一种小反刍兽疫病毒F蛋白抗原表位肽及其确定、制备方法和应用与流程

本发明属于生物信息学和免疫学技术领域，具体涉及一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽及其确定、制备方法和应用。

背景技术：

小反刍兽疫病毒(pprv)属于麻疹病毒属(morbillivirus)，是引起山羊和绵羊等小反刍动物急性传染病的病原，该病特点是高发病率和高死亡率，被世界动物卫生组织(oie)列为法定报告动物传染病，我国将其列为i类动物疫病。最初的报道小反刍兽疫病毒仅感染山羊和绵羊，但近几年病毒种间传播的病例被不断报道，目前该病主要分布于非洲和亚洲，正威胁欧洲。

目前，该病的主要预防手段是弱毒疫苗免疫，但是该疫苗存在热稳定性和毒力反强等问题，并且不利于小反刍兽疫的全球消灭计划，f是镶嵌在pprv囊膜上的糖蛋白，构成病毒粒子表面的纤突，hn蛋白能够与淋巴细胞上的slam受体相互作用介导病毒入侵，但是病毒的入侵过程需要f蛋白的帮助才可以完成，小反刍兽疫病毒能引起机体强烈的细胞免疫和体液免疫应答，而f蛋白则是主要的保护性抗原；另外，f蛋白可能是麻疹病毒属中具有交叉保护特性的主要原因，f蛋白在疫苗设计和检测方法建立中重要的靶点，因此f蛋白的抗原表位图谱绘制和抗体制备具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽。

本发明的另一目的在于提供该小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽在小反刍兽疫病毒表位疫苗抗原和诊断试剂抗原制备中的应用。

本发明的另一目的在于提供该小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位的确定、制备方法。

本发明采用的技术方案为：一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为：f176：¹⁷⁶dyinnelvpsvhrmscel¹⁹³，或/和f347：³⁴⁷mspllqecfrgstks³⁶¹，或/和f391：³⁹¹ckcyttetvinqdpdkll⁴⁰⁸，或/和f417：⁴¹⁷tvinqdpdkgpvgsreypd⁴³⁵，或/和f430：⁴³⁰sreypdsvylh⁴⁴⁰，或/和f502：⁵⁰²vslglvtliccckgrcrnk⁵²⁰。

一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽在小反刍兽疫病毒表位疫苗抗原和诊断试剂抗原制备中的应用。

一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位的确定、制备方法，所述方法包括如下步骤：

计算模拟：

步骤一，用分子模拟软件构建虚拟f蛋白的3d结构：利用swiss-model对疫苗株pprv-f蛋白进行同源模建(genbank登录号：x74443)；

步骤二，搜索模板：搜索pdb数据库(www.pdb.org)，寻找通过实验解析出的同源蛋白的结构，选择序列一致性在20％以上，并且比对序列较长的蛋白结构作为模板结构，进行后续的计算；

步骤三，建模：将比对结果提交服务器，根据模板蛋白的空间坐标和序列的相似性推测结构，从而计算得到目标蛋白结构，即每次模建生成3个不同的目标蛋白结构；

步骤四，评估结构：采用拉氏构象图分析方法评估蛋白结构的合理性，若位于不许可区的非甘氨酸/脯氨酸所占比例不超过5％，则说明模拟的蛋白结构是合理的，可以进行后续的计算分析；

基于免疫信息学的预测：

步骤一，pprv-hn蛋白b细胞抗原表位预测：将pprvf蛋白的氨基酸序列用iedb、immunomedicinegroup和bepipred免疫信息学分析软件进行分析，综合分析预测其b细胞抗原表位；

步骤二，抗原表位的合成：将软件预测的抗原表位氨基酸序列送genescript公司用多肽合成仪合成，合成后用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)分析多肽合成的纯度及氨基酸的正确性；

