胚胎评定的制作方法

本发明的某些实施方案涉及用于评定胚胎的发育潜力的方法和装置，尤其涉及根据胚胎的发育潜力对胚胎评级/评分。

不孕影响着全球超过8千万人。据估计在所有的夫妻中有10％都经历原发不孕或继发不孕。体外受精(IVF)是可选择的医学治疗，它可以为原本不能怀孕的夫妻提供实现怀孕并成为父母的机会。这是一种从女方卵巢取出卵子(卵母细胞)然后在实验室里用精子使卵子受精的过程。在这个过程中产生的胚胎然后被放入子宫中以实现可能的着床。在受精和移植期间，胚胎典型地储存在恒温箱的培养室中持续2-6天，在此期间例如通过成像法定期监控这些胚胎以评定其发育。控制恒温箱内的条件，例如温度和气体组成，目的通常是模仿输卵管和子宫中的条件。

在一个典型的IVF周期中，使来自单个患者的许多卵子受精并培养得到的胚胎。然而，通常并不是所有被培养的胚胎都移植到患者子宫中。这是为了降低潜在危险的多胞胎的风险。典型地将基于已经培养的胚胎的发育潜力的评定结果来选择用于移植的胚胎。被确定具有最大的发育成活胎的潜力的胚胎相比其同组里的其它胚胎将被优先选择。因此，IVF治疗的一个重要方面是评定包括一组胚胎在内的胚胎的发育潜力，即确定胚胎质量，其中胚胎质量是表示胚胎被成功植入、在移植后在子宫中发育并导致健康婴儿出生的可能性的预测。

近年来开发的用于评定胚胎质量的一个有力工具是时差胚胎成像。时差胚胎成像包括在胚胎发育期间获得胚胎的影像。这允许确定各种发育事件(例如细胞分裂，和/或与胚胎发育有关的其它特征的存在或不存在，例如不同阶段的细胞均一性(均匀度)、原核(PN)的出现和多核现象(MN)的存在)的时点。

这些时间和特征有时候可以被称为胚胎的形态动力学/形态参数。在这点上，术语“形态动力学”和“形态”在本文中一般互换地使用，虽然在一些方面，形态动力学特征可以被严格地视为形态特征的一个子集，也就是与时点特别相关的那些形态特征。研究已经显示各种胚胎发育事件的时点和持续时间以及各种其它发育特征的存在或不存在如何与胚胎的发育潜力产生关联。

可以使用已知植入数据(KID)构建、评估和验证考虑了形态动力学参数的胚胎筛选的模型(即用于评定胚胎发育潜力的模型)，其中阳性KID胚胎是已知随后被植入的胚胎，而阴性KID胚胎是已知随后不被植入的胚胎。

作为用于评定胚胎发育潜力的简单模型的一个实例，已经发现从一个细胞分裂成两个细胞的相对较早的时间是高质量胚胎的指标。还发现其它形态动力学参数(例如当从两个细胞分裂成四个细胞时两次分裂的同步程度)对胚胎质量是敏感的。更一般地来说，已经提出了用于从胚胎的体外发育的相关参数评定胚胎发育潜力的各种方法。因此，时差成像的目的是确定与各种胚胎发育事件的时点相关的各种参数和/或与胚胎发育相关的其它特征，例如在不同阶段的细胞均匀性(均匀度)、原核(PN)的出现和多核现象(MN)的存在。从一系列时差影像确定与胚胎发育相关的值和特征有时被称为注释。

虽然已经发现与胚胎发育相关的各种时点和特征有助于提供胚胎发育的质量指标，但是根据培养胚胎的条件和分配各种事件的方式，不同胚胎的指示高质量胚胎的这些质量指标的具体值可能是不同的。举例来说，一个诊所可能用某一百分比的氧气气氛和某一温度培养胚胎，而另一个诊所可能用不同百分比的氧气气氛和不同温度培养胚胎。这意味着胚胎发育中的指定形态事件的最佳时点在不同的诊所/恒温箱条件中可能是不同的。

图1是表示这个原则的曲线图(这个曲线图主要是示意性的并且不基于真实数据)。因此，图1显示植入可能性Imp％如何随任意发育事件X的时点(例如特定细胞周期的持续时间或特定卵裂的时间)变化的一个实例。实线曲线表示作为根据第一组条件发育的胚胎的X的实测时点的函数的植入可能性的变化，而虚线曲线表示根据第二组条件发育的胚胎的变化。举例来说，实线曲线可能表示在相对低的氧气气氛中培养的胚胎，而虚线曲线可能表示在相对高的氧气气氛中培养的胚胎。作为另一个实例，实线曲线可能表示已经通过胞质内精子注射(ICSI)受精的胚胎，而虚线曲线可能表示已经通过体外受精(IVF)受精的胚胎。作为另一个实例，这两个曲线可能表示在不同诊所里发育的胚胎。图1中的两个曲线整体上彼此偏移，因为在不同条件下培养的胚胎在至少一些方面通常会以不同速率发育。

因此，虽然图1显示与发育事件X相关的时间可用于鉴别在两组条件下发育的胚胎中的具有相对高的植入可能性的胚胎，但是与高植入可能性相关的X的实际值对于这两个群组是不同的。举例来说，对于在第一组条件(实线)下培养的胚胎来说，X的时点的最佳范围可能被认为是从h1到h2，而对于在第二组条件(虚线)下培养的胚胎来说，最佳范围可能被认为是从h3到h4。这在实践上意味着对于不同群体将需要用于评定胚胎发育潜力的不同模型。

然而，如果可以确立适用于各种不同条件下发育的胚胎的单一模型，也就是说其可被称为普遍适用性模型(或至少是一种适用于一系列不同条件下发育的胚胎的模型)，那么这将是优选的。普遍适用的模型不仅简化了选择模型以用于不同胚胎发育条件的过程，而且在一些情况下可能不存在足够的可用于给定组的发育条件的KID数据以允许可靠地确定用于那些具体条件的模型，例如在“新”诊所的情况下。提供用于图1中所表示的示意性情形的单一模型的一个简单方案是假定所有胚胎的X的时点的最佳范围都在h1与h4之间。然而，这将导致来自每一群体的胚胎被错误地分类成具有高植入可能性，这当然不是令人满意的解决方案。

因此，期望开发用于评定胚胎(例如体外培养的人胚胎)发育潜力(生活力/质量)的模型，其适用于在一系列不同条件下发育的胚胎。

技术实现要素：

根据本发明的第一方面，提供了一种评级胚胎以指示其发育潜力的方法；所述方法包括：在观察期中获得与所述胚胎的形态发育相关的多个特征的值；对于所述胚胎中的各自胚胎确定胚胎是否已经发生直接卵裂事件量度，和对被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于未被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎；和对于未被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎，确定所述胚胎的预定义的发育阶段的持续时间的量度是否超过预定义的阈值持续时间，和对所述预定义的发育阶段的持续时间被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于所述预定义的发育阶段的持续时间未被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎；和对于所述预定义的发育阶段的持续时间未被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎，确定所述胚胎的第一预定义的发育阶段相对于所述胚胎的第二预定义的发育阶段的相对持续时间的量度是否处于预定义的范围以外，和对所述相对持续时间处于所述预定义的范围以外的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于所述相对持续时间不处于所述预定义的范围以外的胚胎。

根据本发明的第二方面，提供了一种评级胚胎以指示其发育潜力的装置；所述装置包括：数据输入元件，其被配置成用于在观察期中获得与所述胚胎的形态发育相关的多个特征的值；和处理器元件，其被配置成用于对于所述胚胎中的各自胚胎确定胚胎是否已经发生直接卵裂事件的量度，和对被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于未被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎；和对于未被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎，确定所述胚胎的预定义的发育阶段的持续时间的量度是否超过预定义的阈值持续时间，和对所述预定义的发育阶段的持续时间被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于所述预定义的发育阶段的持续时间未被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎；和对于所述预定义的发育阶段的持续时间未被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎，确定所述胚胎的第一预定义的发育阶段相对于所述胚胎的第二预定义的发育阶段的相对持续时间的量度是否处于预定义的范围以外，和对所述相对持续时间处于所述预定义的范围以外的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于所述相对持续时间不处于所述预定义的范围以外的胚胎。

本发明的其它方面包括一种非暂时性的计算机程序产品，其携带用于执行本发明的第一方面的方法的机器可读指令，和一种被加载并可操作地执行用于执行本发明的第一方面的方法的所述机器可读指令的装置。

本发明的其它方面和特征由权利要求书定义。

应了解本文中关于本发明的第一方面和其它方面描述的本发明的特征和方面在适当时同样适用于根据本发明的其它方面的实施方案且可以不仅仅以上文描述的具体组合形式和这些实施方案组合。

应了解上文中结合本发明的第一方面和其它方面描述的本发明的特征和方面在适当时同样适用于根据本发明的其它方面的且不单单采取上文描述的具体组合形式的本发明的实施方案，并且可以和这些实施方案组合。

