每个各自的IL-6结合Z变体的基因片段的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)，并在37℃在800ml或1000ml补充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中培养。为了诱导蛋白表达，在OD600＝2时，添加IPTG至0.2mM的终浓度并使培养物在37℃再孵育5小时。通过离心收获细胞。具有His6-标签的IL-6结合Z变体的纯化:在天然或变性条件下进行蛋白纯化。在天然条件下的纯化如下进行：将约2-5的每种细胞团块重悬在10mlPBS中。在通过声处理破碎细胞后，通过离心移除细胞碎片，并将每种上清液应用到用20ml洗涤缓冲液(46.6mMNa2HPO4、3.4mMNaH2PO4和300mMNaCl，pH7.0)平衡的2mlTalon钴柱(Clontech,目录号635504)上。通过用洗涤缓冲液洗涤移除污染物，并且然后用洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4、100mMNaCl、30mMHAc和70mMNaAc，pH5.0)洗脱IL-6结合Z变体。在变性条件下的纯化如下进行：将约2-5g的每种细胞团块重悬在10ml裂解缓冲液(7M盐酸胍、47mMNa2HPO4、2.65mMNaH2PO4、10mMTris-HCl、104mMNaCl，pH8.0)中，然后在37℃、150rpm孵育持续2h。如针对天然纯化的进行洗涤和洗脱步骤，只是使用不同的缓冲液(洗涤缓冲液：6M盐酸胍、47mMNa2HPO4、3.4mMNaH2PO4、300mMNaCl，pH8.0；洗脱缓冲液：6M尿素、0.1MNaCl、29.6mMHAc、70.4mMNaAc和50mMNaH2PO4，pH5.0)。纯化的Z变体根据制造商的方案使用PD-10柱(GEHealthcare)以PBS进行缓冲液交换。通过测量在280nm处的吸光度，使用各自蛋白的消光系数来确定蛋白浓度。IL-6结合Z变体的纯度通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE来分析。与ABD融合的IL-6结合Z变体的纯化:将约2.5g的每种细胞沉淀重悬于20ml补充有(Merck)的TST-缓冲液(25mMTris-HCl、1mMEDTA、200mMNaCl、0.05％吐温20,pH8.0)中。通过声处理破碎细胞并通过离心澄清后，将每种上清液应用至具有1ml抗ABD琼脂糖的重力流柱上(WO2014/064237)。在用TST-缓冲液和5mMNH4AcpH5.5缓冲液洗涤之后，用0.1MHAc洗脱ABD融合的Z变体。利用PD-10柱(GEHealthcare)进行对PBS(2.68mMKCl、137mMNaCl、1.47mMKH2PO4、8.1mMNa2HPO4，pH7.4)的缓冲液交换。然后，在1mlDetoxi-GelEndotoxinRemovingColumns(Pierce,目录号20344)上纯化ABD融合的Z变体以确保低的内毒素含量。通过测量在280nm处的吸光度，使用各自蛋白的消光系数来确定蛋白浓度。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析纯度，并利用LC/MS分析来确认每种纯化的Z-ABD变体的身份。结合位点的分析：采用第一测定来评价IL-6结合Z变体对hIL-6和人IL-6Rα(hIL-6Rα)之间的相互作用的干扰。在该实验中，用抗-IL-6R捕获抗体(R&DSystems)以2μg/ml的浓度包被半区96孔ELISA板。将板在4℃孵育过夜并且然后在自来水中洗涤两次。然后，在PBSC中将板封闭持续1h，并以250ng/ml的浓度添加hIL-6Rα(R&DSystems)。将板在RT孵育持续1.5h并且然后用200μl0.05％Tween/PBS洗涤4次。在单独的板中，用2.5nM的生物素化的hIL-6滴定13种带His6标签的Z变体多肽的系列稀释物(浓度范围500-0.5nM)。以相同的方式制备IL-6Rα抗体托珠单抗(Roche)并将其包括用于比较。然后将Z变体与生物素化的hIL-6的每种预混合物转移至含有hIL-6Rα的孔。将板再孵育持续1.5h并且然后洗涤4次。添加链霉亲和素-HRP(ThermoScientific)的1:8000稀释物并将板孵育持续1h。将板用0.05％Tween/PBS洗涤最后4次，并添加TMB底物(ThermoScientific)持续15分钟，然后用2MH2SO4终止反应。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。采用第二测定来评价IL-6结合Z变体对人gp130(hgp130)和预混合的hIL-6/hIL-6Rα之间的相互作用的干扰。在该实验中，用Fc融合的hgp130(hgp130-Fc)以4μg/ml的浓度包被半区96孔ELISA板。将板在4℃孵育过夜并且然后在自来水中洗涤两次。然后，将板在PBSC中封闭持续1h。将板在RT孵育持续1.5h并且然后用200μl0.05％Tween/PBS洗涤4次。在单独的板中，用固定的hIL-6/hIL-6Rα浓度(分别0.5nM和5nM)滴定13种带His6标签的Z变体多肽的系列稀释物(浓度范围500-0.5nM)。以相同的方式制备IL-6Rα结合抗体托珠单抗(Roche)并将其包括用于比较。然后将每种Z变体多肽与hIL-6/hIL-6Rα的预混合的缔合物转移至含有hgp130的孔。将板孵育持续1.5h并且然后洗涤4次。添加生物素化的抗IL-6Rα抗体(R&DSystems)并将板再孵育1.5h,然后洗涤。添加链霉亲和素-HRP(ThermoScientific)的1:8000稀释物并将板孵育持续1h。然后，将板洗涤4次，并添加TMB底物(ThermoScientific)持续15分钟，然后用2MH2SO4终止反应。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。体外中和测定：评价经典信号传导途径的第一测定使用响应于人IL-6、TNF和GM-CSF而增殖的TF-1细胞系。在补充有10％FCS(Gibco)、Pen-Strep(Lonza)和2ng/mlrhGM-CSF(R&DSystems)的具有L-glut(Lonza)的RPMI1640中培养TF-1细胞。在使用前，将细胞在rhGM-CSF的不存在下在RPMI1640中洗涤两次。然后对细胞计数，并以4x104个细胞/孔的密度分配到96孔平底板中。在单独的板中，在0.099nMrhIL-6(R&DSystems,UK)的存在下孵育抑制化合物(IL-6结合Z变体，具有His6标签(浓度范围1000-0.1nM)或与ABD变体PP013融合的系列稀释物(SEQIDNO:1554；浓度范围200-0.007nM))和IL-6Rα结合抗体托珠单抗(Roche；浓度范围200-0.007nM)。另外，在有或无9μMrhHSA(Novozymes)下孵育ABD融合的变体。然后将Z变体多肽和hIL-6的预混合物转移至含有TF-1细胞的孔，所述含有TF-1细胞的孔在加湿的5％CO2气氛中在37℃被孵育了持续72h。在孵育的最后4个小时期间，每孔添加10μl的CCK-8(Fluka,SigmaAldrich)以确定增殖细胞的数目。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。通过对四参数剂量响应曲线的非线性回归来评价关于细胞生长的数据，并利用GraphPadPrism程序确定半最大抑制浓度(IC50)。TF-1细胞的IL-6依赖性增殖被抑制分子的抑制为Abs450减去含有细胞但不含hIL-6的对照孔。为了解决反式信号传导途径，使用第二测定。在本文中，用hIL-6和可溶性hIL-6Rα刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且读取为单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的产生。使HUVEC(Lonza)在EGM-2bulletkit培养基(Lonza)中生长，并在培养物中传代不超过8次。在使用前，使细胞生长直至75％汇合。将细胞使用胰蛋白酶/EDTA(Lonza)分离，重悬并在新鲜的培养基中洗涤一次。然后，对细胞计数，并以2x104个细胞/孔的密度分配到96孔平底板中。在37℃在加湿的5％CO2气氛中培养细胞过夜。在单独的板中，在重组hIL-6(10ng/ml；0.5nM)和200ng/ml(5.6nM)的固定浓度的可溶性hIL-6Rα的存在下，在以具有或不具有9μMrhHSA(Novozymes)下，孵育与ABD变体PP013(SEQIDNO:1554)融合的IL-6结合Z变体Z06789、Z06799、Z06809、Z06814和Z06829，结合不同的靶的PP013融合的阴性对照Z03638(SEQIDNO:1552)，以及托珠单抗(Roche)的系列稀释物(200-0.003nM)。然后将具有测试分子和hIL-6/hIL-6Rα的预混合溶液转移至含有HUVEC的孔，所述含有HUVEC的孔在37℃在加湿的5％CO2气氛中被孵育了持续24h。在孵育时期后收集无细胞的上清液并利用MCP-1DuosetELISA开发系统(R&DSystems)通过夹心ELISA确定人MCP-1水平。MCP-1ELISA:用抗MCP-1捕获抗体(R&DSystems)以1μg/ml的浓度包被半区96孔ELISA板。将板在4℃孵育过夜，在自来水中洗涤两次并在PBSC中封闭持续1h。然后将板用4x200μl0.05％Tween/PBS洗涤4次，然后添加标准物和样品。将板在RT孵育持续2h，洗涤，然后添加0.1μg/ml生物素化的抗MCP-1抗体(R&DSystems)。然后，将板再孵育持续1.5h然后洗涤4次。然后，添加链霉亲和素-HRP(ThermoScientific)的1:8000稀释物并将板孵育持续1h。将板洗涤最后4次，并添加TMB底物(ThermoScientific)持续20分钟，然后用2MH2SO4终止反应。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。CD分析：将纯化的带His6标签的Z变体的亚组在PBS中稀释至0.5mg/ml。对于每个稀释的Z变体，在20℃获取在250-195nm处的CD光谱。另外，进行可变温度测量(VTM)以确定熔解温度(Tm)。在VTM中，在221nm处测量吸光度，同时将温度以5℃/min的温度斜率从20℃提高至90℃。在JascoJ-810分光偏振计(JascoScandinaviaAB)上使用具有1mm的光路长度的比色皿进行CD测量。结果培养和纯化:在大肠杆菌中产生13种被构建带有N-末端His6标签的IL-6结合Z变体(SEQIDNO:1503-1515)。对于不同的IL-6结合Z变体，通过用分光光度计在280nm处测量吸光度而确定的来自约2-5g细菌团块的IMAC-纯化的蛋白的量的范围从约10mg至20mg。从与ABD变体PP013(SEQIDNO:1554)融合的5种Z变体的约2.5g细胞团块获取2mg至12mg。每种最终蛋白制备物的SDS-PAGE分析显示，这些制备物主要包含IL-6结合Z变体。每种IL-6结合Z变体的正确身份和分子量通过HPLC-MS分析来证实。