抗体的制备：

步骤一，免疫动物：具有反应原性目的抗原rpprv-hn-f和小反刍兽疫病毒糖蛋白(pprv-glycoprotein)免疫6-8周龄雌性balb/c小鼠，颈背部皮下四点注射，免疫蛋白样品量为50μg/只，免疫体积200μl/只；首次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫用等体积弗氏不完全佐剂佐剂乳化；每隔14天免疫一次，三次免疫14天后小鼠断尾采血检测血清中的抗体，待抗体效价高1：10000后方可进行四免，四免不用佐剂，腹腔注射；

步骤二，多克隆抗体的纯化，将乙醚完全浸润的脱脂棉和小鼠同时放入麻醉盒，待小鼠完全失去知觉时，摘取眼球取学，收集完成后，将小鼠断颈处死，全血放37℃孵育30分钟后4℃过夜，4℃，1500rpm，离心15分钟，取血清，-20℃备用；

表位的鉴定；

预测的表位经过生物合成，鉴定符合实验要求，使用氨基化酶标板作为固相载体的间接elisa方法进行；

稀释：将合成并冻干的表位肽用高压过的去离子水稀释成1μg/μl；

表位肽包被：将稀释好的表位肽包被在氨基化酶标板上，每孔50μl包被液，抗原的含量为5μg，4℃过夜；

洗板：将酶标孔里的液体尽可能甩尽，然后每孔加入约250μlpbst，静置3分钟，重复三次，最后将酶标板在纱布上拍干；

封闭：向酶标孔中加入1×封闭液150μl，37℃温箱孵育1.5小时后，将酶标孔里的封闭液尽可能甩尽，最后将酶标板在纱布上拍干后备用；

孵育一抗：用封闭液将单克隆抗体按1:500稀释，加入酶标板每孔50μl，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

孵育二抗：用封闭液将hrp标记抗鼠igg二抗按1:5000稀释，加入酶标板每孔50μl，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

显色：每孔加入50μltmb显色液，避光37℃孵育15分钟；

终止：每孔加入50μl终止液，终止显色；

读取：用终点法在波长450nm处对酶标板进行检测，读取od450nm吸光度值。多表位抗原设计：

步骤一：设计多表位基因及诱导表达，将表位按照在天然蛋白中的顺序排列，表位之间加gs接头分子，送南京金斯瑞公司合成基因片段，连接到pet30a载体中，将载体转化到宿主菌中，按照培养温度37℃，诱导剂iptg终浓度为1.0mm，氨苄青霉素lb培养基，诱导7小时进行诱导表达；

步骤二：多表位抗原的纯化，

破碎菌体：将菌体反复冻融3次，用pbs缓冲液重悬菌体超声破碎；

离心：将破碎的菌体4℃10000rpm离心20分钟，分别收集沉淀和上清；

样品准备：使用缓冲液i(ph＝7.4)重悬上步收集的沉淀，充分混匀，8000rpm，4℃离心20分钟，取上清用0.45μm滤器过滤处理待上样；

平衡ni柱：先在柱子底部加入少量去离子水排除空气，再装入2mlni-nat填料，将装好的柱子用5倍体积的去离子水洗涤以去除乙醇，最后用5倍体积的缓冲液i(ph＝7.4)平衡柱材；

上样：将滤器过滤处理后的样品，分次与柱材结合，静置，待自然沉降，收集流湍液4℃环境保存；

洗涤：分次向柱子中加入缓冲液i(ph＝7.4)，总体积应大于上样量的5倍体积；洗脱：使用含有10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、300mm和400mm咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱蛋白，每个洗脱浓度静置15分钟，收集各浓度洗脱液置于冰上；

柱子保存：洗脱步骤完成后，用5倍柱材体积的缓冲液i(ph＝7.4)清洗柱子，加入适量20％乙醇4℃保存；

步骤三：多表位抗原的鉴定，

蛋白电泳样品准备：取40μl蛋白上述步骤中分离的蛋白样品于1.5ml离心管中，再加入10μl5×蛋白上样缓冲液，煮沸10分钟，置于4℃冰箱快速降温；上样及电泳：取10μl于12％sds-page中，100mv电泳；

