专利名称：二芳基硫代乙内酰脲化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括二芳基硫代乙内酰脲的二芳基乙内酰脲化合物，及合成它们和在治疗激素难治的(refractory)前列腺癌中使用它们的方法。该申请引入同一受让人的PCT/US2006/011417作为参考。
背景技术：
前列腺癌是西方人中最常见的癌和癌死亡的第二主要原因。当癌被局部限制时，该疾病可通过外科或辐射而治愈。但是，30％的这种癌因为远处转移性疾病而复发，和其它的在诊断时具有晚期疾病(advanced disease)。晚期疾病通过去势和/或抗雄激素的给药，即所谓的去雄激素疗法治疗。去势降低雄激素的循环水平和降低雄激素受体(AR)的活性。抗雄激素的给药通过竞争掉(compete away)雄激素的结合而阻断AR功能，因此降低AR活性。尽管一开始有效，但这些治疗迅速失效且癌变为激素难治的。
最近，AR的过度表达已被确定和证实为激素难治的前列腺癌的原因。参见Chen，C.D.，Welsbie，D.S.，Tran，C.，Baek，S.H.，Chen，R.，Vessella，R.，Rosenfeld，M.G.，and Sawyers，C.L.，Molecular determinants of resistanceto antiandrogen therapy，Nat.Med.，1033-39，2004，其在此作为参考并入。AR的过度表达足以导致从激素敏感的前列腺癌敏感发展到激素难治的前列腺癌，暗示着比现有药物更好AR抑制剂可减慢前列腺癌的发展。证明了AR和其配体结合对激素难治的前列腺癌的发展是必需的，说明AR仍是该疾病的靶。还证明了在激素难治的前列腺癌中AR的过度表达将抗雄激素从拮抗剂转化成激动剂(agonist)(AR拮抗剂抑制AR活性和AR激动剂促进AR活性)。来自该工作的数据解释了为什么去势和抗雄激素未能防止前列腺癌发展和揭示了激素难治的前列腺癌的未被认识的性质。
比卡鲁胺(biscalutamide)(商标名Casodex)是最常用的抗雄激素。尽管它对激素敏感的前列腺癌中的AR具有抑制作用，但当癌变为激素难治时它未能抑制AR。目前抗雄激素的两个弱点归咎于未能防止前列腺癌从激素敏感阶段发展到激素难治的疾病和未能有效地治疗激素难治的前列腺癌。一个是其弱拮抗活性，和另一个是当AR在激素难治的前列腺癌中过度表达时其强激动(agonistic)活性。因此，为延迟疾病发展和治疗致命的激素难治的前列腺癌需要具有更有效的拮抗活性和最小激动活性的更好的AR抑制剂。
对于前列腺癌，非甾族抗雄激素如比卡鲁胺相对甾族化合物是优选的，因为它们是更选择性和具有更小的副作用。这类化合物已被描述于许多专利如美国专利No.4,097,578/美国专利No.5,411,981、美国专利No.5,705,654、PCT国际申请WO 97/00071和WO 00/17163、和美国公开专利申请号2004/0009969中，其全部在此作为参考并入本发明。
美国专利No.5,434,176包括包含非常大量的化合物的宽泛权利要求，但仅针对这些化合物的一小部分提供合成路径和仅对它们中的两种提供药理学数据，和本领域技术人员不能容易地预想其它特定化合物。
因为激素难治的前列腺癌的机理是未知的，因此没有生物系统测试描述于这些专利的这些化合物关于它们对激素难治的前列腺癌的作用。尤其，激素难治的前列腺癌中的AR过度表达将抑制剂从拮抗剂转变到激动剂的能力未被认知。激素难治的前列腺癌的一些新性质报道在PCT申请US04/42221和US05/05529中，其在此作为参考并入。PCT国际申请US05/05529提出了一种用于确认化合物的雄激素受体拮抗剂和激动剂特性的方法。但对于所生成的各个化合物，测定化合物的拮抗剂和激动剂特性耗时过程必须是确定的。即，没有单独的从化合物的化学结构来准确预测与治疗前列腺癌有关的特性的方法。
