本发明涉及一种对虾白斑病毒LAMP引物、本发明还涉及一种包括上述引物的试剂盒；本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测对虾白斑病毒的方法。
背景技术：
对虾白斑综合症病毒White spot syndrome virus，WSSV对全世界的水生甲壳动物养殖业造成严重危害，为已知基因组最大的动物病毒，自20世纪90年代初首先在我国台湾地区发生以来，至今已经给世界各国的对虾养殖造成了巨大的经济损失，2009年被农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》列为水生生物一类动物疫病病毒，自1993年以来，国内外对白斑综合症病毒基因组进行了大量研究。而且白斑综合症病毒感染的宿主范围很广，它不仅侵染各种野生及养殖对虾，而且侵染其他水生甲壳类如蟹类、螯虾和龙虾等，已成为对水生甲壳类危害最大、传染最广泛的病毒，特别是对对虾种群影响最严重，至今已报道有40多种节肢动物可感染或携带白斑综合症病毒，常导致中国对虾、日本对虾、印度对虾、南美白对虾、蓝对虾、褐对虾、桃红对虾、斑节对虾、长毛对虾、墨吉对虾等感染发病好大规模死亡，许多蟹类对它也十分敏感。
白斑综合症病毒是一种无包涵体、具囊膜、一端有尾巴状结构、杆状的双链环状DNA病毒，其基因组大小为300kb，含有184个开放阅读框，但只有6％的阅读框与数据库中的序列有一定的同源性。
对虾白斑综合症病毒，由于目前国内外对该病毒还不能进行细胞培养，在免疫学检测方面还难以取得进展，而且该病毒在对虾体内含量低，所以必须研究高灵敏度的检测方法。PCR检测技术具有快速、灵敏、特异性强的特点，已被广泛应用于动植物和人类等病原物的检测。近年来国内外有许多学者已经有应用分子生物学技术成功检测WSSV的报道。荧光定量PCR技术是在普通PCR技术的基础上增加了可供仪器自动检测的荧光基团标记的探针，具有比普通PCR技术更为灵敏和快速及防污染的特点。但是需要昂贵的设备和仪器，且需要经过专业训练的技术人员，这个问题一直困扰着一线的检测技术人员。由于WSSV病毒在对虾体内含量非常的低，特别是在侵染初期浓度更低，但是即使对虾将及为微量的病毒带入虾池，由于WSSV具有水平传播的特点，在合适的环境条件下，该病毒也会很快的繁殖且传播开来，给对虾养殖造成毁灭性的损失，目前对该病毒仍无有效的防治措施，因此还必须不断研究更为灵敏的检测方法，才能将该病毒传播的可能性降到最低限。而且对于像WSSV这个病毒，由于其带毒率非常低，故需要灵敏度非常高的检测方法才能将潜在的WSSV检测出来，以上三种方法灵敏度都难以达到，这样必将存在漏检的可能，所以急需研究新的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种对虾白斑病毒LAMP引物；
本发明的另一个目的是提供一种包含上述引物的试剂盒；
本发明的另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测对虾白斑病毒的方法，该检测方法具有：引物特异性强，设备简单，快速、检测灵敏度高、闭管检测、操作简单、结果直接可以判读等特点。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种对虾白斑病毒LAMP引物，其特征在于包括：
正向外引物F3：5’GTTGAAGAAATGAGACCGG3’；
反向外引物B3：5’GGTTTGTAGGCTAATGTCCAT3’；
正向内引物FIP：
5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT-TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT3’；
F2：5’TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
反向内引物BIP：
5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC-GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC3’；
B2:5’GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’。
本发明一种对虾白斑病毒LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5’GTTGAAGAAATGAGACCGG3’；
反向外引物B3：5’GGTTTGTAGGCTAATGTCCAT3’；
正向内引物FIP：
5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT-TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT3’；
F2：5’TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
反向内引物BIP：
5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC-GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC3’；
B2:5’GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中该试剂盒的产品规格：40次。
本发明一种对虾白斑病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、建立LAMP反应体系：
按检测所需的反应量从权利要求2所述的试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有WSSV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60-65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
如上所述的对虾白斑病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤A中所述提取样品RNA，具体按以下步骤提取：
a1、取0.1g的WSSV和IHHNV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为BPMV和SMV的RNA。
如上所述的对虾白斑病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤E中紫外线照射装置的紫外线范围：波长240－260nm或350-370nm。
如上所述的对虾白斑病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物中外引物与内引物的比例为l:2-1:10。
如上所述的对虾白斑病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
如上所述的对虾白斑病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤D中扩增温度优选为63℃。
综上所述，本发明相对于现有技术其有益效果是：
本文采用磁珠法提取WSSV的DNA并根据WSSV主要株系的外壳蛋白编码基因设计了检测WSSV外壳蛋白大亚基的LAMP扩增的通用型引物，且建立了WSSV LAMP检测的体系，通过本体系可以在一个小时内高灵敏度的检测出WSSV病毒的存在，检测灵敏度达到10fg，比普通PCR要高出一千倍，且具有较好的特异性。另外本方法不要昂贵的仪器和设备，只需要一个保温箱即可，操作简单，检测结果可以直接通过颜色的反应来判读，非常适合基层一线的使用，在种苗、花卉等繁殖材料病毒检测方面具有广阔的应用前景和非常好的实用价值。
本发明引物特异性较好，灵敏度高；本发明检测方法耗时短。需要昂贵的检测仪器，检测成本低。操作简便
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述：
本发明以下实施例中所采用材料：
1.材料
1.1对虾白斑病毒(WSSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)购自美国AGDIA公司。
1.2主要试剂和耗材
(1)RNA扩增反应试剂盒Loopamp RNA Amplification kit；
(2)荧光目视检测试剂盒；
(3)Fluorescence Detection Reagent；
(4)反应试管等均购置于北京蓝谱生物科技有限公司；
1.3主要仪器设备
(1)－80℃冷冻冰箱；
(2)Labofuge400R高速冷冻台式离心机；
(3)微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，2.5μL，；
(4)超纯水系统，Milli－Q Academic，Millipore公司；
(5)超净工作台；
(6)漩涡混合器；
(7)LAMP实时浊度仪，LA－320C，日本荣研生物公司。
实施例1
本发明一种对虾白斑病毒LAMP引物，包括：
正向外引物F3：5’GTTGAAGAAATGAGACCGG3’；
反向外引物B3：5’GGTTTGTAGGCTAATGTCCAT3’；
正向内引物FIP：