结合位点的分析：在两个单独的竞争ELISA实验中研究13种测试的带His6标签的IL-6结合Z变体阻断(i)hIL-6和hIL-6Rα之间或(ii)hgp130和预先形成的hIL-6/hIL-6Rα之间的相互作用的能力。当针对阻断hIL-6/hIL-6Rα相互作用测试时，13种Z变体均未显示出任何显著的影响。但是，所有的Z变体显示出预先形成的hIL-6/hIL-6Rα和hgp130之间的相互作用，即反式信号传导类似相互作用的清楚的浓度依赖性阻断(图3)。对于每种Z变体计算的IC50值被显示于表3中。被包括用于比较的抗体托珠单抗在两个实验中均显示出阻断效应。表3：初始Z变体阻断hIL-6/hIL-6Rα与hgp130的相互作用的IC50值体外中和测定：利用两种不同的细胞测定来分别研究IL-6结合Z变体阻断经典信号传导途径和反式信号传导途径中的IL-6依赖性信号传导的能力。评价经典信号传导途径的第一测定采用响应于人IL-6、TNF和GM-CSF而增殖的TF-1细胞系。IL-6到与被称为gp130的信号传导受体亚基连接的细胞表面IL-6受体的直接信号传导被称为顺式信号传导。该测定显示所有13种变体都能够阻断TF-1细胞的IL-6依赖性生长。对于带His6标签的Z变体和与ABD变体PP013(SEQIDNO:1554)重组地融合的Z变体，以及对于被包括用于比较的IL-6Rα结合抗体托珠单抗计算的IC50值被显示于表4中。表4：初始Z变体阻断TF-1细胞的IL-6依赖性生长的IC50值为了研究在基于细胞的系统中反式信号传导途径是否也能被阻断，使用gp130表达人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行第二测定。将HUVEC与预先形成的hIL-6/hIL-6Rα一起孵育导致单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的IL-6反式信号传导依赖性分泌，允许IL-6结合Z变体的任何反式信号传导阻断能力的分析。在该测定中，在HSA的存在下分析与ABD变体PP013(SEQIDNO:1554)重组地融合的5种Z变体。hIL-6Rα结合抗体托珠单抗被包括用于比较。所有5种研究的Z变体都显示出抑制反式信号传导(图4)。一种变体Z06814-ABD显示出比托珠单抗更强有力，并且与托珠单抗的5nM相比，表现出约1nM的IC50值。CD分析：对于7种Z变体的CD光谱显示，每种变体在20℃具有α-螺旋结构。通过可变温度测量确定的熔解温度(Tm)被显示于表5中。表5：选择的Z变体的熔解温度实施例3IL-6结合Z变体的第一成熟文库的设计和构建在该实施例中，构建了成熟文库。使用该文库选择新的IL-6结合Z变体。来自成熟文库的选择通常被预期产生具有增强的亲和力的结合物(Orlova等，(2006)CancerRes66(8):4339-48)。在本研究中，使用裂池合成(split-poolsynthesis)来生成随机化的单链接头，使得能够将定义的密码子在合成中掺入期望的位置中。材料和方法文库设计：文库基于在实施例1和2中描述的选择的IL-6结合Z变体的序列。在新的文库中，根据基于SEQIDNO:1503-1551定义的Z变体序列的策略，使Z分子支架中的12个可变位置向某些氨基酸残基偏倚并使一个位置保持恒定。利用裂池合成生成147bp的DNA接头，所述接头编码Z变体氨基端序列的部分地随机的螺旋1和2。因此，侧翼为限制性位点XhoI和SacI的5’-AAATAAATCTCGAGGTAGATGCCAAATACGCCAAAGAANNNNNNNNNGCGTGGNNNGAGATCNNNNNNCTGCCTAACCTCACCNNNNNNCAANNNNNNGCCTTCATCNNNAAATTANNNGATGACCCAAGCCAGAGCTCATTATTTA-3’(SEQIDNO:1563；随机密码子表示为NNN)从DNA2.0(MenloPark,CA,USA)订购。氨基酸残基在包括Z分子支架中的12个可变Z位置(9、10、11、14、17、18、24、25、27、28、32和35)的新的文库中的理论分布在表6中给出。得到的理论文库大小为3.6x109个变体。表6：文库设计，第一成熟文库构建：使用AmpliTaqGold聚合酶(AppliedBiosystems，目录号4311816)根据供应商的建议在12个循环的PCR期间扩增文库，并用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN，目录号28106)根据供应商的建议纯化混合的产物。随机化文库片段的纯化的混合物(pool)用限制性内切酶XhoI和SacI-HF(NewEnglandBiolabs，目录号R0146L，和目录号R3156M)来消化，并使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN,目录号28106)来浓缩。随后，根据供应商的建议使产物在制备性2.5％琼脂糖凝胶(NuisieveGTC琼脂糖，Cambrex，Invitrogen)上泳动并使用QIAGEN凝胶提取试剂盒(QIAGEN，目录号28706)纯化。噬菌粒载体pAY02592(基本如等人，同上中所述的pAffi1)用相同酶限制性内切，使用苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀来纯化。将限制性片段和载体以5:1的摩尔比率用T4DNA连接酶(Fermentas,目录号EL0011)在RT连接持续2h，然后在4℃孵育过夜。通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀回收连接的DNA，然后在10mMTris-HCl，pH8.5中溶解。因此，所得的在载体pAY02592中的文库编码Z变体，每个Z变体与源自链球菌G蛋白的白蛋白结合域(ABD)融合。连接反应(约160ngDNA/转化)被电穿孔进入电感受态大肠杆菌ER2738细胞(50μl，Lucigen，Middleton，WI，USA)。紧接在电穿孔之后，加入约1ml的恢复培养基(供给ER2738细胞)。在37℃孵育转化的细胞持续60分钟。取出样品用于滴定并用于确定转化株的数目。然后，将细胞汇集并在37℃在1l的补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE培养基中培养过夜。以4,000g持续7分钟使细胞成为团块并重悬于PBS/甘油溶液(约40％甘油)中，等分并储存在-80℃。对来自Z变体的文库的克隆进行测序，以验证内含物并且以评价所构建文库与该文库设计相比的结果。如实施例1中描述的进行测序，并验证氨基酸分布。噬菌体储备液的制备：在20l发酵罐(BelachBioteknik)中制备包含噬菌粒文库的噬菌体储备液。将来自包含该噬菌粒文库的甘油储备液的细胞接种于10l的补充有1g/l葡萄糖、100mg/l氨苄青霉素和10mg/l四环素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物；30g/lTSB、5g/l酵母提取物)中。当细胞达到0.64的在600nm处的光密度(OD600)时，使用5x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体感染约1.1l的培养物。将细胞孵育30分钟，届时用复合发酵培养基[2.5g/l(NH4)2SO4；5.0g/l酵母提取物；30g/l胰蛋白胨、2g/lK2HPO4，3g/lKH2PO4，1.25g/l；Na3C6H5O7·2H2O；BreoxFMT30消泡剂0.1ml/l]填充发酵罐直至10l。添加以下组分：10ml羧苄青霉素25mg/ml；5ml卡那霉素50mg/ml；1ml1M异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)；17.5ml/l的300g/lMgSO4和5ml的微量元素溶液[35g/lFeCl3·6H2O；10.56g/lZnSO4·7H2O；2.64g/lCuSO4·5H2O；13.2g/lMnSO4·H2O；13.84g/lCaCl2·2H2O，溶解于1.2MHCl]。开始葡萄糖限制的补料分批培养，其中将600g/l葡萄糖溶液补料到反应器(开始时3.5g/h，20h后37.5g/h并且直到培养结束)。通过自动添加25％NH4OH使pH被控制在pH7。补充空气(5l/min)并将搅拌器设置为500rpm。补料分批培养24h后，OD600为22。通过以15,900g离心使培养物中的细胞成团。如实施例1中描述的，使噬菌体颗粒在PEG/NaCl中从上清液沉淀2次，过滤并溶解于PBS和甘油中。将噬菌体储备液贮存于-80℃，直到在选择中使用。结果文库构建：基于具有被证实的结合特性的一组IL-6结合Z变体(实施例1和2)来设计新文库。设计的文库的理论大小为3.6x109种Z变体。转化到大肠杆菌ER2738细胞后通过滴定确定的文库的实际大小为3.5x109种转化株。文库质量通过测序192种转化株和通过将它们的实际序列与理论设计比较来测试。与设计的文库比较，实际文库的内容物显示是令人满意的。因此成功构建了IL-6的潜在结合物的成熟文库。实施例4来自第一成熟文库的Z变体的选择、筛选和表征材料和方法成熟的IL-6结合Z变体的噬菌体展示选择：如实施例1中描述的使靶蛋白hIL-6(R&DSystems,目录号206-IL/CF)和mIL-6(Abnova,目录号P4346Il6)生物素化。使用如实施例3中描述的Z变体分子的新的文库，在基本上如实施例1中描述但有以下例外的针对hIL-6和mIL-6的四个循环中进行噬菌体展示选择。在选择时，分别将胎牛血清(FCS,Gibco,目录号10108-165)和人血清白蛋白(HSA,Albucult,Novozymes,目录号230-005)添加至选择缓冲液至10％和1.5μM的最终浓度。用补充有3％BSA的PBS0.1％预封闭在选择中使用的所有管和珠。在循环1A中，通过将噬菌体储备液与SA-珠一起孵育进行预选择步骤。对于所有轨道，在循环1中，选择体积为2ml。为了捕获靶结合噬菌体，每4μg生物素化的hIL-6或mIL-6使用1mg珠。循环1中的六个轨道(1-6)被划分在第二循环或第三循环，导致在循环2中共七个轨道(1-1至6-2)，在循环3中共十二个轨道(1-1-1至6-2-1)，以及在循环4中共十二个轨道(1-1-1-1至6-2-1-1)。使用以下两种不同程序洗脱结合的噬菌体颗粒：1)500μl0.1M甘氨酸-HCl，pH2.2，随后立即用50μl1MTris-HCl，pH8.0，和450μlPBS中和，或2)500μl的100mM磷酸钠和150mM氯化钠，pH5.5并用500μlPBS中和。在表7中显示了选择策略的概览，描述了在随后的循环中通过使用降低的靶浓度和增加的洗涤次数获得的增加的严格性。表7：用于第一成熟的选择策略的概览噬菌体颗粒的扩增：选择循环1和2之间的噬菌体颗粒的扩增基本如实施例1中描述的进行，具有以下例外。使用大肠杆菌ER2738用于噬菌体扩增，且以5x过量使用M13K07辅助噬菌体。选择循环2和4之间的噬菌体颗粒的扩增如下通过在溶液中进行细菌感染完成。在用噬菌体颗粒感染对数生长期大肠杆菌ER2738后，加入补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB，随后在37℃伴随旋转孵育持续30min。此后，用M13K07辅助噬菌体感染细菌。将感染的细菌通过离心成团，重悬于补充有100μMIPTG、25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄霉素的TSB-YE培养基中并在30℃生长过夜。