吡啶腙二硫代甲酸衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及制药技术，具体涉及吡啶腙二硫代甲酸衍生物及其制备方法和应用。

背景技术：

癌症是严重影响人类生活质量和生存的重大疾病之一，对其浸润转移其他组织与器官人类尚无可行方法加以阻止。当前癌症治疗的主要手段有：手术治疗、放疗、化疗、生物治疗和中医药治疗。由于缺乏诊断技术，是否浸润转移无法确认，所以利用化学治疗(化疗)仍是临床上杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长繁殖的主要手段。然而，化疗药物自身的毒副作用以及产生的耐药性限制它们的广泛应用。多药联合疗法虽然有助于减少药抗，但无法消除化疗的脱发、呕吐、白细胞减少等毒副作用。开发新型、高效、毒副作用小、选择性高的药物是当前药物研究重要任务。

二硫代甲酸衍生物由于良好的生物活性备受药物工作者青睐，它们广泛用于杀虫剂。研究表明：吡咯二硫代甲酸酯可抑制核因子(NF-kB)，进而抑制癌细胞侵袭转移。此外，还表明二硫代甲酸氨基甲酸酯能够上调包括血管细胞粘附分子，并有相关专利产生(见美国专利第5,380,747；中国专利：998076961)。铁是生物体内重要的微量元素，是细胞生长必须的，由于癌细胞异常快速生长，对铁的需求大于正常细胞，所以干扰铁的代谢平衡是肿瘤药物设计又一个策略。

技术实现要素：

本发明将二硫代甲酸与席夫碱结构单元有效结合，合成了一系列吡啶腙二硫代甲酸盐，显示优异抗肿瘤活性和从铁蛋白中释放铁的能力。

为了解决现有技术的不足，本发明提供了吡啶腙二硫代甲酸衍生物及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是：吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制备方法，其特征在于，合成路线如下：

吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制备方法，所述的吡啶腙二硫代甲酸衍生物是二吡啶酮腙二硫代甲酸钾，取1mmol的KOH置于圆底烧瓶，用体积比5:1的乙醇-水混合物溶解放置在冰水浴，向其中加入80％的水合肼1mmol,在温度为0-5度环境中15分钟之后向圆底烧瓶中逐滴加入1mmol二硫化碳，继续反应30分钟；随后加入3ml溶解有1mmol二吡啶酮的无水乙醇溶液和一滴冰乙酸，回流1.5小时，浓缩，冷却，得到红棕色的粉末，即得二吡啶酮腙二硫代甲酸钾。

吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制备方法，所述的吡啶腙二硫代甲酸衍生物是吡啶醛腙二硫代甲酸钾，取1mmol的KOH置于圆底烧瓶，用体积比5:1的乙醇-水混合物溶解放置在冰水浴，向其中加入80％的水合肼1mmol,在低温环境中15min，之后向圆底烧瓶中逐滴加入1mmol二硫化碳1小时，继续反应30分钟；随后加入3ml溶解有1mmol吡啶醛的无水乙醇溶液和一滴冰乙酸，回流1.5小时，浓缩，冷却，得到红棕色的粉末，即得吡啶醛腙二硫代甲酸钾。

吡啶腙二硫代甲酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

吡啶腙二硫代甲酸衍生物在制备抑制血管形成药物中的应用。

吡啶腙二硫代甲酸衍生物在制备治疗地中海贫血药物中的应用。

上述的应用，所述的吡啶腙二硫代甲酸衍生物是吡啶醛腙二硫代甲酸钾或二吡啶酮腙二硫代甲酸钾。

本发明合成了一系列新型的吡啶腙二硫代甲酸盐，具有新的生物学特性：(1)能从铁蛋白中有效地夺取铁离子，改变宿主细胞的铁平衡，因而可用于地中海贫血的治疗；(2)可抑制肝癌、结肠癌、卵巢癌细胞的生长，具有较小的半数抑制浓度；(3)可抑制癌细胞转移；(4)抑制血管形成。

附图说明

图1a是2-二吡啶酮腙硫代甲酸对HepG2及Bel-7401肝癌细胞的抑制作用。

图1b是2-吡啶醛腙硫代甲酸对HepG2肝癌细胞的抑制作用。

图2a是2-二吡啶酮腙二硫代甲酸滴定铁(III)的光谱。

图2b是2-二吡啶酮腙二硫代甲酸与铁(III)的络合比为1:1其中DpkdtC代表2-二吡啶酮腙二硫代甲酸。

图3a是不同螯合剂从铁蛋白释放铁的动力学。

图3b是不同螯合剂的化学结构。

图4是2-二吡啶腙二硫代甲酸钾对HUVEC细胞抑制作用。

图5a是对照组。

图5b是0.25μM二吡啶酮腙二硫代甲酸钾对HUVEC细胞形成圆环的抑制作用。

图5c是0.5μM二吡啶酮腙二硫代甲酸钾对HUVEC细胞形成圆环的抑制作用。

图6是二吡啶酮腙二硫代甲酸钾对HUVEC细胞转移的抑制作用。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂均为市售。