转膜：将nc膜剪至与凝胶等量大小，并置于转移缓冲液中浸泡5分钟，按照从负极到正极的顺序分别放置厚滤纸、凝胶、nc膜、厚滤纸，注意应避免产生气泡，200ma恒流湿转100分钟；

封闭：取出转印后的nc膜，置于适量5％脱脂奶粉中，室温封闭两小时；

加一抗：将封闭完成的nc膜置于5％的bsa中，加入鼠抗his单克隆抗体(稀释比例1:2500)和羊源小反刍兽疫阳性血清(稀释比例为1:250)，4℃冰箱过夜孵育；

洗涤：一抗孵育完成后，用pbst摇动洗涤3次，每次10分钟；

加二抗：将nc膜置于兔抗鼠igg-hrp(1:5000比例稀释)和驴抗羊igg-hrp(1:25000比例稀释)二抗中，稀释液为含有5％脱脂奶粉的pbst，室温摇动孵育1小时；

洗涤：同上步洗涤；

显色：将洗涤完成的nc膜置于凝胶成像系统中，混合ecl超敏发光液a和b，滴在nc膜上室温孵育3分钟；

观察：调节不同的曝光时间，直到清洗看到明显的条带；

步骤四：免疫小鼠，将小白鼠分为5组，a组：pbs+弗氏不完全佐剂，b组：疫苗，c组：ehf1+弗氏不完全佐剂，d组：ehf2+弗氏不完全佐剂，e组：ehf3+弗氏不完全佐剂。每组12只小鼠，每只免疫蛋白50μl，免疫体积每只200μl。颈背部分四点皮下注射，21天后再次免疫；

步骤五：小鼠特异性抗体检测，0天、7天、14天、28天和35天断尾采血，37℃孵育30分钟，4℃过夜，3000rpm离心15分钟收集血清，储存于-80℃备用。用包被pprv全病毒的间接酶联免疫法检测抗体水平；

步骤六：小鼠t淋巴细胞水平检测，检测免疫小鼠cd3+cd4+t细胞和cd3+cd8+t细胞的增值情况，采用流式细胞技术检测免疫后0天，14天和26天外周血t细胞，在第35天检测脾脏中的t淋巴细胞；步骤如下：

采血：断尾采取小鼠抗凝血，每组采集5只小鼠，每只100μl；

抗体孵育：将采集的每只100μl抗凝血平均分成两份，其中一份加入apchamsteranti-mousecd3e抗体和peratanti-mousecd4抗体各2.5μl，fitcratanti-mousecd8a抗体1μl；另一份加入apchamsterigg1,κisotypecontrol抗体、peratigg2a,κisotypecontrol抗体和fitcratigg2a,κisotypecontrol抗体各2.5μl，混匀后，避光4℃孵育15分钟；

裂解红细胞：加入1ml1×红细胞裂解液，混匀，避光室温孵育10分钟；

洗涤：加入1mlhank’s液,混匀，1000g离心5分钟，重复2次；

过滤：上样前用高压后的300目尼龙网过滤；

上样：将准备好的样品放在流式细胞仪上样架上，准备收集细胞。

本发明的有益效果是：

在veroe6细胞接种小反刍兽疫病毒，检测多克隆抗体与小反刍兽疫病毒的反应原性以及抗体的特异性。结果显示，rpprv-hn-f多克隆抗体(图1a)与vero细胞中的小反刍兽疫病毒反应，表现较强的绿色荧光，不与vero细胞反应没有荧光(图1c)；小鼠阴性血清不与vero细胞中的小反刍兽疫病毒反应(图1b)，没有荧光。表明，rpprv-hn-f多克隆抗体是小反刍兽疫病毒的特异性抗体；pprv-glycoprotein多克隆抗体(图2)与小反刍兽疫病毒同样具有良好的反应原性和特异性。