将过夜培养物离心并将上清液中的噬菌体颗粒用PEG/NaCl缓冲液沉淀两次。最后，将噬菌体颗粒重悬于选择缓冲液，然后进入下一个选择循环。在最后的选择循环中，将对数生长期细菌用洗脱物感染，并稀释，然后涂布在补充有0.2g/l氨苄青霉素的TBAB平板(30g/l胰蛋白胨血琼脂基，Oxoid目录号CMO233B)上以形成用于ELISA筛选的单菌落。潜在结合物的测序：挑取来自不同的选择轨道的个体克隆用于测序。对ELISA筛选中运行的所有克隆进行测序。基本如实施例1中所述进行基因片段的扩增和基因片段的序列分析。Z变体的ELISA筛选：从IL-6成熟文库的选择的克隆随机挑取包含Z变体(被表达为Z变体ABD融合蛋白)的单菌落，并如实施例1中描述的培养。如在实施例1中的进行周质上清液的制备，但以6个冷冻解冻循环。使用0.58nM浓度的生物素化的hIL-6，基本上如实施例1中描述的进行ELISA筛选。初始IL-6结合物Z06814的周质级分被用作阳性对照。通过使用只含有ABD的周质产生阴性对照。人IL-6结合物的ELISAEC50分析：使选择的IL-6结合物经历如以上描述的利用ELISA分析对生物素化的hIL-6的系列稀释物的响应。以25nM的浓度加入生物素化的蛋白，并且以1:3逐步稀释直到11pM。还在不添加靶蛋白下测定所有Z变体作为背景对照。包含初始IL-6结合物Z06814(SEQID.NO:1512)的周质样品作为阳性对照被包括和分析。作为阴性对照，针对生物素化的hIL-6测定仅含有ABD的周质。使源自针对mIL-6的选择的两种结合物Z11612(SEQIDNO:151)和Z11616(SEQIDNO:152)如以上描述的经历利用ELISA分析对生物素化的mIL-6的系列稀释物的响应。以227nM的浓度加入生物素化的蛋白，并且以1:3逐步稀释直到104pM。利用GraphPadPrism5和非线性回归分析得到的值。结果成熟的IL-6结合Z变体的噬菌体展示选择：在各自包含4个循环的共12个平行轨道中进行选择。不同的选择轨道在靶浓度、靶类型(hIL-6或mIL-6)、选择时间、洗涤条件和洗脱缓冲液的pH方面不同。测序：对随机挑取的克隆测序。每个单独的Z变体如实施例1中所述提供识别号码Z#####。总计809种新的独特的Z变体分子被鉴定。58个残基长Z变体的氨基酸序列在图1和序列表中被列为SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871。在每个序列中，推测的IL-6结合基序(BM)从位置8延伸至位置36。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束(BMod)的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从位置7延伸到位置55。Z变体的ELISA筛选：在四个选择循环之后获得的克隆在96孔板中产生并利用ELISA针对hIL-6结合活性筛选。所有随机挑选的克隆进行分析。发现809种独特的Z变体中的796种针对0.58nM浓度的hIL-6给出3x阴性对照或更高(0.3-2.1AU)的响应。来自使用hIL-6作为选择靶的所有选择轨道的克隆显示出阳性信号。阴性对照具有0.078-0.102AU的吸光度。板的代表性组的空白对照的平均响应为0.087AU。IL-6结合物的ELISAEC50分析：Z变体的亚组基于以上描述的ELISA实验中的结果(分别对每个板上的阳性对照归一化的最高ELISA值)来选择，并以ELISA格式经历靶滴定。使周质样品与生物素化的hIL-6或mIL-6的系列稀释物一起孵育。还针对hIL-6测定具有初始结合物Z06814(SEQIDNO:1512)的周质样品作为阳性对照。分析获得的值并计算它们的各自EC50值(表8和9)。表8：针对hIL-6的计算的EC50值表9：针对mIL-6的计算的EC50值实施例5IL-6结合Z变体的第二成熟文库的设计和构建在该实施例中,基本上如实施例4中描述的构建第二成熟文库.使用该文库选择IL-6结合Z变体。材料和方法文库设计：文库主要基于在实施例4中描述的选择的人IL-6结合Z变体的序列。在新的文库中，根据主要基于来自第一成熟文库的Z变体，即SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871定义的序列的策略，使Z分子支架中的13个可变位置向某些氨基酸残基偏倚。通过ColibraTM技术产生随机化双链接头，ColibraTM技术利用连接和随后建立的双链DNA的限制性酶切使得能够掺入随机化三核苷酸构造块组。侧翼为限制性位点XhoI和SacI，编码Z变体氨基酸序列的部分地随机化的螺旋1和2的双链DNA5’-AAATAAATCTCGAGGTAGATGCCAAATACGCCAAAGAANNNNNNNNNGCTNNNNNNGAGATCNNNNNNCTGCCGAACCTGACCNNNNNNCAGNNNNNNGCCTTCATCNNNAAATTANNNGATGACCCAAGCCAGAGCTCATTATTTA-3’(SEQIDNO:1564；随机化密码子表示为NNN)的文库购自Isogenica(Essex,UK)。在表10中给出了新的文库中氨基酸残基的理论分布，包括Z分子支架中的八个可变氨基酸位置(10、11、14、18、24、25、27和32)和五个恒定氨基酸位置(9、13、17、28和35)。得到的理论文库大小为2.6x107个变体。文库构建和噬菌体储备液制备：基本上如实施例3中描述的构建文库。如实施例3中描述的制备文库的噬菌体储备液表10：文库设计，第二成熟结果文库构建和噬菌体储备液制备：基于具有被证实的结合特性的一组IL-6结合Z变体(实施例4)来设计新文库。设计的文库的理论大小为2.6x107种Z变体。转化到大肠杆菌ER2738细胞后通过滴定确定的文库的实际大小为1.8x109种转化株。文库质量通过测序192种转化株和通过将它们的实际序列与理论设计比较来测试。与理论文库比较，实际文库的内容物显示是令人满意的。因此成功构建了IL-6的潜在结合物的成熟文库。实施例6来自第二成熟文库的Z变体的选择、筛选和表征材料和方法成熟的IL-6结合Z变体的第二噬菌体展示选择：如实施例4中描述的将靶蛋白hIL-6生物素化。使用实施例5中描述的Z变体分子的第二成熟文库，基本上如实施例4中描述的针对hIL-6进行噬菌体展示选择，但有以下例外。对于所有轨道，在循环1中，选择体积为4ml。在循环2中，选择轨道1-2和1-3在一个共同的管中处理并且不被分离，直到在最后的1min洗涤后，届时它们被分别处理。同样，在循环4中，每组选择轨道1-1-1-1至1-1-1-3、1-1-1-4至1-1-1-6、1-1-2-1至1-1-2-3以及1-1-2-4至1-1-2-6分别在共同的管中处理并在最后的1min洗涤后分至三个单独的管中，并且然后分别利用表11中概括的不用洗涤策略处理。如实施例1中描述的，使用甘氨酸-HCl、pH2.2洗脱结合的噬菌体颗粒。基本上如实施例1中描述的，进行在选择循环之间的噬菌体颗粒的扩增。在表11中显示了选择策略和使用的参数的概览，描述了在选择轨道中在降低的靶浓度和增加的洗涤次数方面的不同。表11：用于第二成熟的选择策略的概览潜在结合物的测序：挑取来自不同的选择轨道的个体克隆用于测序。对经历ELISA筛选的所有克隆测序。基本如实施例1中所述进行基因片段的扩增和基因片段的序列分析。Z变体的ELISA筛选：从IL-6第二成熟文库的所选克隆随机挑取包含Z变体(如在实施例1中描述的被表达为Z变体ABD融合蛋白)的单菌落，并如实施例1中描述的培养。基本上如实施例1中描述的进行周质上清液的制备和ELISA筛选，并在150μlPBST0.05％中进行冷冻解冻并重复8次。以0.25nM的浓度使用生物素化的hIL-6。在每个ELISA板上，以一式两份使用IL-6结合物Z06814(SEQIDNO:1512)的周质级分作为阳性对照。作为阴性对照，针对生物素化的hIL-6测定仅含有ABD的周质。IL-6结合物的ELISAEC50分析：使选择的IL-6结合物经历如在实施例2中描述的利用ELISA分析对生物素化的hIL-6的系列稀释物的响应。以5nM的浓度加入生物素化的蛋白，并以1:3逐步稀释直到83fM。作为背景对照，还在不加入靶蛋白下测定所有Z变体。含有初始IL-6结合Z06814(SEQIDNO:1512)以及成熟结合物Z11632(SEQIDNO:7)的周质样品被包括作为阳性对照。作为阴性对照，针对生物素化的hIL-6测定仅含有ABD的周质。利用GraphPadPrism5和非线性回归分析得到的值。结果成熟的IL-6结合Z变体的第二噬菌体展示选择：在总共17个平行的轨道中进行选择，每个轨道含有四个循环。如表11中概述的，选择轨道在靶浓度、选择时间和洗涤条件方面不同。潜在结合物的测序：对随机挑取的克隆测序。每个单独的Z变体如实施例1中所述提供识别号码Z#####。总计707种新的独特的Z变体分子被鉴定。58个残基长Z变体的氨基酸序列在图1和序列表中被列为SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502。在每个序列中，推测的IL-6结合基序(BM)从位置8延伸至位置36。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束(BMod)的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从位置7延伸到位置55。Z变体的ELISA筛选：在四个选择循环之后获得的克隆在96孔板中产生并利用ELISA针对人IL-6结合活性筛选。所有随机挑选的克隆进行分析。发现707种独特的Z变体中的705种针对0.25nM浓度的hIL-6给出3x阴性对照或更高(0.3-2.3AU)的响应。源自所有选择轨道的克隆都显示出阳性信号。板上的阴性对照的平均响应为0.085AU。IL-6结合物的ELISAEC50分析：基于以上描述的ELISA实验中的结果选择Z变体的亚组。使表现出超过1.6AU的吸光度或在将响应针对每个板上的一式两份的阳性对照Z06814(SEQIDNO:1512)的平均响应归一化之后超过1.7的响应的所有Z变体经历如实施例4中描述的以ELISA格式的靶滴定。具有成熟结合物Z11632(SEQIDNO:7)以及初始结合物Z06814(SEQIDNO:1512)的周质样品也被测定作为阳性对照。分析获得的值并计算它们的各自EC50值(表12)。表12：从来自第二成熟的Z变体以及阳性对照Z06814和Z11632的ELISA滴定分析计算的EC50值实施例7IL-6结合Z变体的亚组的亚克隆、产生和表征在该实施例中，产生亲和力成熟的IL-6结合Z变体的亚组并通过SPR、ELISA、基于细胞的测定和CD来功能测定。SPR被用来测量Z变体与IL-6相互作用的动力学参数。竞争ELISA被用来研究Z变体与人IL-6蛋白的结合模式。基于TF-1细胞的测定被用来测定Z变体阻断IL-6依赖性信号传导的能力。CD被用来研究Z变体的二级结构并确定它们的熔解温度。材料和方法将Z变体亚克隆进表达载体：从文库载体pAY02592扩增以下14种IL-6结合Z变体的DNA：Z11632(SEQIDNO:7)、Z14630(SEQIDNO:6)、Z14700(SEQIDNO:8)、Z14712(SEQIDNO:9)、Z14861(SEQIDNO:4)、Z14862(SEQIDNO:10)、Z14976(SEQIDNO:1)、Z14984(SEQIDNO:5)、Z15015(SEQIDNO:2)、Z15036(SEQIDNO:11)、Z15110(SEQIDNO:12)、Z15122(SEQIDNO:3)、Z15126(SEQIDNO:13)和Z15142(SEQIDNO:14)。