附图说明

现在仅参考以下图示，借助于实例描述本发明，其中：

图1是高度示意图，其表示对于在两组不同条件下培养的两个胚胎群体来说，植入可能性如何随与任意发育事件有关的时点变化；

图2图解表示本文中对于胚胎卵裂模式所使用的显示关于获得的影像的一些专门术语，卵裂时间(t2到t5)、细胞周期的持续时间(cc1到cc3)和同步性(s2和s3)；

图3图解表示在从初始授精(在时间t＝0时)开始的不同胚胎发育事件中和在卵裂时间t2-t8中的胚胎，其中使用如本文所用的时点术语的一些相关方面；

图4图解表示根据本发明的一个实施方案用于确定胚胎的发育潜力的装置；

图5是流程图，其图解表示根据本发明的一些实施方案基于胚胎的发育潜力对胚胎评级的方法；

图6是分类树图，其图解表示图5的模型对3,275个具有已知植入数据的胚胎(KID胚胎)的应用；

图7是柱状图，其表示根据权利要求5的方法确定的不同得分中，与图6的分类树有关的3,275个KID胚胎中的各种胚胎的分布；

图8、10和12是分类树，其图解表示根据本发明的其它实施方案，其它模型对3,275个KID胚胎的应用；

图9、11和13是柱状图，其表示在根据由图8、10和12中的分类树分别表示的模型确定的不同得分中，3,275个KID胚胎中的各种胚胎的分布；

图14到17是分类树，其图解表示根据本发明的实施方案，同一个模型对3,275个KID胚胎的不同子群体的应用；

图18表示在已知受精后120小时是否发育到囊胚期的10,316个胚胎的分析中，针对根据图6中表示的模型对于每一胚胎确定的每一不同得分，受精后120小时发育到囊胚期的胚胎的比例。

具体实施方式

本文讨论/描述了本发明的特定实施例和实施方案的方面和特征。特定实施例和实施方案的一些方面和特征可以常规实施，并且出于简洁的目的，没有详细讨论/描述这些方面和特征。因此应了解本文中讨论的但没有详细描述的装置和方法的方面和特征可以根据用于实施此类方面和特征的任何常规技术实施。

除非上下文要求，否则本文中使用的术语的含义应被解释成本公开所属的领域的一般技术人员通常所理解的那样。一些术语可以在本文中按照以下定义使用(除非上下文要求另一种含义)。

卵裂时间(细胞分裂时间)被定义为相对于定义的起点(零时)新形成的卵裂球被融合细胞膜完全分隔的第一观测时间点，卵裂时间因此是卵裂球卵裂完成的时间。卵裂时间因此可以定义如下：

●t2：卵裂成2卵裂球胚胎的时间

●t3：卵裂成3卵裂球胚胎的时间

●t4：卵裂成4卵裂球胚胎的时间

●t5：卵裂成5卵裂球胚胎的时间

●t6：卵裂成6卵裂球胚胎的时间

●t7：卵裂成7卵裂球胚胎的时间

●t8：卵裂成8卵裂球胚胎的时间

●tn：卵裂成n卵裂球胚胎的时间

应了解卵裂时间可以同样地关于细胞分裂的其它相关时间点进行定义。举例来说，在以上定义中，卵裂时间涉及与细胞分裂完成(即此时新形成的卵裂球被完全分隔)相关的时间，但是在另一个实施例中，卵裂时间可以同样定义成与细胞分裂的开始相关的时间，或与细胞分裂的中间点相关的时间。

在本文中，卵裂时间通常被表示成从定义的零时经过的小时数。零时可以是授精的时间(例如胞质内精子注射(ICSI)(也称为显微注射)的时间)，或者也可以在精子和卵母细胞混合的时间之后(在传统IVF中)，或在第一次观察到的配子的成功融合形成新生物体(合子)(即排出第二极体)的时间之后。类似地，零时可以在原核出现或消失/消失或其它重要发育参数的时间之后。就原核消失/消失来说，与原核(PN)相关的术语“消失”和“消失”可以在本文中互换地使用。术语tPNf可用于指示确定的原核消失的时间(即被确定为原核(PN)不再明显可见的时间的时间点)。

第一细胞周期持续时间cc1是受精与提供第一对子细胞(即首对第二代细胞)的卵裂时间t2之间的时期。第二细胞周期持续时间cc2是提供第一对子细胞的卵裂时间t2与提供第一对孙细胞(即首对第三代细胞)的卵裂时间t3之间的时期。第三细胞周期持续时间cc3是提供第一对孙细胞的卵裂时间t3与提供第一对重孙细胞(即首对第四代细胞)的卵裂时间t5之间的时期。第四细胞周期持续时间cc4是提供第一对重孙细胞的卵裂时间t5与提供第一对玄孙细胞(即首对第五代细胞)的卵裂时间t9之间的时期。

这些细胞周期持续时间因此基于每个新世代中分裂最快的卵裂球。然而，也有与更慢卵裂球的分裂有关的其它的细胞周期持续时间。

举例来说，除了细胞周期持续时间cc2之外，还有细胞周期持续时间cc2b，其对应于提供第一对子细胞的卵裂时间t2与提供第二对孙细胞的卵裂时间t4之间的时期。在这点上，为了让术语更简洁，细胞周期持续时间cc2也可以被称为细胞周期持续时间cc2a。

此外，除了细胞周期持续时间cc3之外，还有细胞周期持续时间cc3b，其对应于提供第一对孙细胞的卵裂时间t3与提供第二对重孙细胞的卵裂时间t6之间的时期。还有细胞周期持续时间cc3c，其对应于提供第二对孙细胞的卵裂时间t4与提供第三对重孙细胞的卵裂时间t7之间的时期。还有细胞周期持续时间cc3d，其对应于提供第二对孙细胞的卵裂时间t4与提供第四对重孙细胞的卵裂时间t8之间的时期。在这点上，为了让术语更一致，细胞周期持续时间cc3也可以被称为细胞周期持续时间cc3a。

因此，细胞周期的持续时间被定义如下：

·cc1＝t2：第一细胞周期。

●cc2(也称为cc2a)＝t3-t2：第二细胞周期，作为2卵裂球胚胎的时期的持续时间。

●cc2b＝t4-t2：两个卵裂球的第二细胞周期，作为2卵裂球胚胎和3卵裂球胚胎的时期的持续时间。

●cc3(也称为cc3a)＝t5-t3：第三细胞周期，作为3卵裂球胚胎和4卵裂球胚胎的时期的持续时间。

●cc3b＝t6-t3；cc3c＝t7-t4；cc3d＝t8-t4：更慢卵裂球的第三细胞周期，分别是作为3卵裂球胚胎、4卵裂球胚胎和5卵裂球胚胎的时期的持续时间；作为4卵裂球胚胎、5卵裂球胚胎和6卵裂球胚胎的时期的持续时间；和作为4卵裂球胚胎、5卵裂球胚胎、6卵裂球胚胎和7卵裂球胚胎的时期的持续时间。

●cc2_3＝t5-t2：第二和第三细胞周期，作为2卵裂球胚胎、3卵裂球胚胎和4卵裂球胚胎的时期的持续时间(即cc2+cc3)。

·cc4＝t9-t5：第四细胞周期，作为5卵裂球胚胎、6卵裂球胚胎、7卵裂球胚胎和8卵裂球胚胎的时期的持续时间。

同步性被定义如下：

·s2＝t4-t3：从2卵裂球胚胎分裂成4卵裂球胚胎的过程中的同步性。

·s3＝t8-t5：从4卵裂球胚胎分裂成8卵裂球胚胎的过程中的同步性。

·s3a＝t6-t5；s3b＝t7-t6；s3c＝t8-t7：在从4卵裂球胚胎发育成8卵裂球胚胎的过程中所涉及的单独细胞分裂的持续时间。

图2和3图解表示本文中关于例如以上讨论的一些胚胎发育事件的时点和持续时间使用的术语的一些方面。图2显示在各个发育阶段的胚胎的多个影像，并且指示与各个发育事件相关的各个时点，例如t2、t3、t4、t5、cc1、cc2(其在本文中也称为cc2a)、cc3(其在本文中也称为cc3a)、s2和s3。图3从左到右图解表示经过1、2、3、4、5、6、7和8卵裂球阶段的胚胎发育。对应的细胞分裂阶段已完成的时间t2到t8沿底轴被图解标记。图3还图解指示细胞周期持续时间cc1、cc2a、cc2b、cc3a、cc3b、cc3c和cc3d以及同步性S2和S3。

卵裂期被定义为从第一次观察到细胞膜中的凹陷(指示细胞质卵裂的开始)到细胞质细胞卵裂已完成使得卵裂球完全被融合细胞膜分隔时的期间。也称为细胞质分裂的持续时间。

受精和卵裂在某些方面可以被认为是至少在8卵裂球阶段之前或致密化之前胚胎的主要形态学/形态动力学事件。卵裂时间、细胞周期、分裂同步性和卵裂期是可以从这些主要形态事件定义的胚胎形态参数的实例，并且这些胚胎形态参数中的每一个都可以被定义为两个形态事件之间的期间的持续时间，例如以小时计。

