一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒。

背景技术：

肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae，MP)是造成儿童、老年人呼吸道感染的主要病原体，也是引起社区获得性肺炎的常见病原体。主要引起肺炎以及气管炎、支气管炎、哮喘等临床症状和一些严重的临床并发症。大环内酯类抗生素是目前治疗肺炎支原体肺炎的首选药物，抗生素滥用导致MP耐药性不断升高。

培养法是检测肺炎支原体的金标准，一旦检出，即可确诊。但其缺点在于需要的时间长，一般培养需2周左右，生长条件苛刻，当标本中MP数量少、培养基营养标准不够或操作方法不当时，就会出现假阴性结果；ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，应用于肺炎支原体，可检测IgM和IgG抗体，方法敏感，特异性高，是诊断肺炎支原体感染实用可靠的手段。肺炎支原体感染后可产生特异性的IgM、IgG类抗体，其中IgM类抗体出现最早，检测MP-IgM可作为早期感染的诊断指标，但重症感染及再感染者可能无此抗体产生。

技术实现要素：

本发明提供一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物、探针、方法及试剂盒，解决现有技术中培养法是检测肺炎支原体耗时长、生长条件苛刻、检测结果不准确的技术问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物和探针，检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。

一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的方法，包括：

样本核酸制备，以获得核酸模板；

分别针对肺炎支原体特异性P1基因、2063(A/G)基因、2064(A/G)基因、内标基因int设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；

取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；

配置酶试剂，其中，所述酶试剂由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；

将P1基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀；将2063(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将2064(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理

分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液和内标加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×30s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号，所述内标为含有内标int基因片段的质粒；

对于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，对于int基因，采用荧光PCR仪上的VIC通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。

一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、P1基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2063(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2064(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成。

其中，检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。

本发明的有益效果为：采用Taqman-MGB探针实时荧光PCR法，分别针对肺炎支原体特异性P1基因、23S rRNA基因耐药突变基因(2063A/G，2064A/G)、内标核酸设计引物和荧光标记探针，通过PCR反应检测荧光信号，扩增曲线结合CT值判断检测结果，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本发明具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对咽拭子样本中的肺炎支原体及耐药突变位点进行快速、准确检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例四的肺炎支原体感染样本的荧光定量PCR曲线图；

图2为本发明实施例四的2063(A/G)突变阳性样本的荧光定量PCR曲线图；

图3为本发明实施例四的2064(A/G)突变阳性样本的荧光定量PCR曲线图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例一

本发明实施例提供了一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的引物和探针，检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；

其中，P1基因设计的特异性引物的序列如下：

上游引物P-P1-F：5’-TAAGTTCGTTGGTAGGGAAC-3’

下游引物P-P1-R：5’-CAACCTGAACTTAGTAGCGCAA-3’

针对P1基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：

T-P1：5’-FAM-ATGGGTGATACCGCT-MGB-3’

针对2063(A/G)基因设计的特异性引物的序列如下：

上游引物P-23S-F：5’-ATCCAGGTACGGGTGAAGAC-3’

下游引物P-23S-R：5’-CGCATCAACAAGTCCTAGCGAA-3’

针对2063(A/G)基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：

T-2063(A/G)：5’-FAM-CGGGACGGGAAGAC-MGB-3’

针对2064(A/G)基因的特异性引物与2063(A/G)基因的特异性引物相同，针对2064(A/G)基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：

T-2064(A/G)：5’-FAM-GACGGAGAGACCCC-MGB-3’

int基因设计的特异性引物的序列如下：

上游引物P-int-F：5’-CCACACGACTCTCGGCAAC-3’

下游引物P-int-R：5’-TCGATGGTTCACGGGATTCT-3’

针对int基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：

T-int：5’-VIC-CTCGGCTCTCGCATC-MGB-3’

P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记MGB基团；int基因探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记MGB基团。