如实施例2中所述进行亚克隆。将Z基因片段亚克隆进表达载体pAY01448，导致编码序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。蛋白表达和在变性条件下的纯化：用包含每个各自的IL-6结合Z变体的基因片段的质粒转化大肠杆菌Rosetta细胞(Novagen)，并在37℃在100ml补充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中培养。在OD600＝2时，通过以1mM的终浓度加入IPTG来诱导表达，并使培养物在25℃孵育另外的16-20h。通过离心收获细胞。在基本上如实施例2中描述的变性条件下进行蛋白纯化。通过测量在280nm处的吸光度，使用各自蛋白的消光系数来确定蛋白浓度。IL-6结合Z变体的纯度通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE来分析。蛋白表达和在非变性条件下的纯化：用含有成熟变体Z11632(SEQIDNO:7)、Z14630(SEQIDNO:6)、Z14700(SEQIDNO:8)、Z14712(SEQIDNO:9)、Z14861(SEQIDNO:4)、Z14862(SEQIDNO:10)、Z14976(SEQIDNO:1)、Z14984(SEQIDNO:5)、Z15015(SEQIDNO:2)、Z15036(SEQIDNO:11)、Z15110(SEQIDNO:12)、Z15122(SEQIDNO:3)、Z15142(SEQIDNO:14)的基因片段、初始Z变体Z06814(SEQIDNO:1512)的基因片段以及对照Z变体Z04726(SEQIDNO:1553)的基因片段的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(NEB,目录号C2527I)。在37℃在1000ml补充有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养转化的细菌细胞。为了诱导蛋白表达，在OD600＝0.8时添加IPTG至0.1mM的最终浓度，并在25℃孵育培养物持续17h。通过在4℃和8000rpm离心持续30min收获细胞。丢弃上清液并在10mlPBS中重悬细胞团块。在通过声处理破碎细胞后，通过离心移除细胞碎片，并将每种上清液应用到用20ml洗涤缓冲液(20mMNaH2PO4、10mMNaCl、20mM咪唑，pH6.0)平衡的2mlNi-NTA柱(QIAGEN,目录号30410)上。通过用洗涤缓冲液洗涤移除污染物，并用洗脱缓冲液(20mMNaH2PO4、10mMNaCl、250mM咪唑，pH6.0)洗脱Z变体。使洗脱液在离子交换柱(LifeTechnologies,目录号4481317)上经历纯化，并通过增加盐浓度洗脱Z变体。然后使用VIVASPIN6柱(Sartorius,目录号VS0691)使洗脱液的缓冲溶液对PBS(10mMNa2HPO4、1.8mMKH2PO4、137mMNaCl、2.7mMKCl)交换。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析Z变体的纯度。ProteOn动力学分析：对在变性条件下纯化的6种带His6标签的Z变体确定对人IL-6的动力学常数(kon和koff)和亲和力(KD)。将IL-6结合变体Z06814(SEQIDNO:1512)、Z14861(SEQIDNO:4)、Z014976(SEQIDNO:1)、Z14984(SEQIDNO:5)、Z15015(SEQIDNO:2)和Z15122(SEQIDNO:3)在10mMNaAc缓冲液，pH4.5中稀释至5μg/ml，并分别固定在GLC芯片(Bio-Rad,目录号176-5011)上。利用胺偶联化学根据制造商的建议进行固定并且使用PBST0.05％作为运行缓冲液。在动力学实验中也使用PBST0.05％作为运行缓冲液，使用的流速为60μl/min。将分析物hIL-6在PBST0.05％运行缓冲液中稀释至50nM、12.5nM、3.1nM、0.78nM、0.19nM和0nM的终浓度并以一式三份注射3min，然后在运行缓冲液中解离持续90min。解离后，用补充有0.05％Tween20的HCl再生表面。在Bio-Radmanager软件(Bio-Rad)中利用1:1模型从传感图计算动力学常数。结合位点的分析：如实施例2中描述的评估14种成熟IL-6结合Z变体(在变性条件下纯化的)对人gp130(hgp130)和hIL-6/hIL-6Rα之间的相互作用的干扰。初始结合物Z06814和hIL-6Rα结合抗体托珠单抗被包括用于比较。基于TF-1细胞的测定：在具有L-谷氨酰胺(HyClone,目录号SH30027)补充有10％FBS(HyClone,目录号SH30919.03)、Pen-Strep(HyClone,目录号15140-163)和2ng/mlrhGM-CSF(R&DSystems,目录号215-GM-010)的RPMI1640中培养TF-1细胞。在使用前，将细胞在rhGM-CSF的不存在下在RPMI-1640中洗涤两次。然后对细胞计数并以4x104个细胞/孔的密度分配到96孔板(Corning,目录号3596)中。在单独的板中，在0.099nMrhIL-6(R&DSystems,目录号206-IL/CF)的存在下孵育Z变体(在天然条件下纯化的)的系列稀释物(浓度范围10-0.00061nM)、托珠单抗(Roche)和对照IgG(JacksonImmunoresearch,目录号Jac-009-000-003)。然后将这些预混合物转移至含有TF-1细胞的孔，所述含有TF-1细胞的孔被在37℃在加湿的5％CO2气氛中孵育了持续72h。在孵育的最后4个小时，使每孔包含10μlWST(DoGen,目录号EZ3000)。利用VictorX3板读取器(PerkinElmer)在450nM测量吸光度。通过使每个孔的吸光度除以每个板中的IL-6处理的孔的平均吸光度计算相对细胞生活力。通过对四参数剂量响应曲线的非线性回归来评价数据，并利用GraphPadPrism软件确定半最大抑制浓度(IC50)。CD分析：使用在天然条件下纯化的Z变体如实施例中描述的进行CD分析。结果ProteOn动力学分析：在ProteOn仪器上通过在包含不同的固定的Z变体的表面上注射多种浓度的hIL-6来分析6种带His6标签的IL-6结合Z变体与人IL-6的相互作用。表面的配体固定水平在每个100-220RU之间。利用1:1相互作用模型，hIL-6与Z变体的结合的动力学参数(KD、ka(kon)和kd(koff))的归纳在表13中给出。表13：hIL-6与Z变体的结合的动力学参数Z变体SEQIDNO：kon(M-1s-1)koff(s-1)KD(M)His6-Z0681415124.3x1058.8x10-52.0x10-10His6-Z1486143.6x1056.3x10-51.7x10-10His6-Z1497613.1x1052.7x10-58.8x10-11His6-Z1498453.0x1057.4x10-52.5x10-10His6-Z1501524.3x1057.2x10-51.7x10-10His6-Z1512233.1x1053.9x10-51.2x10-10结合位点的分析：所有成熟IL-6结合Z变体显示出对在预先形成的hIL-6/hIL-6Rα和hgp130之间的类似反式信号传导的相互作用的清晰的浓度依赖性阻断(图5)。每种成熟Z变体显示出比初始结合物Z06814和托珠单抗两者均高的阻断能力，即所述阻断能力会相应于小于1.6nM的IC50值。基于TF-1细胞的测定：进行基于TF-1细胞的测定，以评价IL-6结合Z变体在经典信号传导途径中的效力和效价。该测定显示所有的亲和力成熟的IL-6结合Z变体都能够阻断TF-1细胞的IL-6依赖性生长(图6)。在表14中显示了对Z变体以及对hIL-6Rα结合抗体托珠单抗计算的IC50值。表14：成熟Z变体阻断TF-1细胞的IL-6依赖性生长的IC50值Z变体SEQIDNO：IC50(M)His6-Z1163271.2x10-10His6-Z1463068.7x10-11His6-Z1470081.0x10-10His6-Z1471292.2x10-10His6-Z1486141.9x10-10His6-Z14862104.3x10-10His6-Z1497614.2x10-11His6-Z1498452.7x10-10His6-Z1501522.7x10-11His6-Z15036111.8x10-10His6-Z15110129.3x10-10His6-Z1512238.5x10-11His6-Z15142145.1x10-10His6-Z0681415121.3x10-10托珠单抗N/A4.1x10-10CD分析：对10种成熟Z变体确定的CD光谱显示，每种变体在20℃具有α-螺旋结构。通过可变温度测量确定的熔解温度(Tm)被显示于表15中。表15：成熟Z变体的亚组的熔解温度Z变体SEQIDNO：Tm(℃)His6-Z11632751His6-Z14630657His6-Z14700853His6-Z14712955His6-Z14861448His6-Z148621053His6-Z15015256His6-Z150361159His6-Z151101250His6-Z151421453实施例8与ABD融合的IL-6结合Z变体的体内活性:利用血清淀粉样蛋白A(SAA)小鼠模型探索与ABD融合的IL-6结合Z变体的体内阻断效果。急性期蛋白SAA从肝细胞分泌并可由促炎性细胞因子IL-1、IL-6和TNF诱导。由于人和小鼠细胞因子的序列同一性，人变体能够作用于其相应的小鼠受体并引起鼠SAA响应。要注意的是，人TNF蛋白仅能够与鼠TNFRII相互作用(不是鼠TNFRI)。材料和方法如实施例2中描述的，克隆IL-6靶向Z变体Z06814(SEQIDNO:1512)和结合不相关靶的对照Z变体Z04726(SEQIDNO:1535)，并以与ABD变体PP013(SEQIDNO:1554)融合的方式产生。在以5μg/kg腹膜内(i.p.)施用hIL-6(R&DSystems)之前9h，以多种剂量(0,0.025、2.5或25mg/kg体重)的Z06814-ABD皮下(s.c.)注射四组Balb/c小鼠(n＝8)。第5组小鼠(n＝8)接受25mg/kg的Z04726-ABD。两个另外的对照组小鼠分别接受PBS(n＝4)和25mg/kg的Z06814-ABD(n＝8)，但无随后的IL-6注射。20h后，通过心脏穿刺取得血液，并收集血清。通过ELISA(Tridelta)根据制造商的指示对血清测定鼠SAA的含量。简而言之，将稀释的血清样品与抗SAA-HRP一起添加至SAA预包被的板。将板孵育持续1h并且然后洗涤4次。添加TMB底物20min，然后用终止溶液终止反应。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。结果利用IL-6触发的血清淀粉样蛋白-A(SAA)释放的小鼠模型体内评估Z变体Z06814(SEQIDNO:1512)的抗关节炎效力。