本发明实施例中使用的试剂和仪器如下：

试剂：MTT(Sigma)，胰酶(北京拜尔迪生物技术有限公司)，培养基(北京索莱宝生物技术有限公司)，血清(浙江天杭生物科技有限公司)，DMSO(天津市德恩化学试剂有限公司)，无水乙醇(天津市德恩化学试剂有限公司)，KOH(天津市德恩化学试剂有限公司)，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。80％水合肼(天津市天力化学试剂有限公司)，二硫化碳(天津市天力化学试剂有限公司)。

光谱分析仪(日本岛津，型号：UV-2450)。

实施例1，二吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制备

取1mmol的KOH(56.1mg)置于圆底烧瓶，用乙醇-水混合物(5:1)溶解放置在冰水浴，向其中加入80％的水合肼1mmol(50.1mg),在低温环境中15分钟之后向圆底烧瓶中逐滴加入1mmol(76.2mg)二硫化碳。继续反应30分钟。随后加入3ml溶解有1mmol二吡啶酮的无水乙醇溶液和一滴冰乙酸，回流1.5小时，浓缩，冷却，得到红棕色的粉末，即得二吡啶酮腙二硫代甲酸钾。产率：80％，熔点：mp:140.5℃.NMR(D6-DMSO):13.35(s,NH),8.85(d,H,J＝4Hz),8.63(d,H,J＝4Hz),8.03(m,2H,J＝8Hz),7.95(d,H,J＝8Hz),7.63(dd,H,J＝4Hz),7.59(d,H,J＝8Hz),7.54(dd,H,J＝4Hz).IR(KBr压片,cm^-1):3430,1624,1587,1519,1461,1430,1217,1187,1133,1051,1012,992,800,753,731,712,648,618,590.ESI-MS(m/z):350.9540(M-H+2K,calcd:350.9525).

实施例2、吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制备

取1mmol的KOH(56.1mg)置于圆底烧瓶，用乙醇-水混合物(5-1)溶解放置在冰水浴，向其中加入80％的水合肼1mmol(50.1mg),在低温环境中15min,之后向圆底烧瓶中逐滴加入1mmol(76.2mg)二硫化碳(1h)。继续反应30分钟。随后加入3ml溶解有1mmol吡啶醛的无水乙醇溶液和一滴冰乙酸，回流1.5小时，浓缩，冷却，得到红棕色的粉末，即得吡啶醛腙二硫代甲酸钾。产率：70％，熔点：mp:140.5℃.NMR(D₆-DMSO):8.64(d,H,J＝4Hz),8.29(s,H),7.94(m,2H,J＝8Hz),7.48(m,H,J＝8Hz)。ESI-MS(m/z):350.9540(M-H+2K,calcd:350.9525).

实施例3、抗肿瘤活性实验

采用MTT法评估目标化合物的抗肿瘤活性。以HepG2(肝癌)、Bel-7402(肝癌)细胞为测试细胞株，选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，经胰酶消化后，用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基配成5×10³个/ml的细胞悬液，接种到96孔培养板，每孔接种100微升，37℃，5％CO₂培养24小时。设立阴性对照组、阳性对照组及实验组。细胞贴壁后实验组更换新的含有不同浓度被测样品的培养基。阳性组对照给予顺铂，阴性对照组则换为含有等体积溶剂的培养基。每组设三个复孔，37℃，5％CO₂培养48小时。弃去上清液，每孔加入10微升新鲜配制的10mg/ml MTT的无血清培养基。37℃继续培养4小时。小心弃上清，并加入100微升DMSO，在平板震荡器震荡均匀后，在酶标仪上测定每孔在570纳米的吸光度(OD)值。按下列公式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：抑制率(％)＝(对照组的OD值-实验组的OD值)/对照组的OD值×100.并计算半数抑制浓度(IC50：50％细胞生长抑制时的浓度)。在形态上HepG2细胞及Bel-7402细胞经不同浓度的待测药物处理48小时后，死细胞的数量随着药物浓度增加逐渐增加。细胞的增殖受到抑制。形态上随着药物浓度增加，贴壁性减弱，细胞逐渐变园，个数随药物浓度增加变化上升。

2-二吡啶酮腙硫代甲酸钾对HepG2细胞的IC₅₀为：0.42μM；Bel-7402细胞为：IC₅₀为：3.54μM。顺铂对HepG2细胞的IC₅₀为：0.42μM；Bel-7402细胞为：IC₅₀为：11.2μM。吡啶醛腙硫代甲酸钾对HepG2细胞的IC₅₀为：4.10μM。吡啶腙二硫代甲酸衍生物的细胞毒性如图1所示：其中(a)2-二吡啶酮腙硫代甲酸对HepG2及Bel-7401肝癌细胞的抑制作用；(b)2-吡啶醛腙硫代甲酸对HepG2肝癌细胞的抑制作用。