直接卵裂是比细胞DNA在分裂前被正确复制所必需的时间更快时间发生的细胞分裂。举例来说，细胞可以分裂成两个子细胞，并且如果两个子细胞中的一个在复制其DNA通常所花的时间之前分裂成两个孙细胞，那么可以假设初始细胞已经发生直接卵裂事件。也就是说，初始细胞在预定义的期间内从一个细胞分裂成超过两个细胞，例如三个细胞。直接卵裂可以在不同的细胞周期中发生。举例来说，参考图3，可以采用cc2a、cc2b、cc3a、cc3b、cc3c、cc3d中的任一个的短时期来指示直接卵裂事件。

如已经提到的，已知可以从胚胎发育的各种相关参数确立胚胎发育潜力的量度，例如对应于(或基于)以上讨论的时点的参数，并且为此可以在胚胎经过相关阶段发育时从胚胎的时差影像确定目的相关参数的值。在用于确定胚胎发育潜力的一些方法中，也可能关注其它发育特征。举例来说，可以考虑对于以下形态特征所确定的值来评定胚胎质量：

·NOT2PN：指示是否正确地识别胚胎的两个原核。这个特征可以从精神阶段的适当发育部位处的胚胎的影像目测确定，并且可以例如采用简单的二进制值来指示原核是否正确地鉴别胚胎，或者可采用指示对胚胎鉴别的目标的数目的值，例如根据对胚胎鉴别的原核数目，对应于“0”、“1”、“2”、“3”或“4或更多”的值(值“2”是正常)。

·MN2：指示在2卵裂球(细胞)阶段观察到的(任何)多核现象。这个特征可以从适当发育阶段的胚胎影像目测确定，并且可以采取对应于“0”、“1”或“2”的值，这些值对应于被确定在2卵裂球阶段显示多核现象的细胞数目。

·MN4：指示在4卵裂球阶段观察到的(任何)多核现象。这个特征可以从适当发育阶段的胚胎影像目测确定，并且可以采取对应于“0”、“1”、“2”、“3”或“4”的值，这些值对应于被确定在4卵裂球阶段显示多核现象的细胞数目。

·UNEVEN2：指示2卵裂球阶段的卵裂球的(不)均匀度。这个特征可以从适当发育阶段的胚胎影像目测确定，并且可以采取对应于“均匀”(2卵裂球胚胎中的卵裂球被归类为均匀)或“不均匀”(2卵裂球胚胎中的卵裂球被归类为不均匀)的值。

·UNEVEN4：指示4卵裂球阶段的卵裂球的(不)均匀度。这个特征可以从适当发育阶段的胚胎影像目测确定，并且可以采取对应于“均匀”(4卵裂球胚胎中的卵裂球被归类为均匀)或“不均匀”(4卵裂球胚胎中的卵裂球被归类为不均匀)的值。

应了解这些参数中的某些参数的值的确定可以包括主观成分，例如就包括胚胎的细胞是均匀的还是不均匀的来说。还应了解具体值所采用的术语(例如“均匀”、“不均匀”)并不重要，并且这些值可以同样地以其它方式表征，例如表征为“真”或“假”，或通过与不同潜力状态相关的数值表征，例如“0”代表均匀，“1”代表不均匀。

应进一步了解，阐述以上鉴别的与胚胎发育有关的时点和特征是为了提供对参数和特征的类型的全面理解，这些参数和特征当寻求提供用于评定发育潜力的模型时是受关注的，并且其典型地只是针对给定模型受到关注的这些参数和/或特征的子集。

胚胎质量是胚胎成功植入并在移植后在子宫中发育的能力的量度。高质量的胚胎相比低质量的胚胎具有更高的成功植入(高植入可能性)并在移植后在子宫中发育成健康婴儿的可能性。然而，即使高质量的胚胎也不能确保植入成功，因为实际移植和女方的容受性影响最终结果。

生活力和质量可以互换地使用。胚胎质量(或生活力)测量值是旨在反映胚胎的质量(或生活力)的参数，使得具有质量参数的特定值(例如较高的值或较低的值取决于参数被如何定义)的胚胎具有高质量(或生活力)的可能性较高并且具有低质量(或生活力)的可能性较低。然而，具有质量(或生活力)参数的特定其它值的胚胎具有高质量(或生活力)的可能性较低并且具有低质量(或生活力)的可能性较高。

术语“发育潜力”可用于反映胚胎发育到囊胚期、植入、引起怀孕、发育到与心跳相关的阶段和/或导致活婴儿出生的预计可能性。在一些实施方案中，发育潜力可用于确定胚胎质量。发育潜力可以等同于胚胎质量。与具有负发育潜力(或较差(低)胚胎质量)的胚胎相比，具有正发育潜力(即较好(高)胚胎质量)的胚胎是更有可能发育到囊胚期和/或导致成功植入和/或在移植后在子宫中发育成胚胎和/或引起怀孕和/或导致活婴儿出生的胚胎。

因此，与低质量的胚胎相比，被确定具有较好(高)质量的胚胎被确定具有更高的成功植入和/或在移植后在子宫中发育的可能性。然而，应了解即使高质量的胚胎也不能确保植入成功，因为实际移植和女方的容受性高度影响最终结果。

在一些情况下，术语“胚胎”可用于描述截至受精后8周(在这个阶段中其变成胎儿)时的植入子宫后的受精卵母细胞。根据这个定义，受精的卵母细胞在进行植入前通常被称为前胚胎或受精卵。然而，如本文所用的术语“胚胎”将具有更广的定义，其包括前胚胎期。如本文所用的术语“胚胎”涵盖从卵母细胞受精到桑椹胚、囊胚期、孵化和植入的所有发育阶段。因此，术语胚胎在本文中可以表示受精的卵母细胞、受精卵、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、致密化、桑椹胚、囊胚、扩张的囊胚和孵化的囊胚等阶段中的每一个，以及其间的所有阶段(例如3细胞或5细胞)。

胚胎是大致球形的并且由被胶状外壳包围的一或多个细胞(卵裂球)构成，所述胶状外壳是被称为透明带的非细胞基质。透明带在胚胎孵化前执行多种功能，并且是用于胚胎评估的良好指标。透明带是球形的和半透明的，并且应该能和细胞碎片清楚地区分。

当卵母细胞通过精细胞(精子)的融合或注射被受精时，形成了胚胎。术语胚胎传统地也在孵化(即透明带断裂)和随后的植入后使用。对人来说，受精的卵母细胞在头8周传统地被称为受精卵或胚胎。在那之后(即8周后且当所有主要器官已经形成时)其被称为胎儿。然而，受精卵、胚胎和胎儿之间的区别通常没有被明确定义。术语胚胎和受精卵在本文中可互换地使用。

根据本发明的实施方案(例如本文中所描述)评定的胚胎可以预先冷冻，例如在受精后(例如在1细胞阶段)立刻冷冻保存的胚胎，然后解冻。或者，胚胎可以被新鲜制备，例如通过例如IVF或ICSI技术从卵母细胞新鲜制备的胚胎。应了解，在胚胎的发育已经通过冷冻被停止的情况下，受精后的发育事件的时点可以通过忽略冷冻与解冻之间的时间来定义。或者，开始时间可以被定义为解冻后的第一发育事件中的一个，例如第二极体的排出或原核的出现/消失。

受精可以被认为是卵母细胞识别和接受精细胞的时间点。在卵母细胞的减数分裂周期已经在第二减数分裂的中期中暂停之后，精细胞触发卵子激活。这导致第二极体的产生和挤出。在精子和卵子融合后的几个小时，DNA合成开始。雄性和雌性原核(PN)出现。PN移动到卵的中心，膜崩溃并且PN消失(消失)。两个基因组的这种组合被称为配子配合。在此之后，细胞分裂开始。

原核消失的时间可被称为tPNf。与原核(PN)有关的术语“消失”和“消失”在本文中可以互换地使用。

在胚胎发育期间，卵裂球数目呈几何倍数增加(1-2-4-8-16-等)。人胚胎中同步细胞卵裂通常被维持到8细胞阶段或更晚，直到致密化为止。此后，细胞卵裂变成异步的并且最终单独细胞具有其本身的细胞周期。在不孕治疗期间产生的人胚胎可以在8卵裂球阶段之前被移植到受体中。在一些情况中，在移植前将人胚胎培养到囊胚期。当可获得许多高质量胚胎或需要长时间培养以等待植入前遗传学诊断(PGD)的结果时，这是优选进行的。然而，随着培养技术的改进，存在长时间培养的趋势。

本发明的实施方案的一些实例实现方案可用于确定囊胚相关参数。

囊胚质量标准/量度是胚胎质量标准/量度的一个实例。囊胚质量标准可以例如涉及胚胎从致密化(即初始致密化)发育成孵化的囊胚。致密化是这样一种过程，其中具有紧密连接的卵裂球与桥粒之间的接触的增强导致细胞间隙的减小和细胞轮廓的模糊。在致密化之前，胚胎的卵裂球可以被单独地跟踪，并且在致密化之前，胚胎发育遵循一种明显的且主要同步的细胞分裂的途径，这种细胞分裂途径可以被观察并易于注释。在致密化之后，胚胎发育的特征是从桑椹胚到囊胚的发育不太连续，其中单独的卵裂球变得难以追踪，但是通过目测从相关发育阶段获得的影像，确定与许多阶段相关的参数的值，从而可以表征这些阶段。