用western-blotting方法对获得的rpprv-hn-f(图3a)和pprv-glycoprotein(图3b)多克隆抗体进行了基于原核表达纯化rpprv-hn-f蛋白的特异性检测，空载体表达菌作为阴性对照，结果显示rpprv-hn-f蛋白泳道出现单一条带，而空载体表达菌泳道没有条带，表明两种多克隆抗体与rpprv-hn-f蛋白具有良好的反应原性，并且不与空载体表达菌反应具有良好的特异性。

应用氨基化酶标板检测了候选表位与rpprv-hn-f多克隆抗体(图4)和pprv-glycoprotein(图5)多克隆抗体的反应原性，确定候选表位f176、f347、f391、h417、f430和f502。

利用swiss-model预测了小反刍兽疫病毒nigeria75/1毒株f蛋白的头部结构，显示f176、f347、f391、f417和f430位于f蛋白的表面(图6蓝色部分)。

合成的三种多表位基因间接到pet30a载体中，经过双酶切鉴定(图7)表明目的条带正确的插入到了载体相应的位置上。送金唯智生物公司进行质粒测序的结果与合成序列比对，未发现有突变情况，表明正确的序列插入到了载体正确的位置上。

质粒经过诱导表达，纯化获得了高纯度的抗原蛋白(图8)。

利用his标签抗体对表达的融合蛋白进行western-blotting特异性检测。结果显示，在阳性克隆泳道中出现特异性的条带，而空载体宿主菌泳道中没有条带(图9)，表明宿主菌成功表达了his融合蛋白，即为目的蛋白。

检测小鼠外周血抗体水平，基于全病毒的结果显示(图10)，各多表位抗原均能激起小鼠的抗体水平，ehf1蛋白组效果较好。

为了解t淋巴细胞的增值变化，利用流式细胞术检测了小鼠外周血和脾脏中的cd3+cd4+t淋巴细胞和cd3+cd8+t淋巴细胞的增值情况。对免疫后第0天、14天、26天和35天不同时间点t淋巴细胞的水平进行了检测，结果显示，不同组在同一时间点cd3+cd4+t淋巴细胞水平有所不同，但是变化不显著(图11)。但是，不同组不同时间点cd3+cd8+t淋巴细胞的水平确实不同(图11)。因此，多表位抗原可以有效激发小鼠的细胞免疫。

附图说明

图1是rpprv-hn-f多克隆抗体是小反刍兽疫病毒的特异性抗体；

图2pprv-glycoprotein多克隆抗体与小反刍兽疫病毒同样具有良好的反应原性和特异性；

图3westernblotting检测多克隆抗体与rpprv-hn-f蛋白具有良好的反应原性和特异性；

图4rpprv-hn-f多克隆抗体筛选f蛋白b细胞表位库结果；

图5pprv-glycoprotein多克隆抗体筛选f蛋白b细胞表位库结果；

图6f176、f347、f391、f417和f430表位在f蛋白结构中的位置；

图7重组质粒pet30a-ehf1、pet30a-ehf2和pet30a-ehf3的双酶切鉴定；

图8多表位重组抗原ehf1、ehf2和ehf3纯化后sds-page分析；

图9western-blotting检测his融合蛋白表达；

图10基于全病毒间接elisa法检测小鼠抗体水平；

图11免疫后小鼠t淋巴细胞增值变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明所述的一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽，其抗原表位肽的氨基酸序列为：

f176：¹⁷⁶dyinnelvpsvhrmscel¹⁹³(seqidno.1)

或/和f347：³⁴⁷mspllqecfrgstks³⁶¹(seqidno.2)

或/和f391：³⁹¹ckcyttetvinqdpdkll⁴⁰⁸(seqidno.3)

或/和f417：⁴¹⁷tvinqdpdkgpvgsreypd⁴³⁵(seqidno.4)

或/和f430：⁴³⁰sreypdsvylh⁴⁴⁰(seqidno.5)

