基于7‑硝基苯呋咱的Pd（0）荧光探针及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种钯离子（Pd（0））检测剂，具体涉及一种基于7-硝基苯呋咱的Pd（0）荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

过渡金属钯在制药和有机合成领域是一种很好的催化剂，可以催化Buchwald-Hartwig偶联反应、Heck反应、Sonogashira反应以及Suzuki-Miyaura反应和Tsuji-Trost反应，在复杂分子的制造合成过程中，起到极其重要的作用。同时，钯在社会生活中也有广泛的应用。比如在汽车尾气催化转化装置中使用钯可以有效地改善尾气污染的问题。但是在广泛使用钯的同时，也不能忽视钯对环境和生物体的潜在危害性。过量的钯会对环境和生物体造成巨大的危害，有可能通过食物链最后富集到食物链的顶端，也就是人和动物的体内，对健康造成很大的潜在危害。因为当这种重金属在人体内不断累积的时候，钯离子能结合含有硫醇的生物分子，如氨基酸，蛋白质(酪蛋白，丝纤蛋白和许多种酶)，DNA和其它的生物大分子(维生素B6)等，进而阻断一系列细胞内的生命过程，对生物体的正常代谢活动造成极大的伤害。正是由于钯的危害性，相关的政府监管部门对有机合成反应中重金属钯的允许残留范围是5-100 ppm，对人可服用的药物产品中钯的允许范围是5-10 ppm。因此，研究一种能够快速准确检测Pd的方法具有十分重要的意义。传统的定量检测钯含量的分析方法有原子吸收光谱法(AAS)，电感耦合等离子体质谱法(ICP^.MS)以及固相微萃取高效液相色谱法(SPME-HPLC)和X射线荧光光谱法等。但是这些分析方法需要精密的仪器，复杂的样品预处理过程，训练有素的操作人员以及严谨的实验条件等，这些缺点使得传统的分析方法检测成本很高，难以普及应用。

荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简便快速、对检测物损伤少等优点已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。荧光探针分子的开发与利用研究是化学与生物、医学、农业等科学的交叉领域。荧光探针技术是在分子水平上对研究对象进行研究的分析方法。荧光探针目前已经被广泛应用于环境和生物体中重金属、生物活性小分子等物质的检测。

目前国内外尚无关于基于7-硝基苯呋咱衍生物的Pd（0）的荧光探针的制备方法的文献和专利报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提出一种基于7-硝基苯呋咱的Pd（0）荧光探针及其制备方法与应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种基于7-硝基苯呋咱的Pd（0）荧光探针，所述Pd（0）荧光探针的分子结构式如下：

所述Pd（0）荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）中间体4-氨基-7-硝基-1,2,3-苯并呋咱的合成：避光条件下，将氨水溶液逐滴滴加到含有4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液中，所述4-氯-7-硝基苯呋咱的甲醇溶液的浓度是40-70%，室温下搅拌反应20-30小时，减压蒸馏得到固体，所述固体用乙酸乙酯溶解，以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄褐色固体，所述黄褐色固体为中间体4-氨基-7-硝基-1,2,3-苯并呋咱；

（2）避光条件下，将中间体4-氨基-7-硝基-1,2,3-苯并呋咱与三乙胺加入到二氯甲烷溶剂中，得到混合溶液；冰水浴条件下，向混合液中加入氯甲酸烯丙酯的二氯甲烷溶液反应4-10小时，反应液用饱和氯化钠溶液洗涤，萃取、静置分层，有机层用无水硫酸钠干燥、过滤，减压蒸馏去除二氯甲烷，得到固体粗产品，以乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，固体粗产品经硅胶柱层析分离得到黄色固体，所述黄色固体为Pd（0）荧光探针。

