一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白sbp及应用的制作方法

本发明涉及家畜基因工程疫苗领域，具体涉及一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白sbp及应用。

技术背景

红斑丹毒丝菌感染猪导致猪丹毒，是上世纪90年代猪三大传染病之一。之后由于商业化疫苗的使用，猪丹毒逐渐得到有效的控制。但2010年以来，猪丹毒在我国部分省市重新流行。2012年猪丹毒病例已逐渐增多。至2013年我国湖南、湖北、江西、广西、四川、广东、浙江等多个省份均出现了猪丹毒的大范围流行，给猪场造成了巨大的经济损失。

青霉素一直是治疗猪丹毒的有效药物。然而，湖南动物疾病中心何世成等人于2011年分离到3株耐青霉素红斑丹毒丝菌。申请人对分离自湖北地区发病猪场的31株红斑丹毒丝菌的耐药性(李敬涛，湖北部分地区红斑丹毒丝菌分离株耐药性分析，养殖与饲料[j].2015.2，11-14)进行分析发现：临床分离株对常用的卡那霉素、链霉素、阿米卡星、多粘菌素b、万古霉素、庆大霉素6种抗生素耐药率为100％。这说明临床上长期使用抗生素已导致红斑丹毒丝菌产生了严重的耐药性。

红斑丹毒丝菌商业化疫苗主要为灭活疫苗和弱毒疫苗。但不同菌株的毒力基因表型存在较大差异，灭活疫苗对异源菌株的保护力不佳。而弱毒疫苗不能清除定居在扁桃体或关节里的红斑丹毒丝菌，同时母源抗体和药物很容易干扰疫苗的效力，且弱毒疫苗存在毒力返强的可能性，对免疫猪群存在很大的风险。因此开发新型亚单位疫苗有利于更好的防控猪丹毒。

目前猪丹毒的亚单位疫苗研究还比较少。已报道的红斑丹毒丝菌的保护性抗原主要为spaa。但是该蛋白分子量比较大，获得全长蛋白比较困难，成本比较高。对n端截短蛋白的保护性进行研究发现其也能给仔猪提供不错的保护力，但是spaan端保守性不高，不同临床分离红斑丹毒丝菌菌株的spaa蛋白n端存在差异，因此spaa截短蛋白能否保护猪群免受当前中国国内流行的不同红斑丹毒丝菌感染还不确定。

本实验室对临床分离的红斑丹毒丝菌强度菌株和弱毒菌株的细胞壁蛋白进行比较蛋白质组学研究发现：本发明提供的sbp蛋白在强毒菌株中高表达，强毒菌株中高表达的蛋白一般是潜在的毒力相关蛋白或是亚单位疫苗侯选体。因此，本实验室扩增了31株红斑丹毒丝菌临床分离菌株的sbp基因并测序，发现sbp基因序列在不同临床分离株中高度保守，序列一致。鉴于此，本发明着手于红斑丹毒丝菌sbp蛋白的免疫保护效果评价，寻找能提供高效免疫力、生物安全性高的抗原成分，保护猪群抵抗当前流行毒株的侵袭。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白sbp，其氨基酸序列为seqidno.2所示。其对应的核苷酸序列为seqidno.1所示。

本发明另一个目的在于提供了一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白sbp在制备猪丹毒疫苗中的应用，利用本发明提供的蛋白无菌处理后与佐剂按比例混合，肌肉免疫仔猪，发现其可有效提高攻毒后仔猪存活率。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白sbp，其氨基酸序列为seqidno.2所示。可利用常规方案，例如合成，原核表达等方式获得该蛋白。

seqidno.2所示氨基酸序列对应的核苷酸序列也为本发明的保护范围，优选的所述的核苷酸序列为seqidno.1所示。

一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白sbp在制备猪丹毒亚单位疫苗的应用，包括利用该蛋白无菌处理后与佐剂按比例混合，制备为猪丹毒亚单位疫苗；或是该疫苗与其他已知疫苗组合制备为多联疫苗。

与现有疫苗相比，本发明具有以下优点：

弱毒疫苗毒力减弱的机制不清楚，存在毒力返强的可能性，对易感猪群存在潜在的威胁。灭活疫苗可以为同源红斑丹毒丝菌提供较好的保护效果，但不同菌株的毒力基因存在差异，其对异源菌株的保护效果很弱。本发明提供的亚单位疫苗具有好的保护效果，生物安全性高。

附图说明

图1重组质粒pet-28a-sbp双酶切鉴定图。

图2为实施例1中制备的sbp蛋白检测示意图。

图2a重组抗原纯化sds-page电泳；图2bwestern-blot分析示意图。

图3亚单位疫苗sbp免疫仔猪后体温检测。

图4亚单位疫苗sbp免疫仔猪后抗体滴度。

图5免疫仔猪攻毒后症状。

图6免疫仔猪攻毒后存活率。

具体实施方式

本发明所述试剂如未特别说明，均购自商业渠道或为本领域的常规配制试剂。所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