实施例4、2-二吡啶酮腙硫代甲酸钾从铁蛋白中调动铁活性

1、二吡啶酮腙二硫代甲酸盐与不同铁离子结合比例

试剂：1mM二吡啶酮腙二硫代甲酸钾(水溶液)；1mM硫酸亚铁铵；1mM氯化铁。

仪器：岛津UV-2450分光光度计(光度测定或动力学模式)

操作步骤：

取11支容量瓶分别编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。分别加入50μl的1mM二吡啶酮腙二硫代甲酸盐,然后加入分别加入1mM硫酸亚铁铵10,20，30，40，50,60,70,80,90，100,110μl，然后加入Tris-HCl缓冲液(20mM，pH7.2)至5ml，混匀。30分钟后进行扫描，扫描范围：200nm-500nm。对于与三价铁的结合的测定与上述步骤相同。所得结果证明：如图2所示，1)2-二吡啶酮腙二硫代甲酸与铁结合是1:1；2)2-二吡啶酮腙二硫代甲酸与铁配合物的吸收峰在402纳米。

2、药物(二吡啶酮腙二硫代甲酸盐)与铁蛋白作用(释放铁)。

首先配制药物(二吡啶酮腙二硫代甲酸盐)用水溶解至1mM,铁蛋白(Sigma)1mg/ml缓冲体系：Tris-HCl，pH＝7.2

操作步骤：

取50μl二吡啶酮腙二硫代甲酸盐(或其他所示药物),1μl铁蛋白(Sigma，)置于Ependorff管，补加缓冲液至1ml,混合均匀后转移至比色杯进行动力学扫描(室温)，跟踪波长为402纳米，每隔5min扫描一次，直至90分钟。从图3a可以看出：类似结构，只有二吡啶酮腙二硫代甲酸可以有效从铁蛋白中将铁释放出来。图3是二吡啶酮腙二硫代甲酸对铁蛋白中铁的调动能力。

实施例5，抑制血管形成实验

试剂：

ECM Matrix胶(Millipore)；MTT(Sigma)，胰酶(北京拜尔迪生物技术有限公司)，培养基(北京索莱宝生物技术有限公司)，血清(浙江天杭生物科技有限公司)，DMSO(天津市德恩化学试剂有限公司)，

1、对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞生长抑制。

细胞培养方法如对肿瘤细胞生长抑制实验与实施例二，抗肿瘤活性实验相同，但所使用的细胞为脐静脉内皮细胞(HUVEC)。根据MTT法，所得半数抑制浓度(IC₅₀)为3.4±0.3μM。结果如图4，2-二吡啶腙二硫代甲酸钾对HUVEC细胞抑制作用。

2、对血管形成(圆环)抑制作用

实验步骤：1)将100μl冷的10X稀释液加到900μl ECM Matrix,混合均匀。将50μl ECM胶加到96孔板，37℃固化1小时；2)选用对数生长期的贴壁HUVEC细胞，经胰酶消化后，用10％胎牛血清的RPMI 1640培养基配成5×10³个/ml的细胞悬液，接种到96孔培养板，每孔接种100微升。然后分别加入不同浓度2-二吡啶腙二硫代甲酸钾。未加药物为对照。37℃，5％CO₂培养10小时。倒置显微镜观察，圆环的多少。结果显示：0.5μM 2-二吡啶腙二硫代甲酸钾即可抑制血管形成(吡咯二硫代甲酸盐为50μM完全抑制)。图5二吡啶酮腙二硫代甲酸钾对HUVEC细胞形成圆环的抑制作用。

实施例6，抑制血管形成实验

细胞划痕实验(Wound Healing)是一种操作简单的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。其原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。若药物具有抑制细胞迁移能力，则使“划痕”难以愈合。

实验步骤：1)培养板先用记号笔在12孔板背面画横线标记(方便拍照时定位同一个视野)；2)将HUVEC细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜；3)细胞铺满板底后，用250μl枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致；4)吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片；5)加入无血清培养基，拍照记录；6)将培养板放入培养箱培养，每隔4-6小时取出拍照；7)根据收集图片数据分析实验结果。

结果：与对照相比，二吡啶酮腙二硫代甲酸钾对HUVEC细胞迁移有明显抑制作用(见图6)。

图6二吡啶酮腙二硫代甲酸钾对HUVEC细胞转移的抑制作用。0和24小时见“痕”大小的比较：对照组；0.25μM二吡啶酮腙二硫代甲酸钾组；0.5μM二吡啶酮腙二硫代甲酸钾组。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。