致密化开始(SC)描述第一次观察到两个或更多个卵裂球之间的致密化。因此，SC标志着致密化过程的起始。

桑椹胚(M)与第一次见到卵裂球之间的没有质膜有关。当致密化过程完成时，任何形成致密化的卵裂球之间都见不到质膜并且胚胎可被定义成桑椹胚。大多数情况下，桑椹胚可以在接近于第四同步期S4(即在t9)或正好处在第四同步期S4开始时的第三同步期S3之后(即在t8后)被见到，但是也可能更早。在人胚胎中启动致密化之前胚胎极少卵裂成16个细胞或更多。

滋养外胚层的初始分化(IDT)被定义为第一次识别到明显的滋养外胚层细胞。囊胚形成开始(SB)被定义为第一次可以观察到充满流体的腔，即囊胚腔。它也被称为“成腔作用开始”。它描述了胚胎的桑椹胚期与囊胚期之间的过渡期的起始。在进入真正的囊胚期之前的一段时间里，胚胎通常留在这个过渡期。成腔作用通常在滋养外胚层细胞分化之后立刻开始。与外部环境接触的桑椹胚外层开始主动将盐和水泵入细胞间隙中，因此空腔(囊胚腔)开始形成。

内细胞群的初始分化(IDICM)被定义为第一次可以识别到内细胞群。IDICM描述了内细胞群发育的起始。偏心放置的细胞簇以间隙结合连接，其中细胞之间的边界似乎不是清晰可辨的。

囊胚(B)可以被定义为囊胚开始扩张前的最后一个影像。当这个情况发生时，透明带通常开始变化并且在滋养外胚层与内细胞群之间存在明显区别。

囊胚扩张开始(EB)可以被定义为胚胎第一次填满卵周隙并且开始移动/扩张透明带。EB可以描述胚胎扩张的起始。随着囊胚扩张，透明带变得明显更薄。

孵化囊胚(HB)可以被定义为滋养外胚层细胞第一次逃离/穿透透明带或第一次孵化出特定部分。

完全孵化的囊胚(FH)被定义为孵化完成，透明带脱落。

与囊胚发育相关的各种时点可以被定义如下：

tM＝从授精到形成桑椹胚的时间(小时)

tSB＝从授精到囊胚开始形成的时间(小时)

tB＝从授精到形成囊胚的时间(小时)

tEB＝从授精到形成扩张囊胚的时间(小时)

tHB＝从授精到孵化囊胚的时间(小时)

图4图解表示用于根据本发明的特定实施方案确定胚胎8的发育潜力的装置2。装置2包括耦合到胚胎成像系统6上的通用计算机4。胚胎成像系统6可以是常规的并且被配置成用于根据公开技术获得各个发育阶段的胚胎8的影像。应了解，一般来说，胚胎成像系统6典型地被配置成用于在监测期内获得多个胚胎的影像，而不是单个胚胎的影像。举例来说，典型研究可以包括多个胚胎、例如72个胚胎的分析。胚胎成像系统可以被配置成用于在继续成像下一个胚胎前一次一个地记录每一胚胎的影像(可能在多焦平面中获取影像)。一旦所有的胚胎都被成像，这可能例如花费5分钟，就可以重复单独胚胎的成像循环以为下一个时间点提供各自胚胎的对应影像。

通用计算机4用以(被编程以)执行用于从获自胚胎成像系统6的影像的分析确定/评定胚胎发育潜力的方法，如下文进一步描述。

因此计算机系统4被配置成用于进行根据本发明的一个实施方案的胚胎影像数据的处理。计算机4包括中央处理单元(CPU)24、只读存储器(ROM)26、随机存取存储器(RAM)28、硬盘驱动器30、硬件接口46、显示器驱动32、显示器34和用户输入/输出(IO)电路36，以及键盘38和鼠标40。这些装置通过公共总线42连接。计算机4还包括通过公共总线42连接的显卡44。显卡包括图形处理单元(GPU)和紧密耦合到GPU的随机存取存储器(GPU存储器)。胚胎成像系统6通过硬件接口46根据常规技术以通信方式耦合到计算机4。

CPU 24可以执行存储在ROM 26、RAM 28或硬盘驱动器30内的程序指令以处理可以存储在RAM 28或硬盘驱动器30内的胚胎影像数据。RAM 28和硬盘驱动器30统称为系统存储器。在一些实现方案中，根据本发明的实施方案的处理可以基于通过计算机4直接从成像系统6获得的胚胎影像。在其它实现方案中，根据本发明的实施方案的处理可以基于预先获得并存储在计算机4的存储器中(例如RAM 28或HDD 30中)的胚胎影像(即胚胎成像系统6自身不是本发明的实施方案的必要元件)。计算机4的各方面大部分可以是常规的，除了CPU被配置成用于运行程序(其例如可以存储在RAM 28、ROM 26或HDD 30中)以根据如本文所描述的本发明的特定实施方案进行处理。

使用胚胎成像系统6定期监测根据特定实例实现方案的胚胎8以获得相关信息(即与特定胚胎发育事件相关的时点、特定胚胎发育特征的存在(不存在))。胚胎优选地每小时监测至少一次，例如每小时至少两次，例如每小时至少三次，例如每小时至少四次，例如每小时至少六次，例如每小时至少12次。优选地当胚胎位于用于培养胚胎的恒温箱中时进行监测。优选地通过获取胚胎的影像(例如本文中关于时差方法所讨论的)进行监测。

图5是流程图，其图解表示根据本发明的特定实施方案根据胚胎的发育潜力对胚胎评级的方法。所述方法可用于例如评级与单方父母有关的多个胚胎以帮助鉴别这些胚胎中的哪个胚胎最可能成功植入/导致活胎。胚胎的数目当然会在父母和治疗周期之间有所变化，但是在一个典型情况下，在单个治疗周期中来自单方父母的多个胚胎可能是例如6到12个胚胎。所述方法可以是由计算机实现的方法，其可以使用图4的具有CPU 24的计算机4实现，所述CPU 24根据加载的程序实施所述方法。

在步骤S1中，在观察期中获得与胚胎的形态发育相关的特征的多个值。在用于在评定3天移植的胚胎的相关发育潜力的情况下评级胚胎的方法中，这个观察期可以例如延长到相关参考时间(零时)后的大约72小时或更长。目的形态特征将取决于眼前的具体应用，因为不同的实施方案可能依赖于不同的形态特征，如下文进一步讨论的。在这个实施例中，假定从每一胚胎获得特征是：

(i)关于胚胎是否正确地显示两个原核的指示(例如如上文所定义的NOT2PN的值)。

(ii)t3和tPNf的值(这些值之间的相对小的差别被认为是发生直接卵裂的指标)。

(iii)预定义的发育阶段的持续时间，其在这里用于确定胚胎发育是否过慢(在这个实施例中，发育阶段是从零时(例如ICSI显微注射时)到t3)。

(iv)两个预定义的发育阶段的持续时间，其在这里用于确定这些发育阶段中的一个相对于另一个的相对持续时间是否处在期望范围内(在这个实施例中，这两个发育阶段是cc3a(即t5-t3)的持续时间和cc2a和cc3a的组合持续时间(即t5-t2))。

(v)关于胚胎中的细胞数目是否无法在指定时间内达到指定数目(在这个特定实施例中是66小时内8个细胞)的指示。

因此，总结来说，可以根据图5的方法的一个实例实现方案针对每一胚胎探寻与胚胎的形态发育有关的以下特征的值：NOT2PN、tPNf、t2、t3、t5和t8。将认识到可能无法获得所有胚胎的所有这些特征的值。举例来说，胚胎在观察期内不达到8细胞阶段，在这种情况下将无法获得t8的值(对应于确定胚胎在观察期/监测期内不达到8个细胞)。

这些参数的值可以根据常规技术获得，例如使用恒温箱中胚胎的常规时差成像以获得发育中胚胎的一系列影像，和使用用于从这一系列影像确定各种相关形态事件的时点和发生的常规注释程序。举例来说，这些参数的值可以使用用于培养期间的胚胎的时差监测的EmbryoScope(RTM)装置和用于注释目的事件的相关EmbryoViewer(RTM)软件获得。EmbryoScope(RTM)装置和EmbryoViewer(RTM)软件已经由Unisense FertiliTech A/S(Aarhus,Denmark)开发并且可从Unisense FertiliTech A/S(Aarhus,Denmark)得到。应了解，根据先前公开的技术，注释可以手动地(例如基于用户输入)和/或自动地(例如基于数字影像分析/处理)和/或半自动地(例如基于数字影像分析和用户输入的混合)进行。