具体合成路线如下：

所述步骤（1）中，4-氯-7-硝基苯呋咱与氨水溶液的物质的量之比为1：15-30。

所述步骤（1）中洗脱剂乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：1-10。

所述步骤（1）和（2）中避光条件为用锡箔纸包裹反应容器。

所述步骤（2）中，中间体4-氨基-7-硝基-1,2,3-苯并呋咱与三乙胺的物质的量之比为1：1.5-5，所用二氯甲烷经无水处理，所述冰水浴反应温度为0℃。

所述二氯甲烷无水处理的方法为：向二氯甲烷中加入氢化钙回流2-4小时后蒸馏，即得无水的二氯甲烷。

所述步骤（2）中洗脱剂乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：2-10。

本发明制备的Pd（0）荧光探针可用于检测Pd（0）。

本发明提出的基于7-硝基苯呋咱的Pd（0）荧光探针的制备方法，首先由商品化的4-氯-7-硝基苯呋咱（NBD-Cl）与氨水进行反应，得到一种4-氨基-7-硝基-1,2,3-苯并呋咱（NBD-NH₂）衍生物；该NBD-NH₂衍生物与氯甲酸烯丙酯进行酰胺化反应得到一种含有7-硝基苯呋咱的化合物，该化合物在CH₃CH₂OH/PBS (10 mM, pH = 7.4, 6:4, v/v)溶液体系中可以用做Pd（0）的高选择性荧光探针。

本发明中制备的Pd（0）荧光探针过程中所使用的化学试剂、溶剂、金属离子等均购自阿拉丁试剂公司。在Pd（0）荧光探针的结构确证过程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振谱仪，溶剂为氘代氯仿，以TMS为内标记录核磁共振氢谱和碳谱；采用Thermo公司的Q-Exactive HR-MS质谱仪记录高分辨质谱数据；采用日本日立公司F-7000荧光光谱仪记录荧光光谱。

本发明的有益效果是：

（1）本发明为一种基于7-硝基苯呋咱的Pd（0）荧光探针的制备方法，其对Pd（0）具有高效专一的选择性，能够克服体系中常见金属阳离子(K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Fe³⁺, Cr³⁺, Ag⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺)和阴离子(NO₃^-, NO₂^-, F^-, Cl^-, Br^-, I^-, H₂PO₄^-, HPO₄^2-, PO₄^3-, HSO₄^-, S₂O₃^2-, HSO₄^-, SO₄^2-, HCO₃^-, CO₃^2-和S^2-)的干扰，适用pH范围广（4-8），是一种高效的Pd（0）荧光探针；

（2）该Pd（0）荧光探针对Pd（0）的最低检测限为15 nM；（3）本发明具有合成工艺简单、成本低廉、操作简便、选择性好、灵敏度高、检测限低、应用前景广泛等优点；

（3）Pd（0）荧光探针在CH₃CH₂OH/PBS (10 mM, pH = 7.4, 6:4, v/v)体系中对Pd（0）具有高效灵敏的专一检测能力。通过紫外-可见分光光度计、荧光光谱仪等分析仪器研究结果，推测出Pd（0）荧光探针识别Pd（0）的可能机理如图11所示：探针溶液中加入Pd（0），Pd（0）与探针发生Tsuji-Trost反应，脱去二氧化碳，并生成具有较强荧光的最终产物NBD-NH₂。通过HR-MS对产物NBD-NH₂的结构进行了确证（图12）。实验结果表明，NBD-NH₂负离子模式下理论计算值为179.0198，HR-MS负离子模式结果显示为179.0205，该数据确证了附图11所示作用机理。