一些化合物已被报道为配体结合域(LBD)雄激素受体(AR)的抑制剂。几种已用作治疗前列腺癌的药物，如比卡鲁胺(Casodex)。AR LBD的几种结合剂已被确定，如硫代乙内酰脲、RU59063和BTID。(Teutsch，G.；Goubet，F.；Battmann，T.；Bonfils，A.；Bouchoux，F.；Cerede，E.；Gofflo，D.；Gaillard-Kelly，M.；Philibert.D..J.Steroid Boichem.Molec.Biol.1994，48，111-119；Van Dort，M.E.；Robins，D.M.；Wayburn，B.J.Med.Chem.2000，43，3344-3347) 需要具有期望的药理学性质的新的硫代乙内酰脲化合物，和用于制备它们的合成路径。因为活性对小的结构变化敏感，一种化合物在治疗前列腺癌中可为有效的，而第二种化合物可为无效的，即使它与第一中化合物仅稍微不同，例如单个取代基的替代。
具有高的拮抗雄激素活性的效力和具有最小激动剂活性的化合物的确认应该战胜激素难治的前列腺癌(HRPC)和避免或减慢激素敏感的前列腺癌(HSPC)的发展。因此，本领域中需要确认雄激素受体的选择性调节剂，如非甾族、非毒性和组织选择性的调节剂。
发明内容
本发明提供对AR具有强的拮抗剂活性和最小激动剂活性的一系列化合物。这些化合物抑制激素难治的前列腺癌的发展。
本发明的具体化合物包括
本发明还提供包含治疗有效量的根据任何前述化合物的化合物或其可药用盐和可药用载体或稀释剂的药物组合物。
本发明包括用于治疗过度增生病症的方法，包括将这种药物组合物向需要这种治疗的患者给药，由此治疗过度增生病症。过度增生病症可以是激素难治的前列腺癌。剂量可以是约0.001mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约0.01mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约0.1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重/天。
该化合物可通过静脉注射给药、通过注射入组织给药、腹膜内给药、口服给药、或鼻内给药。该组合物可具有选自溶液、分散体、悬浮液、粉末、胶囊、片剂、丸剂、延时释放(time release)胶囊、延时释放片剂和延时释放丸剂的形式。
给药的化合物可选自NC54、NC55、NC56、或NC57、或其可药用盐。给药的化合物可以是NC53或其可药用盐。
本发明提供了合成NC54的方法，包括将N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺和4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈在DMF中混合和加热以形成第一混合物，和如上进行处理。
本发明还提供了合成NC55的方法，包括将N-甲基-2-氟-4-(1-氰基环戊基)氨基苯甲酰胺、4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈和DMF混合和在回流下加热以形成第一混合物，和如上进行处理。
本发明进一步提供了合成NC56的方法，包括将N，N-二甲基4-[4-(1-氰基环丁基氨基)苯基]丁酰胺、4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈和DMF混合和在回流下加热以形成第一混合物；和如上进行处理。
本发明提供了合成NC57的方法，包括将DMSO、二氯甲烷和草酰氯混合以形成第一混合物，将4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酰胺加入第一混合物以形成第二混合物；将三乙胺加入第二混合物以形成第三混合物；加温该第三混合物和用含水NH4Cl(aqueous NH4Cl)猝灭(quench)以形成第四混合物；从第四混合物中提取有机层；和从有机层中分离该化合物。
在一个实施方案中，化合物具有下式
R1和R2独立地是甲基或，与它们所连接的碳一起形成4至5个碳原子的环烷基，R3选自氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基烷基、烷基氨基甲酰基烷基、氰基、和氰基烷基，和R4是氢或氟。
在一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量根据权利要求1的化合物或其可药用盐和可药用载体或稀释剂。
化合物可例如具有下式
或