在步骤S2，选择胚胎中的一个用于考量。一般来说，图5的方法用于依次确定每一胚胎的得分，并且所述得分然后可用作根据胚胎发育潜力评级胚胎的基础。胚胎的考量顺序并不重要，并且在这点上，在步骤S2选择的胚胎可以从还在等待被评分的胚胎中随机选取。用于指定迭代的所选胚胎可以被称为用于该迭代的当前胚胎。

在步骤S3，确定是否应当对当前胚胎评级。在这个例中，这是基于NOT2PN的值。在某些方面，这可以被看作是初始筛选步骤，在其中鉴别具有已知和低发育潜力非常相关的一或多个特征的胚胎。

如果在步骤S3确定当前胚胎没有正确地显示两个原核，那么就确定该胚胎不应被进一步评级，并且跟随被标记为N的分支指向步骤S4进行处理，在步骤S4中当前胚胎被赋予得分0，然后继续进行处理直到步骤S16。在步骤S16，确定所有的多个胚胎都已被考量还是有更多胚胎在等待考量。如果有更多胚胎在等待考量，那么跟随被标记为Y的分支返回步骤S2进行处理，在S2中选择下一个胚胎用于考量。

另一方面，如果确定在步骤S3中胚胎没有正确地显示两个原核，那么处理遵循被标记为Y的分支指向步骤S5。

在步骤S5，评定胚胎在观察期中是否发生了直接卵裂(已经发现直接卵裂和相对低的发育潜力有关)。在这个实例中，这是基于确定与胚胎发育相关的时期是否小于阈值持续时间，并且如果是这样的话，那么确定胚胎已经发生直接卵裂事件。在这个实例实现方案中，如果tPNF与t3之间的时间(t3-tPNf)的量度小于大约11.5小时(例如小于11.48小时)，那么就认为直接卵裂事件已经发生。也可以使用其它阈值，例如阈值可选自包括以下的组：5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时和14小时。

在一些其它实例实现方案中，不同的时期可用于鉴别是否已经发生直接卵裂事件。举例来说，如果时期(t3-t2)的量度小于阈值量，例如选自包括1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时和11小时的组的量，那么就认为直接卵裂事件已经发生。在另一个实施例中，如果时期(t5-t4)的量度小于阈值量，例如选自包括0.1小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时和11小时的组的量，那么就认为直接卵裂事件已经发生。在另一个实施例中，如果卵裂成3个细胞的时间t3与卵裂成4个细胞的时间t4的比率的量度小于选自包括0.9、0.8、0.7和0.6的组的阈值量，那么就认为直接卵裂事件已经发生。在一些实现方案中，步骤S5可以包括确定许多这些时期中的任一个是否小于其对应阈值以鉴别是否已经存在任何直接卵裂事件。

如果在步骤S5中确定当前胚胎已经发生直接卵裂，那么处理沿着被标记为Y的分支指向步骤S6，在步骤S6中当前胚胎被赋予得分1，然后继续进行处理直到步骤S16。否则，处理沿着被标记为N的分支指向步骤S7。

在步骤S7，评定预定义的发育阶段的持续时间是否大于预定义的阈值持续时间。更一般地，在步骤S7，评定胚胎发育的某个方面是否指示相对慢的发育(已经发现这和相对低的发育潜力有关)。在这个实例实现方案中，预定义的发育阶段的持续时间是达到3个细胞所花费的时间t3，并且预定义的阈值持续时间是大约43小时(例如42.91小时)。然而，也可以使用和t2有关的其它阈值，例如阈值可选自包括以下的组：38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时和48小时。

在一些其它实例实现方案中，不同的时期可用于鉴别是否已经存在缓慢发育。举例来说，如果t2的量度小于阈值，例如选自包括27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时和35小时的组的量，那么可以认为缓慢发育已经发生。在另一个实施例中，如果t4的量度小于阈值，例如选自包括41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、47小时、48小时、49小时和50小时的组的量，那么可以认为缓慢发育已经发生。在另一个实施例中，如果t5的量度小于阈值，例如选自包括55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时和63小时的组的量，那么可以认为缓慢发育已经发生。在一些实现方案中，步骤S7可以包括确定许多这些时间中的任一个是否大于对应阈值以鉴别在这些时期中的任一个中是否已经存在缓慢发育。

如果在步骤S7中确定当前胚胎已经发生缓慢发育，那么沿着被标记为Y的分支指向步骤S8进行处理，在步骤S8中当前胚胎被赋予得分2，然后继续进行处理直到步骤S16。否则，沿着被标记为N的分支指向步骤S9进行处理。

步骤S9和S11事实上一起工作以确定胚胎的第一预定义的发育阶段相对于胚胎的第二预定义的发育阶段的相对持续时间是处于预定义的范围以内还是以外。更一般地说，这些步骤组合起来用于评定与和良好发育潜力有关的胚胎相比，胚胎发育的各方面是否基于两个发育阶段的相对持续时间指示不规律发育。在这个实例实现方案中，评定分两个阶段进行，也就是说通过确定第一阶段相对于第二阶段的相对持续时间是否低于步骤S9中的范围的下限，和确定第一阶段相对于第二阶段的相对持续时间是否高于步骤S11中的范围的上限。

因此，在步骤S9，评定胚胎的第一预定义的发育阶段相对于胚胎的第二预定义的发育阶段的相对持续时间是否低于预定义的极限。在这个实例实现方案中，第一预定义的发育阶段是从卵裂成3个细胞t3到卵裂成5个细胞t5(即cc3a)，并且第二预定义的发育阶段是从卵裂成2个细胞t2到卵裂成5个细胞t5(即cc2a+cc3a)的阶段。因此，这个实施例中使用的相对持续时间的量度是(t5-t3)/(t5-t2)(等于cc3a/(cc2a+cc3a))。这个具体实现方案中的这个相对持续时间的下限是大约0.34小时。然而，对于这个参数也可以使用其它下限值，例如0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。在一些其它实例实现方案中，不同的相对持续时间可用于鉴别是否已经存在不规律的发育，并且在下文进一步讨论关于这种情况的一些实施例。

如果在步骤S9中因为确定的相对持续时间低于下限而确定当前胚胎已经发生不规律的发育，那么遵循被标记为Y的分支指向步骤S10进行处理，在步骤S10中当前胚胎被赋予得分3，然后继续进行处理直到步骤S16。否则，遵循被标记为N的分支指向步骤S11进行处理。

在步骤S11，评定胚胎的第一预定义的发育阶段相对于胚胎的第二预定义的发育阶段的相对持续时间是否高于预定义的极限。在这个实例实现方案中，第一发育阶段和第二发育阶段与步骤S9中所用的是相同的，并且这个具体实现方案中的这个相对持续时间的上限是大约0.58小时。然而，对于这个参数也可以使用其它上限值，例如0.6、0.7、0.8或0.9。如上文已经提到的，在一些其它实例实现方案中，其它相对持续时间可用于鉴别是否已经存在不规律的发育，并且在下文进一步讨论关于这种情况的一些实施例。

如果在步骤S11中因为对于相关发育阶段所确定的相对持续时间高于上限而确定当前胚胎已经发生不规律的发育，那么遵循被标记为Y的分支指向步骤S12进行处理，在步骤S12中当前胚胎被赋予得分4，然后继续进行处理直到步骤S16。否则，遵循被标记为N的分支指向步骤S13进行处理。

因此，如上文已经讨论的，应了解步骤S9和S11的组合事实上可以确定胚胎的第一预定义的发育阶段相对于胚胎的第二预定义的发育阶段的相对持续时间是处在预定义的范围内(在这种情况下图5的处理将是针对到达步骤S13的相关胚胎)还是该范围以外(在这种情况下，取决于其是低于还是高于该范围，胚胎将被赋予得分3或4)。在这个特定实例实现方案中，相对持续时间对应于(t5-t3)/(t5-t2)，并且预定义的范围是从大约0.34到0.58。然而，也可以使用其它范围，例如范围可选自包括以下的组：0.1到0.9、0.2到0.8、0.3到0.7、0.4到0.6和0.5到0.6。在其它实施例中，不同的第一和第二预定义的发育阶段可用于确定胚胎在对应于步骤S9和S13的步骤中是否显示不规律的发育。举例来说，可以使用的其它参数和范围包括：

·(t3-t2)/(t5-t2)-范围是：0.1到0.9、0.1到0.8、0.2到0.7、0.3到0.6或0.4到0.5

·(t3-t2)/(t5-t3)-范围是：0.05到10、0.1到9、0.15到8、0.2到7、0.25到6、0.3到7、0.35到6、0.4到5、0.45到4、0.5到3、0.6到2或0.75到1

·(t5-t3)/t5)-范围是：超过0.1、超过0.2和超过0.3

·(t4-t3)/(t3-t2))-范围是：超过0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5

·(t8-t5)/(t5-t3)-范围是：小于0.1、小于0.15或小于0.2

·((t3-t2)+(t5-t4))/(t8-t4)-范围是：超过0.3、超过0.4、超过0.5、超过0.6、超过0.7或超过0.8

·(t8-t5)/(t8-t4)-范围是：超过0.3、超过0.4、超过0.5、超过0.6、超过0.7、超过0.8、超过0.9或超过0.97

●(t3-tPNf)/(t4-tPNf)(或t3/t4)-范围是：超过0.35、超过0.45、超过0.55、超过0.65、超过0.75、超过0.85、超过0.95