或/和f502：⁵⁰²vslglvtliccckgrcrnk⁵²⁰(seqidno.6)。

本发明使用多种免疫信息学软件对目标蛋白进行b细胞表位进行预测，然后对预测的不同表位分别进行人工合成，应用间接elisa方法进行验证其反应原性，不同的多肽包被氨基化酶标板，检测与f蛋白的抗体的反应原性，从而鉴定出pprvf蛋白的b细胞表位。

本发明一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位的确定、制备方法，所述方法包括如下步骤：

计算模拟：

步骤一，用分子模拟软件构建虚拟f蛋白的3d结构：利用swiss-model对疫苗株pprv-f蛋白进行同源模建(genbank登录号：x74443)；

步骤二，搜索模板：搜索pdb数据库(www.pdb.org)，寻找通过实验解析出的同源蛋白的结构，选择序列一致性在20％以上，并且比对序列较长的蛋白结构作为模板结构，进行后续的计算；

步骤三，建模：将比对结果提交服务器，根据模板蛋白的空间坐标和序列的相似性推测结构，从而计算得到目标蛋白结构，即每次模建生成3个不同的目标蛋白结构；

步骤四，评估结构：采用拉氏构象图分析方法评估蛋白结构的合理性，若位于不许可区的非甘氨酸/脯氨酸所占比例不超过5％，则说明模拟的蛋白结构是合理的，可以进行后续的计算分析；

基于免疫信息学的预测：

步骤一，pprv-hn蛋白b细胞抗原表位预测：将pprvf蛋白的氨基酸序列用iedb、immunomedicinegroup和bepipred免疫信息学分析软件进行分析，综合分析预测其b细胞抗原表位；

步骤二，抗原表位的合成：将软件预测的抗原表位氨基酸序列送genescript公司用多肽合成仪合成，合成后用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)分析多肽合成的纯度及氨基酸的正确性；

抗体的制备：

步骤一，免疫动物：具有反应原性目的抗原rpprv-hn-f和小反刍兽疫病毒糖蛋白(pprv-glycoprotein)免疫6-8周龄雌性balb/c小鼠，颈背部皮下四点注射，免疫蛋白样品量为50μg/只，免疫体积200μl/只；首次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫用等体积弗氏不完全佐剂佐剂乳化；每隔14天免疫一次，三次免疫14天后小鼠断尾采血检测血清中的抗体，待抗体效价高1：10000后方可进行四免，四免不用佐剂，腹腔注射；

步骤二，多克隆抗体的纯化，将乙醚完全浸润的脱脂棉和小鼠同时放入麻醉盒，待小鼠完全失去知觉时，摘取眼球取学，收集完成后，将小鼠断颈处死，全血放37℃孵育30分钟后4℃过夜，4℃，1500rpm，离心15分钟，取血清，-20℃备用；

表位的鉴定；

预测的表位经过生物合成，鉴定符合实验要求，使用氨基化酶标板作为固相载体的间接elisa方法进行；

稀释：将合成并冻干的表位肽用高压过的去离子水稀释成1μg/μl；

表位肽包被：将稀释好的表位肽包被在氨基化酶标板上，每孔50μl包被液，抗原的含量为5μg，4℃过夜；

洗板：将酶标孔里的液体尽可能甩尽，然后每孔加入约250μlpbst，静置3分钟，重复三次，最后将酶标板在纱布上拍干；

封闭：向酶标孔中加入1×封闭液150μl，37℃温箱孵育1.5小时后，将酶标孔里的封闭液尽可能甩尽，最后将酶标板在纱布上拍干后备用；

孵育一抗：用封闭液将单克隆抗体按1:500稀释，加入酶标板每孔50μl，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

孵育二抗：用封闭液将hrp标记抗鼠igg二抗按1:5000稀释，加入酶标板每孔50μl，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