附图说明

图1为实施例1制备的荧光探针的氢谱图，所用氘带试剂为氘带氯仿；

图2为实施例1制备的荧光探针的碳谱图，所用氘带试剂为氘带氯仿；

图3为实施例1制备的荧光探针的高分辨质谱，所用溶剂为色谱甲醇；

图4为实施例1制备的荧光探针紫外选择性图；

图5为实施例1制备的荧光探针荧光选择性图，激发波长465 nm；

图6为实施例1制备的荧光探针识别Pd（0）的抗金属阳离子干扰性图，激发波长465 nm，发射波长549 nm；

图7为实施例1制备的荧光探针识别Pd（0）的抗常见阴离子干扰性图，激发波长465 nm，发射波长549 nm；

图8为实施例1制备的荧光探针荧光滴定图，激发波长465 nm；

图9为实施例1制备的荧光探针识别Pd（0）的最低检测限图，激发波长465 nm，发射波长549 nm；

图10为实施例1制备的荧光探针识别Pd（0）的pH试用范围图，激发波长465 nm，发射波长549 nm；

图11为实施例1制备的荧光探针识别Pd（0）的识别机理推测图；

图12为实施例1制备的荧光探针识别Pd（0）的识别机理验证高分辨质谱图。

具体实施方式

下面将用具体的实施例来说明本发明中基于7-硝基苯呋咱的Pd（0）荧光探针及制备方法与应用，但并不因此而限制本发明。

实施例1

（1）中间体4-氨基-7-硝基-1,2,3-苯并呋咱（NBD-NH₂）的制备

用锡箔纸包裹100 mL单口圆底烧瓶，将氨水（1 mL, 20 mmol）溶液逐滴滴加到含有1mmol 4-氯-7-硝基苯呋咱（NBD-Cl）的甲醇溶液中，4-氯-7-硝基苯呋咱（NBD-Cl）的甲醇溶液的浓度为40%，室温搅拌20小时后，充分反应后，减压蒸馏得到固体，固体用8 mL乙酸乙酯溶解，用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂（体积比为1:1），经硅胶柱层析分离得到108 mg黄褐色固体，即为中间体NBD-NH₂的产品，产率60%。

（2）Pd（0）荧光探针的制备

避光条件下，将中间体NBD-NH₂ (180 mg, 1 mmol)与三乙胺 (270 μL, 2 mmol)混合于10 mL二氯甲烷溶液中，冰水浴条件下滴加入氯甲酸烯丙酯 (65 μL, 1.08 mmol)的二氯甲烷(10 mL)溶液，冰水浴条件下反应完全后(8小时)，反应液用饱和氯化钠溶液(15 mL)洗涤3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤出去二氯甲烷，减压蒸馏得到固体粗产品，用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂（体积比为1:5），固体粗产品经硅胶柱层析分离得到118.8 mg黄色固体，即为Pd（0）荧光探针，产率为45%。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, ppm) δ: 4.81 (d, 2 H, J = 8 Hz), 5.44 (q, 1 H, J = 4 Hz), 5.46 (q, 1 H, J = 4 Hz), 6.0 (m, 1 H), 8.17 (t, 2 H, J = 4 Hz), 8.59 (d, 1 H, J = 8 Hz); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, ppm) δ: 67.53, 111.10, 119.88, 130.40, 131.00, 133.92, 134.27, 143.02, 144.78, 151.77; HR-MS m/z: Calcd for C₁₀H₈N₄O₅^- ([M-H⁺]^-) 263.0416, found [M-H⁺]⁺263.0416。（以上图谱见附图1-3）

步骤（2）中二氯甲烷经无水处理，所述无水处理的方法为：向二氯甲烷中加入氢化钙回流2-4小时后蒸馏，即得无水的二氯甲烷。

实施例2

Pd（0）荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）中间体4-氨基-7-硝基-1,2,3-苯并呋咱（NBD-NH₂）的制备

用锡箔纸包裹100 mL单口圆底烧瓶，将15 mmol氨水溶液逐滴滴加到含有1 mmol 4-氯-7-硝基苯呋咱（NBD-Cl）的甲醇溶液中，NBD-Cl的甲醇溶液的浓度为60%，室温搅拌25小时后，充分反应后，减压除去溶剂，固体用6 mL乙酸乙酯溶解，用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂（体积比为1:5），经硅胶柱层析分离得到100 mg黄褐色固体，即为中间体NBD-NH₂的产品，产率50%。