实施例二

本发明实施例中又提供了一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的方法，包括：

步骤101、样本核酸制备，以获得核酸模板；

步骤102、分别针对肺炎支原体特异性P1基因、2063(A/G)基因、2064(A/G)基因、内标基因int设计特异性引物和荧光标记探针；

其中，检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；

本发明实施例中的内标基因(internal amplification control，int)，是鉴别仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素或样本中存在抑制物等造成的结果不理想的原因。水稻核糖体DNA内转录间隔区ITS1基因与目的基因同源性极低，可以选取该基因片段作为内标。对P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因序列进行同源性比对，选取保守片段分别设计针对这3个基因的特异性引物和荧光标记探针。

步骤103、取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；

步骤104、配置酶试剂；

其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合组成；

步骤105、将P1基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心混匀；将2063(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将2064(A/G)基因PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；

步骤106、分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液和内标加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增；

其中，反应条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×30s，循环40次；单点荧光检测在60℃，并在此采集荧光信号，所述内标为含有内标int基因片段的质粒；

步骤107、对于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，对于int基因，采用荧光PCR仪上的VIC通道进行扩增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。

其中，检测结果根据C_T值进行判定，仪器FAM通道C_T栏显示Undet.同时VIC通道C_T值≤35，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品在FAM通道、VIC通道C_T值均≤35，检测结果报告为阳性；待检样品FAM通道C_T显示在35～40之间，VIC通道C_T值≤35，需重复测定，FAM通道C_T显示仍在35～40之间，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。

本发明采用Taqman探针实时荧光PCR方法。NCBI blast同源性比对肺炎支原体特异性P1基因、耐药突变位点2063(A/G)、2064(A/G)、内标int基因，选取P1、2063(A/G)、2064(A/G)、int基因保守片段设计引物和荧光标记探针。P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因探针5’端标记FAM荧光素为荧光报告基团(用R表示)，3’端标记MGB基团(用Q表示)；int基因设计的探针5’端标记VIC荧光素为荧光报告基团(用R表示)，3’端标记MGB基团(用Q表示)，Q基团能在近距离吸收R基团发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，探针先与模板结合，随后引物模板结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团吸收，仪器检测不到荧光信号；当反应进行到延伸阶段时，Taq DNA聚合酶5’→3’外切酶将探针降解，探针上的R基团游离出来，Q基团无法吸收R基团发出的的荧光信号，检测器能检测到荧光信号。随着PCR反应的进行，PCR产物的增加与荧光信号的增长呈现对应关系。通过荧光信号增长曲线，实现目的基因的检测。

实施例三

本发明实施例提供了一种实时荧光PCR检测肺炎支原体核酸及耐药突变的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、内标、阴性对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、P1基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2063(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、2064(A/G)基因的上、下游引物及一条荧光标记探针、内标基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成。

其中，检测肺炎支原体特异性P1基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：2～3所示，检测肺炎支原体特异性P1基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；检测耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO：6～7所示，检测耐药突变位点2063(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；检测耐药突变位点2064(A/G)基因的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；检测内标基因int的引物核苷酸序列如SEQIDNO：12～13所示，检测内标基因int的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。

所述核酸抽提液由3％(M/V)Chelex-100、1％(V/V)Tris-HCl，1M，pH9.0组成。

所述第一引物探针混合液、所述第二引物探针混合液和所述第三引物探针混合液分别由2μL 10×PCR Buffer、2μL25mmol/LMgCl₂、3.4μL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.8μL 10μmol/L目的基因引物、0.2μL 10μmol/L目的基因探针、0.4μL 10μmol/L内标基因引物、0.2μL 10μmol/L内标基因探针和5.75μL灭菌纯化水组成。

PCR反应酶系由5U/μL Taq DNA聚合酶和1U/μL UNG酶按体积比3∶2比例混合组成。

PCR扩增的条件为：37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15s，60℃×30s，循环40次；单点荧光检测在60℃，对于P1、2063(A/G)、2064(A/G)基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，对于int基因，采用荧光PCR仪上的VIC通道进行扩增。