5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT-TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT3’；
F2：5’TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
反向内引物BIP：
5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC-GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC3’；
B2:5’GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’。
实施例2
本发明一种对虾白斑病毒LAMP试剂盒，该试剂盒包括有：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5’GTTGAAGAAATGAGACCGG3’；
反向外引物B3：5’GGTTTGTAGGCTAATGTCCAT3’；
正向内引物FIP：
5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT-TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT3’；
F2：5’TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
反向内引物BIP：
5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC-GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC3’；
B2:5’GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中该试剂盒的产品规格：40次。
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
实施例3
本发明一种对虾白斑病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；其中所述样品为干虾仁；
B、建立LAMP反应体系：
按检测所需的反应量试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有WSSV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60-65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
实施例4
本发明一种对虾白斑病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；其中所述样品为干虾仁；
a1、取0.1g的WSSV和IHHNV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为BPMV和SMV的RNA；
B、建立LAMP反应体系：
取-20℃下保存的试剂盒中国各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
按检测所需的反应量试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’GTTGAAGAAATGAGACCGG3’；
反向外引物B3：5’GGTTTGTAGGCTAATGTCCAT3’；
正向内引物FIP：
5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT-TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT3’；
F2：5’TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
反向内引物BIP：
5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC-GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC3’；
B2:5’GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有WSSV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，波长240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
实施例5
本发明一种对虾白斑病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；其中所述样品为干虾仁；
a1、取0.1g的WSSV和IHHNV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为BPMV和SMV的RNA；
B、建立LAMP反应体系：
取-20℃下保存的试剂盒中国各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
按检测所需的反应量试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’GTTGAAGAAATGAGACCGG3’；
反向外引物B3：5’GGTTTGTAGGCTAATGTCCAT3’；
正向内引物FIP：
5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT-TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT3’；
F2：5’TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
反向内引物BIP：
5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC-GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC3’；
B2:5’GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有WSSV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，波长240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
实施例6
本发明一种对虾白斑病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；其中所述样品为干虾仁；
a1、取0.1g的WSSV和IHHNV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；
a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；
a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；
a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；
a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为BPMV和SMV的RNA；
B、建立LAMP反应体系：
取-20℃下保存的试剂盒中国各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；
按检测所需的反应量试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’GTTGAAGAAATGAGACCGG3’；
反向外引物B3：5’GGTTTGTAGGCTAATGTCCAT3’；
正向内引物FIP：
5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT-TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：
F1c：5’AACACCACTAGTGTCTACCTCTCTT3’；
F2：5’TCAATGAAGCATCCGAAAC3’；
反向内引物BIP：
5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC-GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’TTGCTCCTGCAATAGCTGGC3’；
B2:5’GCCTCTTTTCATATTCTTTCCTT3’；
C、加样：
在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有WSSV DNA的阳性对照，
D、扩增：
将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；
E、检测：
使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，波长240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。