注射5μg/kg体重hIL-6之前9h，给予四组小鼠0、0.025、2.5或25mg/kg体重的IL-6结合Z06814-ABD融合蛋白或25mg/kg对照Z04726-ABD融合蛋白。在另外的22h后，测量SAA蛋白的水平并在不同组之间比较。在未接受Z06814-ABD或接受25mg/kg对照Z04726-ABD融合物的动物中，血清中的SAA蛋白水平增加至约500-600μg/ml的水平。仅给予PBS(且无hIL-6)的对照动物表现出16-64μg/ml的范围内的水平。在给予Z06814-ABD的动物中，以剂量依赖的方式测量到显著较低的SAA蛋白水平(图7)。对于给予最高剂量的Z06814-ABD(25mg/kg体重)的组，SAA蛋白水平与未给予hIL-6注射的动物一样低。实施例9复合物和对照多肽的产生材料和方法抗体和复合物的产生：构建靶向IL-6和TNF的4种不同复合物以及对TNF具有亲和力的抗体。使用重链序列(HC)和轻链序列(LC)HCAda(SEQIDNO:1557)和LCAda(SEQIDNO:1558)构建与市购可得的单克隆抗体阿达木单抗具有相同CDR序列和特异性的被表示为“Ada”的抗体。以氨基酸残基AE而非VD开始并具有另外的C末端氨基酸残基VD的IL-6靶向Z变体Z06814(SEQIDNO:1512)部分经由柔性15残基(GGGGS)3接头遗传融合至HCAda或LCAda的N末端，分别得到被表示为Z06814-HCAda和Z06814-LCAda的复合物，或遗传融合至相同链的C末端，分别得到复合物HCAda-Z06814和LCAda-Z06814。通过EvitriaAG(Switzerland)进行基因合成、克隆、通过在CHO细胞中瞬时基因表达产生和利用蛋白A亲和层析纯化。通过SDS-PAGE在非还原条件和还原条件两者下分析复合物和Ada的纯度。将15μg每种变体装载至12孔4-12％凝胶(LifeTechnologies)。对照多肽的产生：利用标准分子生物学技术(基本上如WO2009/077175中针对结合另一种靶的Z变体详细描述的)应用用于构建带有N末端His6标签的IL-6结合Z变体Z06814(SEQIDNO:1512)和结合不相关靶的Z变体Z04726(SEQIDNO:1553)的亚克隆策略。将Z基因片段亚克隆进表达载体pAY01448，得到编码序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。还将Z06814亚克隆为与白蛋白结合结构域变体PP013(SEQIDNO:1554)融合。由表达载体编码的构建体为MGSSLQ-[Z#####]-VDGS-PP013。用包含每个相应的Z变体的基因片段的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)，在37℃在补充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中培养。用IPTG诱导蛋白表达。通过声处理破碎成团的细胞并通过离心去除细胞碎片。通过亲和层析分别使用GraviTrapIMAC柱(GEHealthcare,目录号11-0033-99)或抗ABD琼脂糖(WO2014064237)纯化包含带His6标签的蛋白或ABD融合蛋白的每种上清液。还在1mlDetoxi-Gel内毒素去除柱(Pierce,目录号20344)上纯化ABD融合的Z变体。随后，对纯化的Z变体，将缓冲液交换为PBS(10mM磷酸盐、137mMNaCl、2.68mMKCl，pH7.4)。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析每个样品的纯度，并利用LC/MS分析来确认每种纯化的对照Z变体的身份。结果复合物构建体的产生：在图8中显示了产生的4种不同复合物的每一种的设计的示意图。通过在非还原条件下的SDS-PAGE分析包含产生的构建体的样品显示它们是高纯度的。在还原条件下的SDS-PAGE分析证实个体亚基的预期的大小与Z变体与抗体链的融合的位点一致(图9)。对照多肽的产生：在大肠杆菌中产生用N末端His6标签或用C末端ABD变体PP013构建的对照多肽。每种最终的蛋白制备物的SDS-PAGE分析显示出高的纯度，并通过HPLC-MS分析确认每种对照Z变体的正确身份和分子量。实施例10与IL-6和TNF结合的复合物的亲和力确定材料和方法在10mMNaAcpH4.5缓冲液中制备复合物Z06814-HCAda和LCAda-Z06814的每一种以及Ada和His6-Z06814的每一种即仅融合伴侣的每一种的10μg/ml溶液，并用于在ProteonGLC芯片(Bio-Rad)上经由氨基偶联化学固定蛋白。对于两种复合物和Ada，得到的固定水平为～1400-2000RU，并且对于His6-Z06814得到的固定水平为100-200RU。注射rhIL-6(R&DSystems)的50nM、10nM、2nM、0.4nM和0.08nM浓度的系列，并记录响应。重复该实验三次。在单独的一式三份的实验中，利用相同的浓度系列注射TNF(R&DSystems)。在所有的情况中，注射的持续时间为3min，流速为60μl/min并且解离时间为30min。根据制造商的指示减去对活化点/钝化点或在点区域之间中获得的缓冲液响应水平。利用Bio-RadManager软件(BioRad)分析数据。结果确定复合物Z06814-HCAda和LCAda-Z06814以及单独的个体亚基Ada和Z06814对两种靶蛋白IL-6和TNF的亲和力。与IL-6和TNF的相互作用的动力学参数((KD、ka(kon)和kd(koff))分别被归纳于表16和17。表16：IL-6与标示的多肽的结合的动力学参数。显示的值为三个测量值的平均值±标准差多肽kon(M-1s-1)koff(s-1)KD(M)Z06814-HCAda3.2x105±2.1x1032.3x10-4±2.8x10-57.2x10-10±8.4x10-11LCAda-Z068141.4x105±2.6x1031.3x10-4±1.6x10-59.3x10-10±1.2x10-10His6-Z068143.1x105±4.5x1031.5x10-4±1.2x10-55.0x10-10±3.4x10-11表17：TNF与标示的多肽的结合的动力学参数。显示的值为三个测量值的平均值±标准差多肽kon(M-1s-1)koff(s-1)KD(M)Z06814-HCAda6.2x105±4.2x1031.1x10-4±01.7x10-10±1.7x10-12LCAda-Z068148.4x105±4.8x1031.1x10-4±1.9x10-61.3x10-10±2.8x10-12Ada7.4x105±5.6x1031.6x10-4±8.2x10-72.2x10-10±8.2x10-13TNF与产生的Ada构建体的相互作用的解离常数KD被确定为220pM。对于Z06814-HCAda和LCAda-Z06814复合物，观察到的对TNF的KD值分别为170pM和130pM。这表明Z变体与抗体Ada的融合并不负面地影响抗体对TNF的亲和力；相反，观察到稍微更高的亲和力。当分析与IL-6的结合时，复合物Z06814-HCAda和LCAda-Z06814的亲和力仅微小地不同于单独的His6-Z06814的亲和力。实施例11生物活性的体外分析利用TF-1细胞测定确定如实施例9中描述的构建并产生的4种不同的复合物变体的效价，评价经典信号传导途径。TF-1细胞系响应人IL-6、TNF和GM-CSF而增殖。IL-6到与被称为gp130的信号传导受体亚基连接的细胞表面IL-6受体的直接信号传导被称为顺式信号传导。用仅IL-6或TNF或者用两者的组合刺激TF-1细胞。材料和方法在补充有10％FCS(Gibco)、Pen-Strep(Lonza)和2ng/mlrhGM-CSF(R&DSystems)的具有L-glut(Lonza)的RPMI1640中培养TF-1细胞。在使用前，将细胞在rhGM-CSF的不存在下在RPMI1640中洗涤两次。然后对细胞计数，并以4x104个细胞/孔的密度分配到96孔平底板中。在单独的板中，制备复合物Z06814-HCAda、Z06814-LCAda、HCAda-Z06814和LCAda-Z06814；带有N末端His6标签的阴性对照多肽Z04726(SEQIDNO:1553)；阳性对照多肽Z06814-ABD和Ada以及Ada和Z06814-ABD的混合物的系列稀释物(范围从400-0.004nM或10-0.00001nM)。在0.099nMrhIL-6(R&DSystems,目录号206-IL/CF)、0.023nMrhTNF(R&DSystems,目录号210-TA)或两种细胞因子的组合的存在下孵育样品。将预混合物转移至含有TF-1细胞的孔，所述含有TF-1细胞的孔被在37℃在加湿的5％CO2气氛中孵育了持续72h。在孵育的最后4个小时期间，每孔添加10μl的CCK-8(Fluka,SigmaAldrich)以确定增殖细胞的数目。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。通过对四参数剂量响应曲线的非线性回归来评价关于细胞生长的数据，并利用GraphPadPrism程序确定半最大抑制浓度(IC50)。TF-1细胞的IL-6/TNF依赖性增殖被抑制分子的抑制为Abs450减去含有细胞但不含IL-6的对照孔。结果在第一组实验中，测试4种不同的复合物Z06814-HCAda、Z06814-LCAda、HCAda-Z06814和LCAda-Z06814阻断TF-1细胞的hIL-6或TNF依赖性生长的能力。作为对照，仅Ada和Z06814-ABD被包括。在IL-6阻断测试中，所有4种复合物以及Z06814-ABD构建体以估计在从0.1nM至1nM的范围的IC50值显示出生长抑制能力。如预期的，TNF靶向Ada在该测定中未显示出任何效力(图10A)。在其中TNF被用于刺激细胞的实验中，所有4种基于Ada的复合物以及Ada自身显示出对生长刺激信号的有效阻断，全部具有约10pM的IC50值(图10B)。如预期的，靶向IL-6而不靶向TNF的Z06814-ABD在该测定中未显示出任何效力。在第二组实验中，用IL-6和TNF两者同时刺激TF-1细胞。研究4种不同的复合物的每一种的阻断效应，并与Ada、Z06814-ABD以及Ada和Z06814-ABD的1:2(即相对于结合部分的数目的等摩尔浓度)的混合物比较。结果显示所有4种复合物比仅Ada或Z06814-ABD更好地抑制TF-1细胞增殖(图10C)。当单独地添加时，Ada和Z06814-ABD两者均显示出在最高浓度达到50％生活力值的生长抑制效应，表明近似相等的细胞生长刺激效应来自IL-6和TNF。当添加Ada和Z06814-ABD的1:2的混合物时，能观察细胞生长的完全阻断，表明协同的阻断效应。对于Z06814-HCAda复合物观察到相同的效应，表明它的两种组分均是功能性的并且它们能够独立地抑制TF-1细胞增殖。对于结合不相关靶的阴性对照Z变体His6-Z04726，未观察到效应(图10C)。实施例12生物活性的体内分析利用血清淀粉样蛋白A(SAA)小鼠模型在体内研究Z06814-HCAda的炎症阻断效应。急性期蛋白SAA从肝细胞分泌并可由促炎性细胞因子IL-1、IL-6和TNF诱导。由于人和小鼠细胞因子之间的高序列同源性，人变体能够作用于其相应的小鼠受体并引起鼠SAA响应。但是，人TNF蛋白只能够与鼠TNF受体II(TNFRII)相互作用，而不能与鼠TNF受体I(TNFRI)相互作用。