药物组合物可包含治疗有效量的化合物NC54或其可药用盐和可药用载体或稀释剂。药物组合物可包含治疗有效量的根据权利要求的化合物NC55或其可药用盐和可药用载体或稀释剂。
在一个实施方案中，用于治疗过度增生病症的方法包括将权利要求2的药物组合物向需要这种治疗的患者给药，由此治疗过度增生病症。
该组合物可例如具有选自溶液、分散体、悬浮液、粉末、胶囊、片剂、丸剂、延时释放胶囊、延时释放片剂和延时释放丸剂的形式。该化合物可通过静脉注射给药、通过注射入组织给药、腹膜内给药、口服给药、或鼻内给药。该组合物可按照约0.001mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的化合物剂量给药。该组合物可按照约0.01mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的化合物剂量给药。该组合物可按照约0.1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天的化合物剂量给药。该组合物可按照约1mg/kg体重/天的化合物剂量给药。
用于治疗前列腺癌的方法包括将药物组合物向需要这种治疗的患者给药，由此治疗前列腺癌。该药物组合物可干扰前列腺特异性抗原mRNA的转录。该药物组合物可防止雄激素受体蛋白质的核易位。该药物组合物可使雄激素受体蛋白质不稳定。该组合物可口服给药。该组合物可具有选自胶囊、片剂和丸剂的形式。
在一个实施方案中，该化合物可以是NC54、NC55、NC56、NC57、这些任一种的可药用盐、或其组合。
合成下式二芳基化合物的方法
包括将化合物I
化合物I 与化合物II
化合物II 在第一极性溶剂中混合以形成混合物，加热该混合物，将与第一极性溶剂相同或不同的第二极性溶剂和含水酸加入该混合物，回流该混合物，冷却该混合物并与水混合，和从混合物中分离该二芳基化合物。R51可包括1至4个碳原子的烷基链。R52可以是氰基、羟基、甲基氨基甲酰基、甲基氨基甲酰基-取代的烷基、甲基砜氨基甲酰基-取代的烷基、甲基氨基甲基、二甲基氨基甲基、甲基磺酰氧基甲基、甲氧基羰基、3-氰基-4-三氟甲基苯基氨基甲酰基、氨基甲酰基-取代的烷基、羧甲基、甲氧基羰基甲基、甲磺酰基、4-氰基-3-三氟甲基苯基氨基甲酰基-取代的烷基、羧基-取代的烷基、4-甲磺酰基-1-哌嗪基、哌嗪基、羟乙基氨基甲酰基-取代的烷基、或羟基乙氧基羰基-取代的烷基。R53可选自F和H。
在一个实施方案中，R51包括1至2个碳原子的烷基链，R52选自氨基甲酰基和甲基氨基甲酰基，和R53是F。
合成下式化合物的方法
可包括将4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈和N-甲基-4-(1-氰基环丁基氨基)-2-氟苯甲酰胺在二甲基甲酰胺中混合以形成第一混合物，加热第一混合物以形成第二混合物，将醇和酸加入第二混合物以形成第三混合物，回流第三混合物以形成第四混合物，冷却第四混合物，将第四混合物与水混合和提取有机层，和从有机层中分离该化合物。
合成权利要求4的化合物[NC54]的方法可包括将N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺和4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈在DMF中混合和加热以形成第一混合物，将醇和酸加入第一混合物以形成第二混合物，回流第二混合物，冷却第二混合物，将第二混合物与水混合和提取有机层，和从有机层中分离该化合物。
合成权利要求6的化合物[NC55]的方法可包括将N-甲基-2-氟-4-(1-氰基环戊基)-氨基苯甲酰胺、4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈和DMF混合和在回流下加热以形成第一混合物，将醇和酸加入第一混合物以形成第二混合物，回流第二混合物，冷却第二混合物，将第二混合物与水混合和提取有机层，和从有机层中分离该化合物。
合成权利要求8的化合物[NC56]的方法可包括将N，N-二甲基4-[4-(1-氰基环丁基氨基)苯基]丁酰胺、4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈和DMF混合和在回流下加热以形成第一混合物，将醇和酸加入第一混合物以形成第二混合物，回流第二混合物，冷却第二混合物，将第二混合物与水混合和提取有机层，和从有机层中分离该化合物。