（2）Pd（0）荧光探针的制备

避光条件下，将1 mmol中间体NBD-NH₂与1.5mmol三乙胺混合于10 mL二氯甲烷溶液中，冰水浴条件下滴加入氯甲酸烯丙酯 (65 μL, 1.08 mmol)的二氯甲烷(10 mL)溶液，冰水浴条件下反应4小时，反应液用饱和氯化钠溶液(15 mL)洗涤3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤除去二氯甲烷，减压蒸馏得到固体粗产品，用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂（体积比为1:2），得到固体粗产品经硅胶柱层析分离得到110 mg黄色固体，即为Pd（0）荧光探针，产率为30%。

步骤（2）中二氯甲烷经无水处理，无水处理的方法同实施例1。

实施例3

Pd（0）荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）中间体4-氨基-7-硝基-1,2,3-苯并呋咱（NBD-NH₂）的制备

用锡箔纸包裹100 mL单口圆底烧瓶，将30 mmol氨水溶液逐滴滴加到含有1 mmol 4-氯-7-硝基苯呋咱（NBD-Cl）的甲醇溶液中，4-氯-7-硝基苯呋咱（NBD-Cl）的甲醇溶液的浓度为70%，室温搅拌30小时后，充分反应后，减压除去溶剂，固体用10 mL乙酸乙酯溶解，用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂（体积比为1:10），经硅胶柱层析分离得到120 mg黄褐色固体，即为中间体NBD-NH₂的产品，产率80%。

（2）探针的制备

避光条件下，将1 mmol中间体NBD-NH₂与5 mmol三乙胺混合于10 mL二氯甲烷溶液中，冰水浴条件下滴加入氯甲酸烯丙酯(65 μL, 1.08 mmol)的二氯甲烷(10 mL)溶液，冰水浴条件下反应10小时，反应液用饱和氯化钠溶液(15 mL)洗涤3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤除去二氯甲烷，减压蒸馏得到固体粗产品，用乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂（体积比为1:10），得到固体粗产品经硅胶柱层析分离得到125 mg黄色固体，即为Pd（0）荧光探针，产率为50%。

步骤（2）中二氯甲烷经无水处理，无水处理的方法同实施例1。

对实施例1制备的Pd（0）荧光探针的性能进行检测，具体步骤如下：

（1）荧光探针与Pd（0）作用的溶液配制：

金属无机盐：硝酸铅，硝酸银，硝酸镉，其他均为氯化物(K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Hg²⁺)且厂家均为阿拉丁试剂公司。准确称量相应金属盐，溶解在高纯水中配制10 mM的溶液备用。Pd（0）使用Pd(PPh₃)₄代替，溶解在DMSO中配制成10 mM的溶液备用。

1 mM的探针溶液配制：准确称量实施例1制备的Pd（0）荧光探针，溶解在DMSO中配制1 mM的溶液备用。

（2）紫外选择性实验：

专一的选择性是衡量荧光探针分子是否高效的重要标准。首先，用紫外光谱仪考察了其金属离子选择性。如附图4所示，单独的Pd（0）荧光探针分子(10 µM)在CH₃CH₂OH/PBS (10 mM, pH = 7.4, 6:4, v/v)溶液中在450 nm附近紫外吸收强度比较低，当加入10当量的各种常见金属离子(K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Fe³⁺, Cr³⁺, Ag⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺)后，其紫外吸收强度基本没有变化。只有加入5当量的Pd（0）的加入使其在450 nm处的紫外吸收明显增强，其他金属离子加入后效果跟单独探针分子紫外吸收一致，表明其对Pd（0）具备较好的专一识别能力。