红斑丹毒丝菌抗原蛋白(本发明或称sbp蛋白)的制备：

本发明实施例以原核表达为例，对该蛋白的表达进行说明：

大肠杆菌(escherichiacoli)bl21/pet-28a-sbp的构建，表达并纯化目的蛋白

1)构建表达载体

将sbp基因(seqidno.1所示序列)按常规方法插入pet-28a(+)的bamhi和xhoi酶切位点之间，构建重组载体pet-28a-sbp。转化至dh5a感受态菌株中，挑取阳性克隆扩大培养后提取质粒，利用bamhi+xhoi双酶切质粒，酶切后出现预期大小的外源片段即为正确的重组质粒。重组质粒的双酶切鉴定结果如图1所示，双酶切的条带符合sbp基因的大小。将重组质粒pet-28a-sbp转化至感受态细胞bl-21(de3)中，采用菌落pcr的方法，挑选阳性克隆扩大培养，提取质粒双酶切鉴定同时将质粒送上海生工生物公司测序，比对正确，即为sbp蛋白的表达菌株。

2)表达、纯化目的蛋白

将大肠杆菌bl21/pet-28a-sbp接种于5mllb液体培养基中(含25μg/mlkan)，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μl接种于100ml的新鲜lb液体培养基中(含25μg/mlkan)，置于37℃摇床振荡培养约3h至od600达到0.8，加iptg至终浓度为0.2mmol/l，继续培养3h后收集菌体。

将诱导后的重组大肠杆菌8000r/min离心15min。沉淀用50mlbingdingbuffer(20mmtris-hclph7.9，5mmimidazole，0.5mnacl)重悬，冰浴30min，冰浴条件下进行超声碎破至菌液清亮，4℃12,000r/min离心15min取上清。上清包含有sbp重组蛋白，将上清用蛋白纯化仪amershanbioscienceupc-900进行纯化，得到纯化的sbp重组蛋白。

获得的重组蛋白sbp(包括seqidno.2所示序列)进行sds-page分析(如图2a所示)，条带大小为48kd，符合sbp蛋白的大小。用western-blot方法(见《分子克隆手册》)分析重组抗原蛋白sbp的免疫原性，结果如图2b所示sbp蛋白可以和sbp免疫鼠阳性血清发生特异性反应，具有较好的免疫原性，用于以下实施例。

实施例2：亚单位疫苗成分及常规检验

抗原组分：sbp蛋白溶液(蛋白的表达、鉴定、纯化及定量如实施例1所述)。

剂型：油包水型(w/o)

佐剂组成：白矿油(marcol52)

吐温80(crillet4)

司盘80(crill4)

油相：白矿油加热至透明后与司盘80按体积比94：6配制。

水相：sbp蛋白溶液与吐温80组成，吐温80占水相的0.4％(体积比)。

疫苗乳化：sbp蛋白加入吐温80混匀制成水相，水相与油相按1：1.5体积混合乳化。使抗原蛋白sbp的终浓度为1mg/ml，用于以下实验，本发明提供的sbp蛋白疫苗或称为sbp亚单位疫苗。

疫苗性状检测：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散开，第二滴油珠状，晃动液面油珠不破乳。

无菌检测：取少许疫苗涂布tsa平皿，37℃温箱培养18小时无菌落长出。

稳定性检验：3000rpm/min离心15分钟，离心后乳化疫苗未分层。

实施例3：

一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白sbp在制备猪丹毒亚单位疫苗的应用：

1)实验方案

实验动物：30日龄仔猪(红斑丹毒丝菌抗体检测为阴性)，购自武汉天种青草湖养殖有限公司。

攻毒菌株：红斑丹毒丝菌se38株(以下简称se38，李敬涛，湖北部分地区红斑丹毒丝菌分离株耐药性分析，养殖与饲料[j].2015.2，11-14)。

实验分组：30日龄仔猪分为3组：免疫1组(sbp)、免疫2组(sbp)、佐剂对照组(实施例2所述佐剂成分与tris-hcl混合)，每组6头。免疫1组、佐剂对照组用于攻毒，免疫2组用于检测抗体水平，连续检测8个月。

免疫方式：颈部和臀部多点注射，免疫剂量为2ml/头，每2周免疫1次，共2次，所用疫苗为实施例2制备的sbp亚单位疫苗。

2)亚单位疫苗对仔猪的生物安全性评价

首次免疫后连续7天监测体温，观察免疫后仔猪的采食及精神情况。免疫后仔猪没有明显应激症状，免疫后第二天免疫1组、佐剂组体温均轻微上升，上升幅度不超过1℃。至第三天体温基本恢复正常，期间仔猪采食量未见减少，体温的短暂上升对仔猪的生长影响较小，体温变化如图3所示。