所述阳性对照品为含有灭活的E-P1、E-23S(2063A/G)、E-23S(2064A/G)菌的混合液，菌浓度为10⁵CFU/mL；阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度为10⁵CFU/mL，其中，E-P1为含有P1基因片段的工程菌，E-23S(2063A/G)为含有23S(2063A/G)基因片段的工程菌，E-23S(2064A/G)为含有23S(2064A/G)基因片段的工程菌。

本试剂盒具有准确率高，临床试验结果与DNA测序结果总符合率99％以上；特异性强，与咽拭子中常见致病菌肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、衣原体均无交叉反应；灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为10³copies/mL，按照菌培养法确定的最低检测限为10³CFU/mL。本产品用于体外定性检测人咽拭子样本中肺炎支原体特异性P1基因及耐药突变位点2063(A/G)和2064(A/G)基因。为临床确定肺炎支原体感染及其耐药突变提供辅助诊断方法，为临床医生用药提供参考。

实施例四

本实施例结合具体检测案例说明本发明的具体应用方式，首先收集人痰液和咽拭子样，采用发明实施例三中提供的试剂盒进行检测，统计结果符合率。

1、样本核酸制备

(1)痰液：取痰液加入2倍体积的4％NaOH(自备)，摇匀，室温下放置30min液化，12,000rpm 5min。沉淀加无菌生理盐水1mL打匀，12,000rpm 5min；去尽上清，沉淀中直接加入50μL核酸抽提液，充分混匀，98℃ 10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min，取上清2μL做PCR反应。

(2)咽拭子：取1mL样本，12,000rpm 2min；弃去上清，沉淀中直接加入50μL核酸抽提液，充分混匀，98℃ 10min(误差不超过1min)。12,000rpm 5min，取上清2μL做PCR反应。

2、对照品准备

取阳性对照品、阴性对照品各50μL分别置于1.5mL(或0.5mL)离心管中(冻存试剂融化后振荡混匀10sec)，分别加入核酸抽提液50μL充分混匀，98℃ 10min，然后12,000rpm 5min，取上清2μL做PCR反应。

3、酶试剂配制

取n×16μL肺炎支原体P1基因PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×16μL 23S核糖体RNA基因耐药突变(2063A/G)PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒；取n×16μL 23S核糖体RNA基因耐药突变(2064A/G)PCR检测混合液与n×0.2μL酶(水生栖热菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒。

4、加样

分别取上述混合液16μL置于PCR管中，然后将样本、阴性对照品、阳性对照品的处理上清液各2μL分别加入各个已有混合液的PCR管中，同时分别向样本、阴性对照品、阳性对照品PCR管中加入2μL内标，盖好管盖，立即进行荧光PCR扩增反应。

5、PCR扩增

反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：

37℃×2min，94℃×2min，循环1次；93℃×15sec，60℃×30s，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为20μL。

荧光通道检测选择：P1基因、2063(A/G)、2064(A/G)选用FAM通道，内标基因选用VIC通道。

6、结果判定

检测结束后，基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。仪器FAM通道C_T栏显示Undet.同时VIC通道C_T值≤35，表示检测样品低于检测限，报告为阴性；待检样品在FAM通道、VIC通道C_T值均≤35，检测结果报告为阳性；待检样品FAM通道C_T显示在35～40之间，VIC通道C_T值≤35，需重复测定，FAM通道C_T显示仍在35～40之间，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性；若扩增结果为一直线，则判断为阴性。

7、检测结果检验

本发明的检测结果与细菌培养鉴定与药敏试验结果一致，荧光PCR检测结果如图1-3所示，图1为肺炎支原体感染样本的荧光定量PCR曲线图，可见随着PCR反应的进行，P1基因对应的PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系，可判断P1基因为阳性，2063(A/G)基因和2064(A/G)基因为阴性。图2为2063(A/G)突变阳性样本的荧光定量PCR曲线图，可判断P1基因和2063(A/G)基因均为阳性，2064(A/G)基因为阴性。图3为2064(A/G)突变阳性样本的荧光定量PCR曲线图，可判断P1基因和2064(A/G)基因均为阳性，2063(A/G)基因为阴性。

以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。