显色：每孔加入50μltmb显色液，避光37℃孵育15分钟；

终止：每孔加入50μl终止液，终止显色；

读取：用终点法在波长450nm处对酶标板进行检测，读取od450nm吸光度值；

多表位抗原设计：

步骤一：设计多表位基因及诱导表达，将表位按照在天然蛋白中的顺序排列，表位之间加gs接头分子，送南京金斯瑞公司合成基因片段，连接到pet30a载体中。将载体转化到宿主菌中，按照培养温度37℃，诱导剂iptg终浓度为1.0mm，氨苄青霉素lb培养基，诱导7小时进行诱导表达。

步骤二：多表位抗原的纯化，

破碎菌体：将菌体反复冻融3次，用pbs缓冲液重悬菌体超声破碎；

离心：将破碎的菌体4℃10000rpm离心20分钟，分别收集沉淀和上清；

样品准备：使用缓冲液i(ph＝7.4)重悬上步收集的沉淀，充分混匀，8000rpm，4℃离心20分钟，取上清用0.45μm滤器过滤处理待上样；

平衡ni柱：先在柱子底部加入少量去离子水排除空气，再装入2mlni-nat填料，将装好的柱子用5倍体积的去离子水洗涤以去除乙醇，最后用5倍体积的缓冲液i(ph＝7.4)平衡柱材；

上样：将滤器过滤处理后的样品，分次与柱材结合，静置，待自然沉降，收集流湍液4℃环境保存；

洗涤：分次向柱子中加入缓冲液i(ph＝7.4)，总体积应大于上样量的5倍体积；

洗脱：使用含有10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、300mm和400mm咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱蛋白，每个洗脱浓度静置15分钟，收集各浓度洗脱液置于冰上；

柱子保存：洗脱步骤完成后，用5倍柱材体积的缓冲液i(ph＝7.4)清洗柱子，加入适量20％乙醇4℃保存。

步骤三：多表位抗原的鉴定，

蛋白电泳样品准备：取40μl蛋白上述步骤中分离的蛋白样品于1.5ml离心管中，再加入10μl5×蛋白上样缓冲液，煮沸10分钟，置于4℃冰箱快速降温；

上样及电泳：取10μl于12％sds-page中，100mv电泳；

转膜：将nc膜剪至与凝胶等量大小，并置于转移缓冲液中浸泡5分钟，按照从负极到正极的顺序分别放置厚滤纸、凝胶、nc膜、厚滤纸，注意应避免产生气泡，200ma恒流湿转100分钟；

封闭：取出转印后的nc膜，置于适量5％脱脂奶粉中，室温封闭两小时；

加一抗：将封闭完成的nc膜置于5％的bsa中，加入鼠抗his单克隆抗体(稀释比例1:2500)和羊源小反刍兽疫阳性血清(稀释比例为1:250)，4℃冰箱过夜孵育；

洗涤：一抗孵育完成后，用pbst摇动洗涤3次，每次10分钟；

加二抗：将nc膜置于兔抗鼠igg-hrp(1:5000比例稀释)和驴抗羊igg-hrp(1:25000比例稀释)二抗中，稀释液为含有5％脱脂奶粉的pbst，室温摇动孵育1小时；

洗涤：同上步洗涤；

显色：将洗涤完成的nc膜置于凝胶成像系统中，混合ecl超敏发光液a和b，滴在nc膜上室温孵育3分钟；

观察：调节不同的曝光时间，直到清洗看到明显的条带。

步骤四：免疫小鼠,将小白鼠分为5组,a组：pbs+弗氏不完全佐剂，b组：疫苗，c组：ehf1+弗氏不完全佐剂，d组：ehf2+弗氏不完全佐剂，e组：ehf3+弗氏不完全佐剂,每组12只小鼠，每只免疫蛋白50μl，免疫体积每只200μl。颈背部分四点皮下注射，21天后再次免疫；

步骤五：小鼠特异性抗体检测,0天、7天、14天、28天和35天断尾采血，37℃孵育30分钟，4℃过夜，3000rpm离心15分钟收集血清，储存于-80℃备用，用包被pprv全病毒的间接酶联免疫法检测抗体水平；