材料和方法用70mg/kg、7mg/kg、0.7mg/kg或0mg/kg(运载体)Z06814-HCAda或Ada腹膜内(i.p.)注射7组Balb/c小鼠(n＝6)。注射9h后，i.p.施用rhIL-6和rhTNF的混合物，每组剂量为2.5μg/kg。16h后，通过眼眶穿刺取得血液，并收集血清。通过ELISA(Tridelta，目录号KMA0021)根据制造商的指示对收集的血清测定鼠SAA的含量。简而言之，将稀释的血清样品与抗SAA-HRP一起添加至用SAA预包被的板。将板孵育持续1h并且然后洗涤4次。添加TMB底物并在20min后用终止溶液终止反应。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。结果利用IL-6触发的血清淀粉样蛋白-A(SAA)释放的小鼠模型体内测定Z06814-HCAda的抗关节炎效力。结果显示，尽管仅高剂量(70mg/kg)的TNF阻断抗体Ada只导致观察到的血清SAA水平的50％降低，但相同剂量的Z06814-HCAda将血清SAA水平降低至低于所使用的测试试剂盒的定量限(LOQ)的浓度(图11)。这表明IL-6信号传导阻断多肽Z06814和TNF阻断Ada抗体在一个分子内的组合导致能够双重作用并因此能够对IL-6威胁和TNF威胁两者给予医疗救济的复合物。实施例13靶向IL-6和TNF的成熟复合物的产生和结合活性材料和方法靶向IL-6和TNF的复合物的产生：构建靶向IL-6和TNF的3种不同的复合物。使用重链序列(HC)和轻链序列(LC)HC2Ada(SEQIDNO:1559)和LCAda(SEQIDNO:1558)构建与市购可得的单克隆抗体阿达木单抗具有相同CDR序列和特异性的被表示为“Ada2”的抗体。以氨基酸残基AE而非VD开始的IL-6靶向Z变体Z14976(SEQIDNO:1)部分经由柔性5残基(GGGGS)或15残基(GGGGS)3接头遗传融合至LCAda的N末端，得到分别表示为Z14976-(GGGGS)-LCAda和Z14976-(GGGGS)3-LCAda的复合物，或经由柔性5残基(GGGGS)接头遗传融合至LCAda的C末端，得到表示为LCAda-(GGGGS)-Z14976的复合物。将重链和Z变体融合的轻链构建体分别克隆进pcDNA3.1(Invitrogen)或pOptiVEC(Invitrogen)。IL-6和TNF靶向复合物利用CHO-S系统(Invitrogen)来产生，并利用ProteinA层析(GEHealthcare,目录号17-1279-01)来纯化。通过SDS-PAGE在非还原条件(6％丙烯酰胺凝胶)和还原条件(12％丙烯酰胺凝胶)两者下分析复合物的纯度。ELISA结合活性：在ELISA测定中分析TNF和IL-6靶向复合物的结合。用在PBS缓冲液中的0.5μg/mlTNF或IL-6在4℃直接包被半区96孔ELISA板过夜并用100μl3％脱脂乳/PBS(137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、1.8mMKH2PO4)在RT封闭孔1h。然后，从在3％脱脂乳/PBS中的1μg/ml的开始浓度向每个孔添加30μl系列稀释的复合物和对照抗体。将板在RT孵育2h，随后用PBST0.05％洗涤4次。将HRP缀合的抗人IgGFc第二抗体(Pierce,目录号31423)在3％脱脂乳/PBS中以1:5000稀释并添加至孔，然后1h孵育。如以上描述的洗涤后，将30μlImmunoPureTMB底物(Pierce，目录号34014)加入至孔中，并将板根据制造商的建议处理。阿达木单抗(Abbvie,LOT4435XH04)被用作对于TNF结合活性的阳性对照并被用作对于IL-6结合活性的阴性对照。另外，在两个测定中，不相关的IgG(JacksonImmunoresearch,目录号Jac-009-000-003)被包括用作阴性对照。结果靶向IL-6和TNF的复合物的产生：在图12中显示了纯化的复合物在非还原条件和还原条件下的SDSpage分析。在还原条件下进行的分析(图12B)证实了个体亚基的预期大小。ELISA结合活性：对于所有的测试复合物，即Z14976-(GGGGS)-LCAda、Z14976-(GGGGS)3-LCAda和LCAda-(GGGGS)-Z14976，ELISA结合分析的结果证实了保留的对TNF的结合。对于复合物Z14976-(GGGGS)-LCAda和Z14976-(GGGGS)3-LCAda，IL-6结合被保留，但对于LCAda-(GGGGS)-Z14976，IL-6结合未被保留(图13B)。对于每个相应的相互作用近似计算的EC50值被显示于表18中。表18：对于与TNF和IL-6的相互作用的近似EC50值实施方案的分项列表1.复合物，所述复合物包含至少一种IL-6结合多肽和至少一种抗体或其抗原结合片段，其中所述IL-6结合多肽包含IL-6结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29其中，彼此独立地，X3选自A、F、H、K、Q、R、S、W和Y；X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W和Y；X11选自A、I、K、L、M、N、R、S、T和V；X16选自N和T；X17选自A、I、T和V；X18选自D、E、G、H、K、N、Q、R、S和T；X20选自I、L、M、R、T和V；X21选自A、S、T和V；X25选自I、M、Q、S、T、V和W；X26选自K和S；X28选自F、L、M和Y；且X29选自D和R；和ii)与在i)中定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。2.根据项目1所述的复合物，其中在序列i)中：X3选自A、H、K、Q、R和Y；X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、T、V、W和Y；X11选自A、I、K、L、N、S、T和V；X16为T；X17选自A、I、T和V；X18选自D、E、H、K、N、Q、R、S和T；X20选自I、L、M、R和V；X21选自A、S和V；X25选自I、Q、S、T、V和W；X26为K；X28选自F、L、M和Y；且X29为D。3.根据项目1或2所述的复合物，其中序列i)满足以下11个条件I-XI中的至少6个：I.X3选自K和R；II.X11选自A和L；III.X16为T；IV.X17选自I和V；V.X18选自D和E；VI.X20为M；VII.X21为A；VIII.X25选自S和T；IX.X26为K；X.X28为F；以及XI.X29为D。4.根据项目3所述的复合物，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少7个。5.根据项目4所述的复合物，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少8个。6.根据项目5所述的复合物，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少9个。7.根据项目6所述的复合物，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少10个。8.根据项目7所述的复合物，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的全部。9.根据任一前述项目所述的复合物，其中X17X20X21选自VMA和IMA。10.根据项目1-8中任一项所述的复合物，其中X20X21X28是MAF。11.根据项目1-8中任一项所述的复合物，其中X17X20X28选自VMF和IMF。12.根据项目1-8中任一项所述的复合物，其中X17X21X28选自VAF和IAF。13.根据任一前述项目所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-1551组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。14.根据项目13所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-1502组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。15.根据项目14所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。16.根据项目14所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。17.根据项目13所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。18.根据项目17所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。19.根据项目17所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-152组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。20.根据项目18或19所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-150组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。21.根据项目19所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。22.根据项目20所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。23.根据项目18所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。24.根据项目23所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。25.根据项目24所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-14组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。26.根据项目16、22和25中任一项所述的复合物，其中序列i)相应于选自由SEQIDNO:1-5组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。27.根据项目24所述的复合物，其中序列i)相应于SEQIDNO:1512中从位置8至位置36的序列。28.根据任一前述项目所述的复合物，其中所述IL-6结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。29.根据项目28所述的复合物，其中所述IL-6结合基序基本上形成所述三螺旋束蛋白结构域内具有相互连接环的双螺旋的部分。30.根据项目29所述的复合物，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体结构域。31.根据项目30所述的复合物，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域或其衍生物。32.