合成权利要求9的化合物[NC57]的方法可包括将DMSO、二氯甲烷和草酰氯混合以形成第一混合物，将4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酰胺加入第一混合物以形成第二混合物，将三乙胺加入第二混合物以形成第三混合物，加温第三混合物和用含水NH4Cl猝灭以形成第四混合物，从第四混合物中提取有机层，从有机层中分离该化合物。
一种方法可包括提供至少一种二芳基硫代乙内酰脲化合物，测量该化合物的雄激素受体活性的抑制和确定该抑制是否在第一预定水平之上，测量该化合物在激素难治的癌细胞中的雄激素受体活性的刺激和确定该刺激是否在第二预定水平之下，如果该抑制在第一预定水平之上和该刺激在第二预定水平之下则选择该化合物。该预定水平可以是比卡鲁胺的那些。测量抑制可包括在AR响应报道分子(reporter)系统或前列腺特异性抗原分泌体系中测量抑制浓度(IC50)。测量刺激可包括通过增加AR响应报道分子系统或前列腺特异性抗原分泌体系中的浓度而测量诱导倍数。测量抑制和/或刺激可包括测量该化合物对动物的肿瘤生长的作用。测量雄激素受体活性的抑制和/或刺激的步骤可包括测量雄激素受体对该化合物的结合亲合性。测量雄激素受体活性的抑制和/或刺激的步骤可包括测量对雄激素受体向前列腺特异性抗原增强子(enhancer)和前列腺特异性抗原启动子(promoter)的至少一种的募集的防止。测量雄激素受体活性的抑制和/或刺激的步骤可包括测量对雄激素受体核易位的防止。测量雄激素受体活性的抑制和/或刺激的步骤可包括测量雄激素受体蛋白质的不稳定作用。
一种方法可包括将能够表达前列腺特异性抗原的哺乳动物细胞与足够量的二芳基硫代乙内酰脲化合物接触以干扰前列腺特异性抗原mRNA的转录。二芳基硫代乙内酰脲化合物可选自NC53、NC54、NC55、NC56和NC57。该化合物可防止在前列腺特异性抗原基因上形成转录复合物。该化合物可防止雄激素受体蛋白质与前列腺特异性抗原基因复合。该化合物可防止RNA聚合酶TI与前列腺特异性抗原基因复合。
一种方法包括将哺乳动物细胞与足够量的二芳基硫代乙内酰脲化合物接触以防止雄激素受体蛋白质的核易位和/或使雄激素受体蛋白质不稳定。
以下附图给出了一些化合物的药理学检查的结果。
图1是描绘比卡鲁胺对LNCaP-AR展现出激动作用的图。比卡鲁胺在AR-过度表达的激素难治的前列腺癌中显示激动活性。具有过度表达AR的LNCaP细胞用增加浓度的作为载体的DMSO或比卡鲁胺在不存在R11881下处理。测定AR响应报道分子的活性。
图2是描绘比卡鲁胺对LNCaP-AR的拮抗分析的图。比卡鲁胺在激素敏感的前列腺癌中的激动剂活性。LNCaP细胞用增加浓度的作为载体的DMSO或比卡鲁胺在不存在R1881下处理。测定AR响应报道分子的活性。
图3是描绘化合物对LNCaP-AR的作用的图。
图4是描绘对LNCaP-AR的抑制作用的图。
图5.对AR-过度表达LNCaP异种移植模型的PSA表达的抑制作用。小鼠用载体、0.1、1或10mg/kg实施例7-3b(NC7)治疗44天，口服一日一次给药。在44天治疗之后从小鼠中取出肿瘤，提取肿瘤溶胞产物，和通过ELISA测定组织溶胞产物中的PSA水平。
图6是肿瘤体积作为使用载体溶液、Casodex和NC53处理的时间的函数的图。
图7是肿瘤尺寸的图。将AR过度表达LNCaP细胞皮下地注入去势的SCID小鼠的胁腹中。当肿瘤达到约100立方毫米时，它们被随机分成5组。每组有九只动物。在它们达到该肿瘤体积之后，对它们用载体、比卡鲁胺或NC53在每天10或50mg/kg下口服给药。使用测径器三维(宽度、长度和深度)测量肿瘤。
图8描绘肿瘤尺寸的实验结果。在18天时，通过光学CCD照相机在最后治疗剂量之后3小时时对动物进行成像。在肿瘤上画出ROI用于萤光素酶活性测量，以光子/秒计。右面表示ROI测量。
图9是描绘来自静脉内给药(上曲线)和口服给药(下曲线)的NC53的药代动力学曲线的图。
图10是荧光吸光率作为浓度对数的函数的图，其反映几种化合物对大鼠雄激素受体的结合亲和性。
图11给出反映当加入Casodex或NC53时雄激素受体和RNA聚合酶II对PSA增强子和与PSA启动子的复合状态的图。