步骤六：小鼠t淋巴细胞水平检测,检测免疫小鼠cd3+cd4+t细胞和cd3+cd8+t细胞的增值情况，采用流式细胞技术检测免疫后0天，14天和26天外周血t细胞，在第35天检测脾脏中的t淋巴细胞，步骤如下：

采血：断尾采取小鼠抗凝血，每组采集5只小鼠，每只100μl；

抗体孵育：将采集的每只100μl抗凝血平均分成两份，其中一份加入apchamsteranti-mousecd3e抗体和peratanti-mousecd4抗体各2.5μl，fitcratanti-mousecd8a抗体1μl；另一份加入apchamsterigg1,κisotypecontrol抗体、peratigg2a,κisotypecontrol抗体和fitcratigg2a,κisotypecontrol抗体各2.5μl,混匀后，避光4℃孵育15分钟；

裂解红细胞：加入1ml1×红细胞裂解液，混匀，避光室温孵育10分钟；

洗涤：加入1mlhank’s液,混匀，1000g离心5分钟，重复2次；

过滤：上样前用高压后的300目尼龙网过滤；

上样：将准备好的样品放在流式细胞仪上样架上，准备收集细胞。

由图1和2可以明显看到，在veroe6细胞接种小反刍兽疫病毒，检测多克隆抗体与小反刍兽疫病毒的反应原性以及抗体的特异性。结果显示，rpprv-hn-f多克隆抗体(图1a)与vero细胞中的小反刍兽疫病毒反应，表现较强的绿色荧光，不与vero细胞反应没有荧光(图1c)；小鼠阴性血清不与vero细胞中的小反刍兽疫病毒反应(图1b)，没有荧光。表明，rpprv-hn-f多克隆抗体是小反刍兽疫病毒的特异性抗体。pprv-glycoprotein多克隆抗体(图2)与小反刍兽疫病毒同样具有良好的反应原性和特异性。

图1和2间接免疫荧光检测多克隆抗体与小反刍兽疫病毒具有良好的反应原性和特异性。

a.veroe6细胞表现出合胞体，荧光强度较亮，并且出现在病变的细胞上，说明抗体具有良好的反应原性。

b.veroe6细胞没有出现荧光，说明对照抗体不与病毒反应。

c.veroe6细胞没有出现荧光，表明单克隆抗体不与veroe6细胞反应，说明单克隆抗体具有良好的特异性。

图3westernblotting检测多克隆抗体与rpprv-hn-f蛋白具有良好的反应原性和特异性。

图3a中1泳道为rpprv-hn-f蛋白，出现一个明显的条带，而2泳道空载体表达菌，没有条带，说明多克隆抗体与rpprv-hn-f蛋白具有良好的反应原性和特异性；同样的结果出现在图3b中。

图4rpprv-hn-f多克隆抗体筛选f蛋白b细胞表位库结果

用基于氨基化的酶标板为固相载体的间接elisa方法检测多克隆抗体与表位肽的反应原性。明显看出f176、f347、f391、f417和f502表位肽中，rpprv-hn-f多克隆抗体组的od450值极其显著与对照组od450值(p<0.00001)，f430表位肽中rpprv-hn-f多克隆抗体组的od450值极显著与对照组od450值(p<0.001)，表明f176、f347、f391、f417、f430和f502与rpprv-hn-f多克隆抗体具有良好的反应原性，即为有效表位。

图5pprv-glycoprotein多克隆抗体筛选f蛋白b细胞表位库结果

用基于氨基化的酶标板为固相载体的间接elisa方法检测多克隆抗体与表位肽的反应原性。明显看出f502表位肽中，pprv-glycoprotein多克隆抗体组的od450值极其显著与对照组od450值(p<0.00001)；f417表位肽中，pprv-glycoprotein多克隆抗体组的od450值极显著与对照组od450值(p<0.001)；f430表位肽中，pprv-glycoprotein多克隆抗体组的od450值显著与对照组od450值(p<0.05)，表明f417、f430和f502表位与pprv-glycoprotein多克隆抗体具有良好的反应原性，即为有效表位。

