一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学和基因诊断学领域，具体涉及血清let-7c及miR-182对乳腺癌发生或转移诊断的应用。

背景技术：

乳腺癌是最常见的家族性肿瘤，是导致世界各地的妇女较高死亡率的原因之一。在中国，死于乳腺癌的患者逐年增加。乳腺癌通常起源于乳导管或小叶乳腺组织，占所有女性癌症(不包括非黑色素瘤皮肤癌)的22.9％。然而，约50％-80％的乳腺癌患者发病的危险因素不明确，因此寻找有效的乳腺癌发病的危险因素或诊断标记物，将有利于乳腺癌诊断和治疗。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子RNA，长度约为22bp核苷酸的非编码RNA。miRNA通过在转录后水平调控基因的表达，参与不同的细胞过程，包括细胞凋亡、造血细胞的分化、物质代谢、神经系统的发育和细胞迁移等过程。许多miRNA参与了人类许多肿瘤的发生发展过程。到目前为止，有许多研究报道了miRNA在乳腺癌细胞株和原发乳腺癌组织的表达情况。例如在乳腺癌细胞中高度表达miR-191/425基因簇，能改变乳腺癌细胞的基因表达谱，参与乳腺癌的侵袭浸润，影响乳腺癌的进展。通过分析的乳腺癌组织miR-21的表达，高度表达miR-21的患者预后存活率明显低于低表达miR-21的乳腺癌患者，表明miR-21参与了乳腺癌的发病进展过程；过表达miR-21还可以增强乳腺癌细胞MCF-7细胞生长、迁移和侵袭能力，增加自我更新和克隆形成能力。过表达miR-200a可阻止乳腺癌细胞发生凋亡，并促进肿瘤细胞转移，同时抑制miR-200a表达可诱发乳腺癌细胞发生凋亡。降低miR-200f的表达会增加EMT相关因子的表达，miR-200f可作为乳腺癌EMT过程的生物标志物。作为一种肿瘤抑制基因，LET-7通过调节雌激素受体(ER)α介导的信号，能抑制ER阳性的乳腺癌干细胞的生长和增殖。这些研究表明，miRNA参与了乳腺癌的发生、迁移和浸润等过程。

凋亡和坏死的原发肿瘤可以将其内部的miRNAs排入到血液循环，这类miRNA称为循环miRNA。因此，血液中的miRNA来自许多组织的细胞(包括肿瘤细胞)，这使我们可以分析血液中的miRNA，分析不同器官、组织或细胞的特征。此外，循环的miRNA还具有抗RNase活性，因此在血清和血浆中非常稳定。由于循环miRNA在个人血清中稳定，使得血清miRNA作为有吸引力的生物标志物，其血清水平可用来帮助诊断乳腺癌。至目前为止，有关循环miRNA在乳腺癌患者外周血的表达研究报道不多。为了寻找乳腺癌患者血清miRNA的生物标志物，我们探讨了血清miR-182水平在乳腺癌患者诊断中的价值。

在本发明之前，miRNA与人类乳腺癌之间的关系已被广泛研究。miRNA的表达变化参与乳腺癌的发生和进展过程。已研究部分miRNA在乳腺癌患者与健康对照血清或血浆的表达，提示其在乳腺癌诊断中的价值。但检测miRNA的方法复杂，研究所需要的试剂盒昂贵。本发明旨在创立一种新的血清miRNA诊断方法，设计特异性诊断miR-182、let-7c的诊断试剂，证明它们在乳腺癌诊断中的价值，为肿瘤的诊断提供新的思路。

技术实现要素：

本发明提供了一种miR-182、let-7c在制备乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒中的应用，还提供一种乳腺癌发生或转移试剂盒，试剂盒含有miR-182的定量RT-PCR引物，所述引物分别为：