根据任一前述项目所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽包含结合模块BMod,所述结合模块BMod的氨基酸序列选自以下：iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ；其中[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序，条件是X29为D；Xa选自A和S；Xb选自N和E；Xc选自A、S和C；Xd选自E、N和S；Xe选自D、E和S；Xf选自A和S；以及iv)与由iii)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。33.根据项目1-31中任一项所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽包含结合模块BMod,所述结合模块BMod的氨基酸序列选自以下：v)K-[BM]-QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ,其中[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序，条件是X29为R；Xa选自A和S；Xb选自N和E；Xc选自A、S和C；Xd选自E、N和S；Xe选自D、E和S；Xf选自A和S；以及vi)与由v)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。34.根据项目1-32中任一项所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-1551组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。35.根据项目34所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-1502组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。36.根据项目35所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。37.根据项目35所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。38.根据项目34所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。39.根据项目38所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。40.根据项目35或38所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-152组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。41.根据项目39或40所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-150组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。42.根据项目40所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。43.根据项目41所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。44.根据项目39所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。45.根据项目44所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。46.根据项目45所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-14组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。47.根据项目36、42和46中任一项所述的复合物，其中序列iii)相应于选自由SEQIDNO:1-5组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。48.根据项目45所述的复合物，其中序列iii)相应于SEQIDNO:1512中从位置7至位置55的序列。49.根据任一前述项目所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：vii)YA-[BMod]-AP；其中[BMod]是如项目32-48的任一项中定义的IL-6结合模块；和viii)与由vii)定义的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。50.根据项目1-48中任一项所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：ix)FN-[BMod]-AP；其中[BMod]是如项目32-48的任一项中定义的IL-6结合模块；和x)与由ix)定义的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。51.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物包含选自以下的氨基酸序列：ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；以及AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；其中[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序。52.根据项目1-49中任一项所述的复合物，所述复合物包含选自以下的氨基酸序列：xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；其中[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序；以及xii)与xi)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。53.根据项目1-49中任一项所述的复合物，所述复合物包含选自以下的氨基酸序列：xiii)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；其中[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序；以及xiv)与xiii)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。54.根据项目52所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-1551组成的组。55.根据项目54所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-1502组成的组。56.根据项目55所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871组成的组。57.根据项目55所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502组成的组。58.根据项目54所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515组成的组。59.根据项目58所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515组成的组。60.根据项目55或58所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-152组成的组。61.根据项目59或60所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-150组成的组。62.根据项目60所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152组成的组。63.根据项目61所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150组成的组。64.根据项目59所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515组成的组。65.根据项目64所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512组成的组。66.根据项目65所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-14组成的组。67.根据项目57、63和66中任一项所述的复合物，其中序列xi)选自由SEQIDNO:1-5组成的组。68.根据项目65所述的复合物，其中序列xi)为SEQIDNO:1512。69.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物在至少一个C-末端和/或N-末端包含另外的氨基酸。70.根据项目69所述的复合物，其中所述另外的氨基酸改进所述复合物的产生、纯化、体内或体外的稳定、偶联或检测。71.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物包含多聚体形式的所述IL-6结合多肽，诸如包含至少2个IL-6结合多肽单体单元，所述单体单元的氨基酸序列可以是相同或不同的。72.根据项目71所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽单体单元共价地偶联在一起。73.根据项目72所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽单体单元为融合蛋白的形式。74.根据项目73所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽单体单元为二聚体形式。75.根据任一前述项目所述的复合物，其中所述至少一个抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab′)2片段、Fc片段、Fv片段、单链Fv片段、(scFv)2和结构域抗体。76.根据项目75所述的复合物，其中所述至少一个抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：全长抗体、Fab片段和scFv片段。77.根据项目76所述的复合物，其中所述至少一个抗体或其抗原结合片段为全长抗体。78.根据项目75-77中任一项所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或其抗原结合片段。79.根据项目75-78中任一项所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：人抗体、人源化抗体和嵌合抗体，及其抗原结合片段。80.