（3）荧光选择性实验：

紫外选择性实验表明其对Pd（0）具备较好的专一选择性，在此使用荧光光谱仪对其荧光选择性进行了测试。如附图5所示，单独的Pd（0）荧光探针 (10 µM)在CH₃CH₂OH/PBS (10 mM, pH = 7.4, 6:4, v/v)溶液中具有微弱的荧光发射强度，当加入Pd（0）(5当量)后其荧光发射强度明显增强，但是加入其它金属离子(10当量)时，其溶液体系荧光强度没有明显变化。以上实验结果表明，该探针对Pd（0）具有较好的专一选择性。

（4）荧光干扰性实验：

为了测试探针分子对Pd（0）检测的抗干扰能力，在荧光发射光谱中分别测试了其金属阳离子干扰性和阴离子干扰性。如图6所示，Pd（0）荧光探针 (10 µM)在CH₃CH₂OH/PBS (10 mM, pH = 7.4, 6:4, v/v)溶液中分别加入测试的各种金属阳离子(100 µM)测试其荧光发射强度（549 nm），然后再向含有各种金属离子的溶液中加入50 µM的Pd（0）溶液，由附图6可知，在其他金属阳离子存在时加入零价钯与单独加入零价钯时所得到的荧光强度(549 nm)基本相同，该结果表明Pd（0）荧光探针探针对Pd（0）的检测具有较强的抗金属阳离子干扰能力。按照类似的方法，测试了其对常见阴离子(NO₃^-, NO₂^-, F^-, Cl^-, Br^-, I^-, H₂PO₄^-, HPO₄^2-, PO₄^3-, HSO₄^-, S₂O₃^2-, HSO₄^-, SO₄^2-, HCO₃^-, CO₃^2-和S^2-)的抗干扰能力，如附图7所示，Pd（0）荧光探针对零价钯的检测具有较强的抗阴离子干扰能力。

（5）探针对Pd（0）识别最低检测限的测定：

良好的检测限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。采用荧光光谱仪来测定其对Pd（0）检测限，在CH₃CH₂OH/PBS (10 mM, pH = 7.4, 6:4, v/v)溶液中，固定Pd（0）荧光探针浓度为10 µM，测定其对不同浓度的Pd（0）的响应强度，随着Pd（0）浓度的增加，体系荧光强度不断增强（见附图8），研究发现溶液荧光强度值在Pd（0）浓度为0.1-1 µM间呈良好的线性（R² = 0.981，见附图9），经计算(3σ/k)得出该Pd（0）荧光探针对Pd（0）的检测限为15 nM，该检测限表明Pd（0）荧光探针对Pd（0）的检测非常灵敏，满足了国家标准对药品中重金属钯的限量要求。

（6）探针对Pd（0）识别应用pH值范围的测定：

在探针的实际应用中，具备在较广泛的pH值范围内识别金属离子能力的探针是非常重要的。为了探索不同pH值对Pd（0）荧光探针识别Pd（0）的影响，我们在PBS（10 mM）酸碱体系中进行了滴定实验。如图10所示，单独的Pd（0）荧光探针(10 µM)在pH为4-8之间荧光发射强度比较低，表明探针分子主要对体系酸碱度的变化不是很敏感，但是当往上述体系加入5当量的Pd（0）溶液后，溶液体系荧光强度具有较大的增强(pH=4-8)。该实验结果表明，探针Pd（0）可以在较广泛的pH(4-8)间识别Pd（0）。该实验结果表明Pd（0）荧光探针具备在生理条件下识别Pd（0）的潜力。

（7）探针对Pd（0）识别机理的测定：

通过紫外-可见分光光度计、荧光光谱仪等分析仪器研究结果，推测出Pd（0）荧光探针识别Pd（0）的识别机理如附图11所示：探针溶液中加入Pd（0），Pd（0）与探针发生Tsuji-Trost反应，脱去二氧化碳，并生成具有较强荧光的最终产物NBD-NH₂。通过HR-MS对产物NBD-NH₂的结构进行了确证（图12）。实验结果表明，NBD-NH₂负离子模式下理论计算值为179.0198，HR-MS负离子模式结果显示为179.0205。该数据确证了附图11所示作用机理。