上游引物序列：GGCAATGGTAGAACTCACAC；下游引物序列：

ACATGTACAGTCCATGGATG。试剂盒含有let-7c的定量RT-PCR引物，所述引物分别为：上游引物序列：GTTGAGGTAGTAGGTTGTATGG；下游引物序列：AACATGTACAGTCCATGGATG。本发明提供的试剂盒通过检测miR-182、let-7c的表达，可以对乳腺癌进行早期诊断，为肿瘤的诊断提供新的思路。本发明还提供一种了新的血清微RNA提取方法。

本发明公开一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒，试剂盒含有miR-182、let-7c的特异性诊断试剂。

所述试剂盒含有miR-182的定量RT-PCR引物，引物分别为：

上游引物序列：GGCAATGGTAGAACTCACAC

下游引物序列：ACATGTACAGTCCATGGATG

所述试剂盒含有let-7c的定量RT-PCR引物，所述引物分别为：

上游引物序列：GTTGAGGTAGTAGGTTGTATGG

下游引物序列：AACATGTACAGTCCATGGATG

在试剂盒中进行定量RT-PCR检测血清miR-182、let-7c的表达。

所述定量RT-PCR检测血清miR-182、let-7c的表达时加入血清微RNA。

所述血清微RNA由以下步骤提取并检测：

⑴血清的常规制备

将乳腺癌患者血液及对照血液盛于离心管，静置于37℃环境中凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心，得到的上清液即为血清，吸上清，分装备用；

⑵血清微RNA的提取

取450-550μL血清于1.5mL EP管中，加入等体积苯酚混匀2min，迅速于冰上静置2min，13000rpm离心3min。收集上清液至新EP管，加入与上清等体积的苯酚，重复该操作二次。收集上清液于新EP管，加入与上清等体积的氯仿异戊醇(24：1)，震荡混匀2min，迅速于冰上静置1min，离心13000rpm，3min，重复该操作一次。吸上清层至新的EP管中，加入1/10体积3mol/L，pH＝5.2乙酸钠、等体积100％冰乙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min以上，将该混合液13000rpm，离心3min，去上清，加入750μL的0.1％的DEPC。将上述混合液13000rpm，离心3min，去上清，适度干燥沉淀，用15μL的0.1％的DEPC溶解RNA沉淀，获得RNA样品；

⑶血清微RNA的检测

取2μL上述RNA样品，加98μL超纯水稀释至100μL，混匀。用超纯水调零，稀释过的RNA移入比色杯，在紫外分光光度计测量，根据OD260/OD280比值判断RNA质量，计算RNA浓度。取2μLRNA样品，加入1μL 6×loading buffer混匀，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，80v电泳10min。

所述试剂盒还包括定量RT-PCR反应常用的酶和试剂。

附图说明

图1：血清微RNA电泳图；

图2：乳腺癌患者及对照血清miR-182的表达检测；

图3：ROC曲线图。

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步具体说明。

具体实施方式

以下以血清miR-182检测为例，证明了其在乳腺癌诊断中的价值，为本发明作进一步的阐述。这些实例是针对于本发明所作的说明，而不是对本发明的限制。

本发明中，以上所述和以下的实施例中，所使用的技术，包括血清制备、微RNA的提取、PCR扩增与检测等分子生物学技术，以及统计分析等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、软件等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1血清的常规制备

获得患者及对照的非抗凝血液2mL，盛于离心管或可以离心的器皿中，静置或置37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心(一般为3000rpm，离心5-10min)，得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出(注意切勿吸出细胞成分)，分装备用。