●(t4-t3)/(t4-t2)-范围是：小于0.3、小于0.4、小于0.5、小于0.6或小于0.7

●(t8-t5)/(t8-t2)-范围是：小于0.2、小于0.3、小于0.4、小于0.5和小于0.6。

将注意到，以上列举的范围中的一些仅在一端有界限(即一些范围被指定为大于X的值)。在这种情况下，图5的处理可经过改进以避免步骤S9或S11中的一个或另一个，这取决于该范围是大于给定极限还是小于给定极限。或者，对于相关极限可以设定任意极值，例如0小时或999小时。

应了解，对于各种发育事件的持续时间的所有不同比率(其个别地可以包括27个修正的总和，例如对于参数((t3-t2)+(t5-t4))/(t8-t4))，相关比率的指示是很重要的。虽然这可以如上文所述的那样计算，但是其也可以同样地被作为这些比率的“倒数”确定。在这方面，应了解A/B的值的指示也是B/A的值的指示。

在步骤S13，评定当前胚胎是否在预定义的时间内发育成预定义数目的细胞。在这个特定实例实现方案中，步骤S13基于确定当前胚胎是否无法在66个小时内达到8个细胞。然而，根据其它实例限制，对于图5的处理的这个方面也可以使用不同的参数。举例来说，评定可基于不同的时期替代66个小时，例如选自包括以下的组的时期：64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时和72小时。

如果在步骤S13中确定当前胚胎无法在相关时间内达到必需数目的细胞，那么遵循被标记为N的分支指向步骤S14进行处理，在步骤S14中当前胚胎被赋予得分4，然后继续进行处理直到步骤S16。否则，遵循被标记为Y的分支指向步骤S15进行处理。

在步骤S15，当前胚胎被赋予得分5，并继续进行处理直到S16。

如上所述，在步骤S16中确定从正在评级的多个胚胎中是否有任何更多胚胎在等待考量，如果是这样的话，那么遵循被标记为Y的分支指向回步骤S2进行处理，在步骤S2中对下一个将要选择的胚胎重复以上所述的处理。另一方面，如果没有胚胎在等待考虑(即所有将要被评级的多个胚胎都被赋予了得分)，那么遵循被标记为N的分支指向S17进行处理。

在步骤S17，多个胚胎根据其对应的得分相对彼此评级。基本上，采取更高的得分指示更大的发育潜力。然后可以从已经被评级的多个胚胎中选择一或多个胚胎以基于其等级植入/移植到患者体内。举例来说，更高等级的胚胎优先于更低等级(更低得分)的胚胎可以被选择用于植入/移植给患者。在这方面，应了解被赋予每一胚胎的具体数字得分(即0、1、2、…5)并不重要。其它值可以同样地使用。此外，评分可以基于指示良好发育潜力的低得分，在这种情况下图5的处理的步骤S4比步骤S6与更高的得分有关，这从而比步骤S8与更高的得分，以此类推。事实上，得分未必是数字。举例来说，胚胎可以和步骤S4中的得分A有关，和步骤S6中的得分B有关，以此类推，直到和步骤D15中的得分E有关，并且评级可以基于鉴别和字母表中最前的字母有关的胚胎，最前的字母指示相对低的发育潜力。

因此，图5的处理表示根据本发明的一个实施方案根据胚胎的发育潜力对多个胚胎评级的方法。这包括确定各个发育阶段是否符合上文所讨论的各种标准。具体来说，评定胚胎的直接卵裂(步骤S5)、缓慢发育(步骤S7)和不规律性(组合步骤S9和S13)。发明人已经发现了这些特定特征和其对于根据以上描述的方法确定总体等级的相对重要性，以提供模型，用于从一个群组中评级胚胎以鉴别最有可能成功植入且随后导致活胎的那些胚胎。此外，发明人已经发现所述方法对和胚胎发育条件有关的特征相对不灵敏，胚胎发育条件有关的特征为例如所用受精方法的类型(ICSI或经典IVF)和培养气氛的性质(例如低氧或环境氧)。

为了证明图5的处理能够根据胚胎的发育潜力成功地评级胚胎，所述模型可被应用于存在已知植入数据的胚胎(即KID胚胎)的历史数据，以确定所述模型预测KID胚胎的已知结果的效果如何。发明人已经对大约3,275个KID胚胎实行了这个操作。这一组3,275个胚胎是从关于大约17,000个KID胚胎的信息数据库获得的。17,000个KID胚胎的数据集中没有被包括在用于测试模型的3,275个胚胎的减小组中的胚胎是相关发育事件的标注质量被认为不可靠的那些胚胎，患者年龄超过40岁的那些胚胎，和与3天移植无关的那些胚胎(因为用于模型的这个具体实施例的这个特定参数和值经过选择以评级用于3天移植的胚胎)，和与植入前遗传筛查有关的那些胚胎。剩下的3,275个KID胚胎包括可以被分成四个主要环境组的胚胎，即(i)经典IVF受精和低氧培养气氛，(ii)经典IVF受精和环境氧培养气氛，(iii)ICSI受精和低氧气氛，和(iv)ICSI受精和环境氧气氛。这3,275个胚胎的数据来自于23家不同诊所，其中21家诊所贡献至少10个KID胚胎的数据，这其中的9个贡献至少100个KID胚胎的数据。

图5的处理被应用于这3,275个KID胚胎中的每一个。其结果(例如关于有多少胚胎被赋予不同得分)可由模型的分类树表示，例如图6中所表示。

因此，图6是分类树，表示图5的模型对3,275个KID胚胎的应用。每一分支节点(其中进行分类决策)和端节点/叶节点(其中赋予得分)在图6中通过与所述节点有关的图5的处理的对应步骤鉴别。每一节点也和达到决策树的所述节点的胚胎数目(n)和那些胚胎的植入成功率(imp)有关。因此决策树在步骤S5以3,275个胚胎的群体开始，其中25.0％被成功植入。步骤S5的处理将3,275个胚胎分成显示直接卵裂的胚胎(267个胚胎，其中5.6％被成功植入)和不显示直接卵裂的胚胎(3008个胚胎，其中26.6％被成功植入)。步骤S7的处理然后将来自步骤S5的3,008个胚胎分成显示缓慢发育的胚胎(470个胚胎，其中12.1％被成功植入)和不显示缓慢发育的胚胎(2,538个胚胎，其中29.4％被成功植入)。步骤S9的处理然后将来自步骤S7的2,538个胚胎分成161个胚胎(其中15.5％被成功植入)和2,229个胚胎(其中30.7％被成功植入)。值得注意的是，并非所有的胚胎都在这个步骤被分类(即161+2,229<2,538)。这是因为对于有些胚胎不能应用这个分类标准，例如因为在时差数据中无法鉴别相关时点。这可以被称为impute数据，并且为了验证的目的基于从图5的模型对于KID胚胎的应用中的进一步考量被没有考虑在内，如图6的分类树中所表示的(即其没有被指定得分)。如果有胚胎无法在模型对于患者的胚胎群组的实际应用中被分类，那么将替代地使用常规胚胎学家输入以帮助评级这些胚胎。更普遍地，将认识到，在任何情况下都希望典型地使用根据本文所述的实施方案的评级以帮助胚胎学家作出最终评级决策，并且根据本发明的实施方案获得的等级在没有另外的胚胎学家输入的情况下可能不被认为是决定性的。

从图6的分类树可以看到，图5的模型对于KID胚胎的应用评级了具有得分5的1294个胚胎，并且这些胚胎具有36.1％的植入成功率。这比整个群体的植入成功率高出大约50％，表明模型能够从将要评级的多个胚胎中鉴别相对高的质量/发育潜力的胚胎的优势。还可以看到，总计935个胚胎被赋予得分4，分为在于步骤S14中的植入成功率22.9％的410个胚胎和步骤S12中的植入成功率为23.2％的525个胚胎。这是因为在统计学上发现到达步骤S12的胚胎和到达步骤S14的胚胎具有类似的植入成功率，因此这两个组被赋予相同得分。

将图5的模型应用于被用于验证的3,275个KID胚胎的结果也在图7中表示。这是一个柱形图，显示不同得分之间的与图6的分类树有关的3,275个KID胚胎的百分比分布(由图例“KID所有数据”标识)以及被成功植入的与图6的分类树有关的胚胎的百分比分布(由图例“KID阳性”标识)。图7还显示了在根据图5和6中表示的模型对于这些胚胎所确定的得分中，已知导致活胎的胚胎群体的百分比分布(由图例“活胎”标识)。