3)免疫后仔猪抗体水平检测

免疫1组、佐剂对照组首次免疫后，连续四周每周耳静脉采血，用于血清特异性抗体的检测；免疫2组每个月采血一次，用于血清特异性抗体的长期检测。采集的血液凝集后，3000rpm/min离心，分离血清，保存于-80℃冰箱备用。

将纯化的重组蛋白sbp加入包被液(1.59gna2co3，2.93gnahco3，加ddh20定容至 1l)中调整蛋白浓度，包被elisa板(蛋白浓度为100ng/孔)，4℃过夜；去掉包被液，pbst洗涤3次后每孔加入120ul封闭液(含有5％脱脂乳的pbst溶液)，pbst洗涤3次；加入待检血清，用封闭液按1:4、1:8……1:2²⁰依次两倍倍比稀释，37℃温育1h后pbst洗涤3次；每孔加入100ul按1:5000稀释的羊抗鼠二抗，37℃温育30min后pbst洗涤5次；加入底物a、b显色10min后加入终止液，酶标仪读取od630nm。每孔测定值od630nm≥0.39，判定为阳性；每孔测定值od630nm＜0.39，判定为阴性。

仔猪抗体水平检测发现：首免第一周诱导的抗体水平较弱，平均值为2⁵，随后几周诱导的抗体水平逐渐升高，在首免第四周(即二免两周)高达2¹⁶，如图4所示；

4)免疫仔猪攻毒后保护力测定

二免两周后的仔猪进行抗体水平检测后，皮下注射se38菌液，攻毒剂量为9×10⁸cfu/头(3ld100)。连续观察14天，记录临床特征及存活率。

攻毒后，佐剂组仔猪全部发病，在攻毒第二天即出现体温升高，随后陆续有仔猪出现行动迟缓、站立颤抖、食欲废绝、消瘦，全身皮肤呈现菱形红斑等症状(如图5a所示)，该组仔猪在攻毒后一周内全部死亡；而免疫1组有3头仔猪发病，其中两头仔猪出现佐剂组仔猪相同症状，并于7天内死亡，另外一头仔猪发病症状较轻，皮肤仅限于攻毒部位处出现红斑随后恢复正常(如图5b)所示，免疫1组攻毒后存活4头，存活率为66.7％(如图6所示)。攻毒十天后，将免疫1组存活仔猪处以安乐死并进行剖检，选择心、肝、脾、肺、肾组织进行分菌，均未分离到se38菌株。说明本发明制备的sbp亚单位疫苗可以为仔猪提供较好的保护效果，并有助于感染后仔猪体内红斑丹毒丝菌的清除。

5)免疫后仔猪抗体水平消长规律

免疫后，对免疫2组进行为期7个月的抗体水平检测发现：首次免疫2周后抗体开始上升，28天全部表现较高的抗体水平，抗体滴度达到1:2¹⁶，首次免疫后第28-90天为抗体高峰期，之后抗体滴度开始下降，至免疫180天，抗体滴度还能达到1:2⁸，免疫210天虽能检测到抗体，但抗体滴度非常低。由此说明免疫sbp蛋白后仔猪抗体至少可维持6个月(表1)。

表1：免疫后仔猪抗体滴度检测

本亚单位疫苗对我国临床分离的强毒红斑丹毒丝菌能提供66.7％的保护率，有助于感染后仔猪体内红斑丹毒丝菌的清除，且本实验室当前分离到的31株(李敬涛，湖北部分地区红斑丹毒丝菌分离株耐药性分析，养殖与饲料[j].2015.2，11-14)红斑丹毒丝菌中均可以扩增到高度保守的sbp基因(同源性≥98)。说明该亚单位疫苗可以用于当前我国猪丹毒的防制。经过添加其他蛋白疫苗有望获得更好的保护效果。

实施例4：

超剂量接种的安全性试验

试验动物：30日龄仔猪(红斑丹毒丝菌抗体检测为阴性)，购自武汉天种青草湖养殖有限公司。

免疫疫苗：实施例2中制备的sbp亚单位疫苗。

免疫剂量与免疫方式：4ml(2倍于正常剂量)在仔猪臀部肌肉处注射。

试验结果：免疫后连续观察一周，免疫仔猪仅在免疫后第一天出现体温小幅度(1℃以内)上升，第二天便恢复正常。免疫后仔猪食欲、精神状态都正常，表明本发明的亚单位疫苗对仔猪超剂量免疫接种是安全的。

sequencelisting

<110>华中农业大学

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<130>一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白sbp及应用

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<213>人工序列

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