实施例2血清微RNA的提取与检测

1、取450-550uL血清于1.5mL EP管中，加入等体积试剂A混匀2min，迅速于冰上静置2min，离心13000rpm，3min。

2、收集上清液至新EP管，加入与上清等体积试剂A，重复步骤1二次。

3、收集上清液于新EP管，加入与上清等体积试剂B，震荡混匀2min，迅速于冰上静置1min，离心13000rpm，3min，重复步骤2一次。

4、吸上清层至新的EP管中，加入1/10体积试剂C、等体积试剂D，颠倒混匀，-20℃放置20min以上。

5、离心13000rpm，3min，去上清，加入750μL的试剂E。

6、离心13000rpm，3min，去上清，适度干燥沉淀。

7、用15μL的试剂F溶解RNA沉淀。

8、提取RNA质量检测：取2μL RNA样品，加98μL超纯水稀释至100μL，混匀。调零用超纯水(空白组)，稀释过的RNA移入比色杯，在紫外分光光度计UD-640测量，根据OD260/OD280比值判断RNA质量(应在2.0左右)，计算RNA浓度。取RNA样品2μL，加入1μL 6×loading buffer混匀，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳80v、10min，发现提取的RNA主要为微RNA(见图1)。

试剂A：苯酚

试剂B：氯仿异戊醇(24：1)

试剂C：3mol/L，pH＝5.2乙酸钠

试剂D：100％冰乙醇

试剂E：75％冰乙醇

试剂F：0.1％的DEPC(体积/体积)

实施例3定量RT-PCR检测血清miR-182、let-7c的表达

1、miRNAs的加尾反应,用Poly A Ploymerase(Ambion公司)加尾,具体反应体系如下(25μL)：

37℃，1h；65℃，10min。产物于-20℃保存。

2、逆转录反应(reverse transcription，RT),具体反应体系如下:

70℃，5min；冰上2min，之后迅速加入。

5×RT buffer： 4.0μL

dNTPmix： 4.0μL

Reverse Transcriptase： 0.9μL

(Promega公司)

42℃反应1h，合成的cDNA与-20℃保存。

3、PCR反应：标准品5SrRNA为本研究室储存，将标准品用灭菌水做10倍梯度稀释，4个梯度，浓度分别为1×109copies/μL、1×108copies/μL、1×107copies/μL、1×105copies/μL，用5S rRNA作为内参。定量PCR的引物序列如下见表1：

PCR反应体系(Takara公司)如下(20μL)：

反应条件：95℃变性5min；95℃变性20s；52℃，20s，72℃，30s。重复40个循环，于72℃检测荧光，5S rRNA作为内参。70℃至95℃绘制溶解曲线。

实施例4 miR-182在乳腺癌诊断中的价值

1、研究对象的基本情况

研究对象来自于山东省烟台莱阳中心医院，共有确诊新发乳腺癌患者46例及相应的对照人群58例，所有患者均经病理诊断确诊。乳腺癌患者和对照组的基本情况和临床特征见表2。病例组与对照组在年龄、身高和体重方面，经统计学检验无统计学意义，两组无明显差异，均衡可比性较好。

2、血清miR-182的表达

我们通过实时定量PCR检测血清中miR-182水平，研究miR-182在乳腺癌中的诊断作用。结果发现，在乳腺癌患者血清中的miR-182的水平分别为7.07×103拷贝/ml(n＝46)，显着高于健康对照者的血清miR-182水平(0.003×103拷贝/ml，P<0.01，n＝58，见图2)。研究结果表明，血清中乳腺癌患者miR-182的含量较高，表明miR-182在乳腺癌的发病机制中发挥重要作用。

为探讨miR-182在乳腺癌患者诊断中的价值，我们用ROC曲线确定miR-182在区分肺癌患者与健康对照的诊断界值为0.712×103copies/ml，灵敏度达到95.7％，特异度达到75.9％，曲线下面积AUC＝0.810，95％可信区间为：0.717-0.903(P<0.001)(图3)。

实施例5 Let-7c在乳腺癌诊断中的价值

Let-7c其在乳腺癌诊断中的价值研究方法见实例1，2，3。具体检测引物见，发现乳腺癌患者血清let-7c水平显著低与对照组血清水平，证明它在乳腺癌诊断中的价值。

表1专利自主设计的用于检测的引物表

表2本研究检测乳腺癌患者和对照的基本临床信息

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。