和图7中的活胎数据有关的胚胎群体并不简单地对应于3,275个KID胚胎的产生活胎的所有胚胎。这是因为无法获得这3,275个KID胚胎的全部活胎数据。这是因为在患者怀孕后，她接受治疗的IVF诊所并不总是能收到关于这次怀孕的最终结果的信息。在和图6的分类树有关的3,275个KID胚胎中，已知只有大约180个产生了活胎。预期许多其它植入胚胎也产生了活胎，但关于这些胚胎的数据无法简单地获得。因此，图7中表示的活胎数据对应于3,275个胚胎中存在活胎数据的大约180个胚胎，和另外的存在活胎数据的大约120个其它胚胎。

图7展示了根据本发明的实施方案评定发育潜力如何帮助鉴别具有良好发育潜力的胚胎。举例来说，很显然和良好发育潜力有关的胚胎(即“KID阳性”和“活胎”胚胎)的分布倾向于得到比整体群体更高的得分。

应了解根据不同实施方案可以采用对图5的方法的各种修改。举例来说，虽然图5代表对胚胎考量且随后评分的一般迭代法，但是在其它实现方案中也可以平行地或至少部分平行地对胚胎评分。举例来说，不同于对每一胚胎依次重复步骤S2到S16，在其它实现方案中，在移动到评级程序的下个步骤之前可以对多个胚胎执行评级程序的个别步骤。举例来说，在处理进行到对应于步骤S5的步骤之前对于所有胚胎可采用对应于步骤S3的步骤，在步骤S5中对于在对应于步骤S3的步骤中未被指定得分0的所有胚胎可评定胚胎是否被认为已经发生直接卵裂。

此外，在一些实现方案中，可能没有对应于S3的步骤。也就是说，在一些实现方案中，可能没有对于是否应当基于两个原核的出现或不出现来评级胚胎的评价。在这种情况下，处理可以在整体上类似于图5中所表示的处理，但是不具有对应于步骤S3和S4的步骤。类似地，在一些实施例中没有对应于步骤S13和S14的步骤。

此外，并且如先前所提到的，不同参数和不同阈值可用于方法的各个步骤。对于本发明的特定实施方案来说重要的是，当根据胚胎的发育潜力评级胚胎时，模型考虑到直接卵裂、发育缓慢性(尤其是早期发育)和发育不规律(通过评定和胚胎的不同发育阶段有关的两个特征的比率)。有许多不同的参数指示这些特征，例如以上提供的不同实施例。各实现方案之间的具体参数和相关阈值可以不同。举例来说，虽然已发现以上方法可以提供普遍适用的模型，但是具体诊所可能希望开发其自己的基于这些方法的模型，并且在这种情况下可以发现用于最佳辨别该诊所内培养的胚胎的胚胎发育潜力的其它参数和/或阈值。在任何情况下，都可以从与相关发育条件有关的KID胚胎的统计分析确定相关参数和值。举例来说，在试图创建普遍适用的模型的情况下，与以上讨论的3,275个KID胚胎的已知结果相比，关于不同的参数和相关阈值在胚胎评级中如何起作用的分析是鉴别由图6的分类树所表示的具体实例实现方案中使用的具体参数和那些参数的值。

如已经提到的，本发明的实施方案涉及以考虑胚胎发育的三个方面(即胚胎是否发生直接卵裂、胚胎是否显示相对缓慢的发育、和胚胎是否显示相对不规律的发育)的方式对胚胎评级。可以从与胚胎发育有关的形态动力学/形态学数据确定胚胎是否显示这些特征中的任一个。在和图6的分类树有关的实例实现方案中，直接卵裂的评定是基于参数(t3-tPNf)，相对缓慢的发育的评定是基于参数t3，并且相对不规律的发育的评定是基于参数(t5-t3)/(t5-t2)。这个特定实例实现方案中的每一参数的阈值像先前讨论的那样被采用，并在图6中阐述。然而，如上所述，存在各种其它参数和对应阈值可同样地用于评定以上鉴别的三个发育特征(直接卵裂、缓慢发育、不规律发育)以根据其它实现方案评级胚胎。

因此，图8、10和12类似于图6并且将根据图6进行理解，但是显示基于不同参数和/或阈值的不同模型的分类树，用于评定胚胎是否被认为与直接卵裂、缓慢发育和/或不规律发育有关。图9、11和13是类似于图7并且将根据图7进行理解的对应柱状图，其是针对图8、10和12中表示的相应分类树。这些图显示根据本发明的实施方案确定的与良好发育潜力有关的胚胎的分布如何倾向于获得高于整体群体的得分。

在图8、10和12中的每个图中，分类树的节点通过图5的方法中与所述节点的关联性最高的步骤鉴别。然而，图8、10和12中表示的模型不包括对应于图5的方法的处理的所有步骤，并且因此图8、10和12的分类树中的所有节点与图6的分类树中的所有节点之间不存在直接对应。

举例来说，根据图8中表示的评级模型，不存在对应于图5的方法中的步骤S13的步骤。也就是说，根据图8模型的胚胎的评级不包括基于确定胚胎是否已经在给定时间内到达给定发育阶段的步骤。因此，分类树中的决策节点少了一个，并且评级模型的最大得分因此更小(即4，而不是5)。然而，应了解根据任何给定模型获得的具体数字评级是用于根据所述模型评级胚胎的相对发育潜力。数字得分并不打算作为以不同模型评级的胚胎的比较的“绝对”评级。也就是说，图6中表示的模型中的得分5被解释为比图6中表示的模型中的得分4更高的等级，但是其不应被解释为必定指示比图8中表示的模型中的得分4更高的等级。

此外，在图10和12中表示的模型中不存在对应于图6中表示的模型的步骤S11的步骤。这是因为图6中的(不)规律发育的评定是基于参数(t5-t3)/(t5-t2)是落在由步骤S11中的下限和步骤S13中的上限界定的范围以内还是以外，但是图10的模型中的(不)规律发育的评定是基于评定(t8-t5)/(t8-2)是落在仅在一端有边界的范围以内还是以外。

对于每一模型，与每一叶节点有关的相对得分是基于到达所述叶节点的胚胎各自的植入成功率。举例来说，在图12的模型中，到达被标记为对应于步骤S6(即被分类为已经发生直接卵裂)和S8(即被分类为没有发生直接卵裂，但是显示缓慢发育)的步骤的KID胚胎都具有类似的植入可能性，并且因此被赋予相同得分。

从图6、8、10和12中表示的模型可以看到，虽然这些模型基于用于评定胚胎的直接卵裂、缓慢发育和不规律发育的不同具体参数和阈值，但是这些模型全都能够根据植入成功率评级胚胎。对于每一模型，被赋予最高得分的胚胎与大约32％到36％的植入可能性有关，这表示相比被看作整体的KID胚胎群体的植入可能性(其为25％)的显著提高。也就是说，基于以上鉴别的三个特征的胚胎评级方法能够鉴别相比具有较低植入可能性的胚胎具有较高植入可能性的胚胎。

图14到17是类似于图6且将从图6理解的分类树图。图14到18的分类树基于与图6的分类树相同的模型(例如就用于评定直接卵裂、缓慢发育和不规律发育的具体参数和阈值来说)，但是显示将模型应用于3,275个KID胚胎的不同子群体的结果。

图14显示将模型应用于在减氧气氛中培养的3,275个KID胚胎的亚组的结果，图15显示将模型应用于在环境氧气氛中培养的3,275个KID胚胎的亚组的结果。可以看到，将模型应用于在减氧气氛和环境氧气氛中培养的胚胎的结果是类似的，这证明所述方法能够评级胚胎同时对胚胎是在减氧条件下还是环境氧条件下培养并不敏感，并且这证明根据本发明的实施方案的方法的通用性。

图16显示将模型应用于通过ICSI受精的3,275个KID胚胎的亚组的结果，图17显示将模型应用于通过经典IVF受精的3,275个KID胚胎的亚组的结果。可以看到，将模型应用于ICSI胚胎和IVF胚胎的结果是类似的，这证明所述方法能够评级胚胎同时对胚胎是通过ICSI还是IVF受精并不敏感，并且这进一步证明根据本发明的实施方案的方法的通用性。

应了解，当确定胚胎等级时除了评定胚胎的直接卵裂、发育缓慢性和不规律性以外，本发明的特定实施方案的另一方面是辨别这些特征中的哪一个对低等级的贡献更高。具体来说，已经确定了直接卵裂相比缓慢发育是差发育潜力的更强指标，缓慢发育相比不规律发育则是差发育的更强指标。因此，根据特定实施方案，显示直接卵裂的胚胎被评定的等级低于不显示直接卵裂的胚胎，跟胚胎是否符合其它标准无关。也就是说，在直接卵裂、缓慢性和不规律性这三个标准中，关于直接卵裂的确定比关于缓慢性的确定对胚胎相对于其它胚胎的等级的影响更大，而关于缓慢性的确定比关于不规律性的确定对胚胎相对于其它胚胎的等级的影响更大。