根据项目79所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体或人源化抗体，或其抗原结合片段。81.根据任一前述项目所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段对抗原具有亲和力，所述抗原例如与免疫系统的疾病或紊乱有关的抗原或与癌症有关的抗原。82.根据项目81所述的复合物，其中所述抗原选自由以下组成的组：血管生成蛋白2(Ang-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子、TNFSF11、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、胰岛素样生长因子、白介素1α、白介素1β、白介素10、白介素17A、白介素12、白介素23、白介素33、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、高迁移率族蛋白B1、脂多糖、toll样受体4、神经生长因子、趋化因子C-C基序配体19、趋化因子C-C基序配体21、趋化因子C-X-C基序配体4和干扰素α。83.根据项目82所述的复合物，其中所述抗原选自由以下组成的组：白介素1β、肿瘤坏死因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白介素12、白介素17、白介素23、高迁移率族蛋白B1、脂多糖和toll样受体4。84.根据项目82-83中任一项所述的复合物，其中所述抗原为例如选自由以下组成的组的细胞因子：白介素1β、肿瘤坏死因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白介素12、白介素17和白介素23。85.根据项目84所述的复合物，其中所述抗原为肿瘤坏死因子。86.根据项目85所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由阿达木单抗、英夫利昔、戈利木单抗和赛妥珠单抗及其抗原结合片段组成的组，例如选自由阿达木单抗、英夫利昔、戈利木单抗和赛妥珠单抗组成的组的全长抗体。87.根据项目86所述的复合物，其中抗体或其抗原结合片段为阿达木单抗或其抗原结合片段，例如全长阿达木单抗。88.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物能够阻断经由顺式信号传导途径和/或反式信号传导途径的IL-6依赖性信号传导。89.根据项目88所述的复合物，其中阻断IL-6信号传导途径的半最大抑制浓度为至多1x10-6M，诸如至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。90.根据项目88-89中任一项所述的复合物，所述复合物能够阻断IL-6/IL-6Rα与gp130的相互作用。91.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物能够阻断与IL-6的结合，以使得相互作用的EC50值为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。92.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物能够阻断与IL-6的结合，以使得相互作用的KD值为至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M，诸如至多1x10-11M。93.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物能够阻断TNF依赖性信号传导。94.根据项目93所述的复合物，其中阻断TNF依赖性信号传导的半最大抑制浓度(IC50)为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M，诸如至多1x10-11M。95.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物能够与TNF结合，以使得相互作用的KD值为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M，诸如至多1x10-11M，诸如至多1x10-12M。96.根据任一前述项目所述的复合物，所述复合物为融合蛋白或缀合物。97.根据任一前述项目所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽被附连至所述抗体或其抗原结合片段的重链的N末端或C末端。98.根据项目1-96中任一项所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽被附连至所述抗体或其抗原结合片段的轻链的N末端或C末端。99.根据项目97所述的复合物，其中所述IL-6结合多肽被附连至所述抗体或其抗原结合片段的轻链和重链的N末端和/或C末端。100.根据项目96-99中任一项所述的复合物，所述复合物为融合蛋白。101.根据项目100所述的复合物，所述复合物还包含诸如选自由以下组成的组的至少一个接头：柔性的氨基酸接头、刚性的氨基酸接头和可裂解的氨基酸接头。102.根据项目101所述的复合物，其中所述接头被布置在所述IL-6结合多肽和所述抗体或其抗原结合片段之间。103.根据项目102所述的复合物，其中所述接头为柔性的接头，所述柔性的接头包含选自由甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸组成的组的氨基酸残基。104.根据项目103所述的复合物，其中所述接头具有选自以下的通式(GnSm)p和(SmGn)p，其中，独立地，n＝1-7，m＝0-7，n+m≤8且p＝1-7。105.根据项目104所述的复合物，其中n＝1-5。106.根据项目104-105中任一项所述的复合物，其中m＝0-5。107.根据项目104-106中任一项所述的复合物，其中p＝1-5。108.根据项目105-107中任一项所述的复合物，其中n＝4，m＝1且p＝1-4。109.根据项目108所述的复合物，其中所述柔性的接头为(GGGGS)3或GGGGS。110.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据任一前述项目所述的多肽。111.表达载体，所述表达载体包含根据项目110所述的多核苷酸。112.宿主细胞，所述宿主细胞包含根据项目111所述的表达载体。113.产生根据项目1-109中任一项所述的复合物的方法，所述方法包括-在容许所述融合蛋白从所述表达载体表达的条件下培养根据项目112所述的宿主细胞，和-分离所述多肽。114.组合物，所述组合物包含根据项目1-109的任一项所述的复合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。115.根据项目114所述的组合物，所述组合物还包含至少一种另外的活性剂，例如选自免疫应答改变剂和抗癌剂的剂。116.根据项目1-109中任一项所述的复合物或根据项目114-115中任一项所述的组合物，用于口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用。117.根据项目1-109中任一项所述的复合物或根据项目114-115中任一项所述的组合物，用作药物。118.根据项目117所述的用于使用的复合物或组合物，其中所述复合物或所述组合物调控IL-6功能和另外的抗原的功能，所述另外的抗原例如在体内与免疫系统的疾病或紊乱有关的抗原或与癌症有关的抗原。119.根据项目118所述的用于使用的复合物或组合物，其中所述复合物或所述组合物在体内调控IL-6功能和TNF功能。120.根据项目117-119中任一项所述的用于使用的复合物或组合物，用于治疗IL-6相关紊乱，诸如与IL-6和TNF相关的紊乱。121.根据项目120所述的用于使用的复合物或组合物，其中所述IL-6相关紊乱选自由自身免疫疾病、炎性疾病、癌症和肿瘤疾病组成的组，例如选自慢性炎性疾病和炎症诱导的癌症的IL-6相关紊乱。122.根据项目121所述的用于使用的复合物或组合物，其中所述紊乱选自由以下组成的组:类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、脉管炎、银屑病性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、慢性炎性肠疾病例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、格雷夫斯病、贝赛特氏病、葡萄膜炎、巨细胞动脉炎、多发性硬化症、全身性硬化症、全身性红斑狼疮、多肌炎、风湿性多肌痛、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、复发性多软骨炎、胰腺炎、腹膜炎、肾炎、川崎病、干燥综合征和成人斯蒂尔病。123.根据项目121所述的用于使用的复合物或组合物，其中所述紊乱为癌症或肿瘤疾病，诸如选自由以下组成的组的癌症或肿瘤疾病：结肠炎相关癌症、肾癌(renalcancer)、肾癌(kidneycancer)、前列腺癌、恶性淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、乳腺癌和肺癌。124.根据项目121所述的用于使用的复合物或组合物，其中所述紊乱选自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。125.治疗IL-6相关紊乱的方法，所述方法包括对需要其的受试者施用有效量的根据项目1-109中任一项所述的复合物或根据项目114-115中任一项所述的组合物。126.根据项目125所述的方法，其中所述紊乱为与IL-6和TNF相关的紊乱。127.根据项目125或126所述的方法，其中所述紊乱选自自身免疫疾病、炎性疾病、癌症和肿瘤疾病，例如选自慢性炎性疾病和炎症诱导的癌症的IL-6相关紊乱。128.根据项目127所述的方法，其中所述紊乱选自由以下组成的组:类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、脉管炎、银屑病性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、慢性炎性肠疾病例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、格雷夫斯病、贝赛特氏病、葡萄膜炎、巨细胞动脉炎、多发性硬化症、全身性硬化症、全身性红斑狼疮、多肌炎、风湿性多肌痛、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、复发性多软骨炎、胰腺炎、腹膜炎、肾炎、川崎病、干燥综合征和成人斯蒂尔病。129.根据项目127所述的方法，其中所述紊乱为癌症或肿瘤疾病，诸如选自由以下组成的组的癌症或肿瘤疾病：结肠炎相关癌症、肾癌(renalcancer)、肾癌(kidneycancer)、前列腺癌、恶性淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、乳腺癌和肺癌。130.根据项目127所述的方法，其中所述紊乱选自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。当前第1页1 2 3