图6f176、f347、f391、f417和f430表位在f蛋白结构中的位置

可以明显看到，图中蓝色部分是抗原表位，从3d结构中可以明显看出该表位位于抗原的表面较为突出的地方，这是表位对应的抗体具有良好反应原性的重要原因。

图7重组质粒pet30a-ehf1、pet30a-ehf2和pet30a-ehf3的双酶切鉴定

m：dnamarker；1：pet30a载体双酶切产物；2：pet30a-ehf1载体双酶切产物；3：pet30a-ehf2载体双酶切产物；4：pet30a-ehf3载体双酶切产物

明显看出pet30a-ehf1、pet30a-ehf2和pet30a-ehf3均出线两条带，其中一条与pet30a对照一直，另外的条带与ehf1、ehf2和ehf3相一致，表明目的条带正确的插入到了载体相应的位置上。

图8多表位重组抗原ehf1、ehf2和ehf3纯化后sds-page分析

m：蛋白marker；1-3：多表位重组抗原ehf1、ehf2和ehf3

经过镍琼脂糖凝胶柱纯化多表位重组抗原，通过不同咪唑浓度的洗脱，目的蛋白从柱子上洗脱下来，sds-page分析结果显示多表位重组抗原各泳道没有明显的杂带，表明获得较纯的蛋白。

图9western-blotting检测his融合蛋白表达

1：空载体宿主菌沉淀；2：pet30a-ehf3/bl21(de3)沉淀；3：pet30a-ehf2/bl21(de3)沉淀；4：pet30a-ehf1/bl21(de3)沉淀

在阳性克隆pet30a-ehf1/bl21(de3)、pet30a-ehf2/bl21(de3)和pet30a-ehf3/bl21(de3)沉淀泳道中出现特异性的条带，分别在25kda左右，40-55kda之间和55-70kda之间，而空载体宿主菌泳道中没有条带，表明宿主菌成功表达了his融合蛋白，即为目的蛋白。

图10基于全病毒间接elisa法检测小鼠抗体水平

在第7天每组的小鼠都产生较低的抗体水平，在第14和21天每组小鼠抗体水平都在不断升高，第21天二次免疫，在第28和35天每组小鼠抗体水平也在升高，pbs组始终没有抗体。但是，相比疫苗组，试验组的抗体水平较低。然而，ehf1蛋白的水平在第21天是高于疫苗组的。三组试验组相比，ehf1蛋白组始终保持较高的抗体水平；ehf2蛋白组在二次免疫后才显著升高，在第35天ehf1蛋白组抗体水平相当；但是ehf3蛋白组抗体水平始终是最低的。

图11免疫后小鼠t淋巴细胞增值变化

在免疫后第14天疫苗组、ehf1、ehf2和ehf3的cd3+cd8+t淋巴细胞百分比显著高于pbs组；在免疫后第26天，不同实验组的cd3+cd8+t淋巴细胞百分比出现显著差异，疫苗组、ehf1组和ehf2组均显著高于pbs组，ehf3极其显著高于pbs组；疫苗组与ehf1组、ehf2组和ehf3组相比，ehf1组和ehf2组显著高于疫苗组，ehf3组则极显著高于疫苗组；在免疫后第35天，疫苗组、ehf1组、ehf2组和ehf3组的cd3+cd8+t淋巴细胞百分比极显著高于pbs组，ehf3组的cd3+cd8+t淋巴细胞百分比则显著高于pbs组，并且ehf1组的cd3+cd8+t淋巴细胞百分比极显著高于疫苗组。

经过以上方案鉴定的表位肽，为小反刍兽疫病毒表位疫苗抗原和诊断试剂抗原制备的研发提供了理论基础，对小反刍兽疫病毒的防治具有重大意义。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽及其确定、制备方法和应用

<130>2017

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<213>小反刍兽疫病毒

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