以上讨论的用于KID胚胎的各种分类树展示根据本发明的实施方案用于评级多个胚胎的方法如何帮助鉴别具有最大发育潜力(最佳质量)的那些胚胎。这已经在通过植入可能性测量发育潜力的情况下显示。然而，如已经提到的，这只是胚胎发育潜力的一个实例测量，并且本文所述的原理可同样地用于基于发育潜力的其它量度评级胚胎，例如到达囊胚期的可能性和/或植入的胚胎发育成活胎的可能性和/或植入的胚胎发育到与心跳有关的阶段的可能性和/或被移植胚胎的患者怀孕的可能性。

应了解，以上讨论的逐步/分类树方法仅仅是一种用于在这个基础上评级胚胎的算法方法，并且其它算法方法实际上也可以产生相同评级方案。举例来说，代替使用决策树(例如在图5和6的方法中表示)分类胚胎以鉴别胚胎的等级，可以评定所有胚胎的所有三个特征(直接卵裂、缓慢性、不规律性)和基于每一特征的评定结果所获得的累积得分。举例来说，对于直接卵裂这个得分组成，不显示直接卵裂的胚胎可被赋予得分100，显示直接卵裂的胚胎可被赋予得分0。对于缓慢性这个得分组成，不显示缓慢性的胚胎可被赋予得分10，显示缓慢性的胚胎可被赋予得分0。对于不规律性这个得分组成，不显示不规律性的胚胎可被赋予得分1，显示不规律性的胚胎可被赋予得分0。因此，显示直接卵裂、缓慢性和不规律性的胚胎将具有累积得分0，而不显示直接卵裂、缓慢性或不规律性的胚胎将具有累积得分111(最大)。基于这种方法，胚胎将以与图6方法的顺序对应的顺序被评级(除了在和图5有关的一些得分类别内更精细地评级胚胎)。

因此已经描述了一种评级胚胎以指示其发育潜力的方法。所述方法包括：在观察期中获得与所述胚胎的形态发育相关的多个特征的值；对于所述胚胎中的各自胚胎确定胚胎是否已经发生直接卵裂事件，和对被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于未被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎；和对于未被确定已经发生直接卵裂事件的胚胎，确定所述胚胎的预定义的发育阶段的持续时间是否超过预定义的阈值持续时间，和对所述预定义的发育阶段的持续时间被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于所述预定义的发育阶段的持续时间未被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎；和对于所述预定义的发育阶段的持续时间未被确定超过所述预定义的阈值持续时间的胚胎，确定所述胚胎的两个预定义的发育阶段的相对持续时间是否处于预定义的范围以外，和对所述胚胎的两个预定义的发育阶段的相对持续时间处于预定义的范围以外的胚胎用等级评级，该等级指示其发育潜力低于所述胚胎的两个预定义的发育阶段的相对持续时间不处于所述预定义的范围以外的胚胎。

在一些方面，一些实例实现方案提供一种评级胚胎以指示其发育潜力的方法；所述方法包括：在观察期中获得与所述胚胎的形态发育相关的多个特征的值；对于所述胚胎中的各自胚胎确定胚胎是否已经发生直接卵裂事件的量度，对于所述胚胎中的各自胚胎确定胚胎的预定义的发育阶段的持续时间是否长于预定义的阈值持续时间的量度；对于所述胚胎中的各自胚胎确定胚胎的两个预定义的发育阶段的相对持续时间是否处于预定义的范围以外的量度；和以这样的一种方式评级胚胎：胚胎发生直接卵裂事件的确定对指示相对低的发育潜力的等级的贡献大于胚胎的预定义的发育阶段的持续时间长于预定义的阈值持续时间的确定，且其中胚胎的预定义的发育阶段长于预定义的阈值持续时间的确定对指示相对低的发育潜力的等级的贡献大于胚胎的两个预定义的发育阶段的相对持续时间处于所述预定义的范围以外的确定。

在一些方面，一些其它实例实现方案提供一种确定得分以指示胚胎的发育潜力的方法，包括：在观察期中获得与所述胚胎的形态发育相关的多个特征的值；确定胚胎是否发生直接卵裂事件的量度作为第一得分组成；确定胚胎的预定义的发育阶段的持续时间是否长于预定义的阈值持续时间的量度作为第二得分组成；确定胚胎的两个预定义的发育阶段的相对持续时间是否处于预定义的范围以外的指示作为第三得分组成；和以这样的一种方式通过考虑第一得分组成、第二得分组成和第三得分组成确定以指示胚胎的发育潜力的得分：第一得分组成对得分的影响大于第二或第三得分组成，并且第二得分组成对得分的影响大于第三得分组成。

因此，如以上所讨论，根据本文所述的原理的方法可用于确定得分以指示胚胎的发育潜力。以上列举的实施例主要集中在基于胚胎样品的已知植入数据提供成功植入的可能性的指示。然而，如已经解释的，所述方法同样适用于确定与胚胎的其它发育潜力特征有关的得分，例如胚胎发育到囊胚期的可能性。

在这点上，图6中表示的模型已被应用于包括来自2413名患者/37个诊所的被培养5天并且已知胚胎截至120小时是否发育到囊胚期的10,316个胚胎的数据集。实际上，这和使用可能被称为“已知囊胚数据”的数据代替“已知植入数据”一致，“已知植入数据”被用于本文中描述的一些其它结果以确定模型用于确定发育潜力的指标的能力。

10,316个胚胎的数据集完全独立于图6的模型的开发所基于的数据集。10,316个胚胎的这个数据集含有根据Ciray等人-Hum.reprod.2014；29；2650-2660[1]的论文“Proposed guidelines on the nomenclature and annotation of dynamic human embryo monitoring by a time-lapse user group(关于对通过时差用户基团监控动态的人胚胎的命名和注释指南)”中提出的指南标注的相关发育参数的动力学信息。持续到受精后三天的动力学信息用于根据图6所表示的算法对胚胎评分，从而将每一胚胎指派给一个得分组(1、2、3、4或5)。

被分配得分1的胚胎的数量是2024个(其中1911个通过传统IVF受精；93个通过ICSI受精；并且20个的受精方法是未知的)。被分配得分2的胚胎的数量是1443个(其中1281个通过传统IVF受精；143个通过ICSI受精；并且19个的受精方法是未知的)。被分配得分3的胚胎的数量是656个(其中629个通过传统IVF受精；16个通过ICSI受精；并且11个的受精方法是未知的)。被分配得分4的胚胎的数量是1734个(其中1546个通过传统IVF受精；147个通过ICSI受精；并且41个的受精方法是未知的)。被分配得分5的胚胎的数量是4459个(其中3991个通过传统IVF受精；417个通过ICSI受精；并且51个的受精方法是未知的)。因此，对于总共10,316个胚胎，9358个通过传统IVF受精；816个通过ICSI受精；并且142个的受精方法是未知的。

为了评估模型算法作为囊胚预测工具的能力，针对5个得分组中的每一个确定截止受精后120小时发育到囊胚期(囊胚形成)的胚胎的比例。其结果呈现于图18中。这清楚地显示随着得分增加，与每一得分有关的发育到囊胚期的胚胎的比例也增加(例如，超过60％的与得分5有关的胚胎发育到囊胚期，而大约10％的与得分1有关的胚胎发育到囊胚期)。这进一步证明了上述方法用于确定胚胎发育潜力的指标(在这种情况下是发育到囊胚期的可能性)的能力。

为了测试形成囊胚的胚胎的比例在胚胎被指派的得分组之间的差异，对于作为解释变量(固定效应)的不同得分组、受精方法(ICSI或IVF)和培养氧含量(减氧或环境氧)的囊胚形成可能性执行广义线性混合效应回归(GLMER，具有伯努利误差分布)。包括得分组、受精方法和氧含量之间的所有相互作用项以验证得分组中的囊胚形成比例是否受这些培养特征影响。为了解释患者和诊所变化性，这个信息被作为随机截距包括在内，其中患者聚在诊所内。逐步向后剔除(stepwise backwards elimination)用于模型降阶，所述模型降阶以包括参数的所有相互作用的全模型开始。在剔除程序中使用p<0.01的纳入标准。最终模型包括得分和受精方法(ICSI/IVF)的主效应。

这个分析展示了1)得分组之间的囊胚形成可能性的显著差异，其中增加的得分与增加的囊胚形成可能性有关，和2)IVF的囊胚比例高于ICSI。这说明了本文所述的原理可基于受精后第3天时可获得的信息使用以预测囊胚形成可能性。由于发现相互作用项中的每一个都不显著，因此可以总结得分组中的囊胚比例的一般模式在IVF和ICSI之间是相同的。IVF中的囊胚比例高于ICSI中这一事实可以由ICSI尤其用于更困难的情况的一般临床实践解释。

本发明的其它特定和优选方面在随附的独立权利要求和附属权利要求中阐述。应了解，附属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征组合，形成除权利要求中明确阐述的组合以外的组合。

参考文献

[1]Ciray等人,"Proposed guidelines on the nomenclature and annotation of dynamic human embryo monitoring by a time-lapse user group"(关于对通过时差用户基团监控动态的人胚胎的命名和注释指南),Hum.reprod.2014；29；2650-2660。