图12给出反映雄激素受体在Casodex存在下，但不存在NC53下易位到核的图。
图13给出反映雄激素受体在Casodex存在下，但不存在NC53下易位到核的图。
图14给出反映雄激素受体蛋白质在NC53的存在下降解的图。
图15是描绘在用各种化合物治疗之后的前列腺重量的图表。如柱的标记所示，每天给药10、25或50mg化合物/千克体重。将化合物向健康FVB小鼠给药。在用化合物治疗14天之后，通过取出半囊(semi-vesicle)、前列腺和膀胱并称重而确定泌尿生殖道重量。三小鼠用给定化合物给药以得到该图中的柱所示的数据。一组小鼠不用化合物治疗数据在柱中被标记为“未治疗”。另一组小鼠仅用载体溶液治疗数据在柱中标记为“载体”。
图16是给出与图6中所示的实验程序一起进行的PSA分析的图。
图17是给出NC53的各种给药方案对肿瘤体积的作用的图。
图18是给出在剂量0.1、1和10mg/千克体重/天下用NC53治疗和没有用NC53治疗后第17天时与萤光素酶活性有关的光子发射速率相对与在第0天时的速率的图。
图19给出了实验结果，其中SCID小鼠被注入LN-AR(HR)细胞系以诱导肿瘤生长。一组小鼠用化合物NC53在剂量10mg/千克体重/天下处理；另一组小鼠仅用载体溶液处理。(A)对于每组小鼠所示的作为时间函数的相对肿瘤体积。(B)每组小鼠在第31天时与萤光素酶活性有关的光子发射的图像，表示为彩色轮廓。(C)每组小鼠在几个时间上显示的与萤光素酶活性有关的光子发射速率。
图20是给出与使用各种浓度的NC53、NC54、NC55、和NC57及载体溶液处理的LN-AR细胞有关的PSA吸光率的图。
图21是给出与使用各种浓度的NC7、NC48、NC53、比卡鲁胺和DMSO处理的LN-CaP细胞有关的PSA吸光率的图。
图22给出了使用野生型非转基因小鼠(WT)、去势的萤光素酶转基因小鼠(Cast)和非去势的萤光素酶转基因小鼠(Intact)进行的实验的结果。显示了以90天释放期用产生12.5mg/千克体重的植入睾酮丸治疗的去势的萤光素酶转基因小鼠的数据(T/Cast)，和显示了以90天释放期用产生12.5mg/千克体重的植入睾酮丸治疗的非去势的萤光素酶转基因小鼠的数据(Intact+T)。显示了用植入睾酮丸和用比卡鲁胺(BIC+T/Cast)或用NC53(NC53+T/Cast)在10mg/千克体重/天下治疗的去势的萤光素酶转基因小鼠的数据。(A)在第14天时的泌尿生殖道重量。(B)在第14天时的光子发射速率。在所有的情况下，不引起激素难治的状态。
图23是描绘在用各种剂量的几种化合物处理之后对LN-AR细胞所测量的PSA吸光率的图。
图24给出了提供化合物的几个特性的表。图15也给出了提供几种化合物的作为时间函数的药代动力学特性的图，以化合物血清浓度计。
图25是用在125nmol至1000nmol的浓度下给药的各种化合物服药的LIAR细胞系的萤光素酶活性的图。
具体实施例方式 以下详细讨论本发明的实施方案。在描述实施方案时，为了清楚起见，采用特定术语。但是，不意图将本发明限于如此选择的特定术语。相关领域的技术人员将认识到，可以采用其它的等效部分和可开发其它方法，而不背离本发明的精神和范围。本文所引用的所有参考文件作为参考并入，仿佛各自已独立地并入。
二芳基乙内酰脲化合物的合成 实施例56[NC54] 以下，空气或水分敏感反应在氩气氛下使用烘干的玻璃器皿和标准注射器/隔片技术进行。反应使用SiO2TLC板在UV光(254nm)下监控，随后用对茴香醛或茚三酮染色溶液显影。柱色谱法在硅胶60上进行。1H NMR光谱在400MHz下在CDCl3中进行，除非另有所述，和数据如下以ppm(δ)由内标(TMS，0.0ppm)记录化学位移(多重性，积分，单位为Hz的偶合常数)。
式37 将高碘酸(1.69g，7.41mmol)通过强烈搅拌溶解在乙腈(25mL)中，并随后将三氧化铬(0.16g，1.60mmol)溶解到该溶液中。将2-氟-4-硝基甲苯(0.33g，2.13mmol)在搅拌下加入以上溶液。随着放热反应立即形成白色沉淀物。在1小时搅拌之后，将反应混合物的上清液倒入烧瓶，和通过蒸发去除溶剂。残余物用二氯甲烷(2 x 30mL)和水(2 x 30mL)提取。将有机层在MgSO4上干燥和浓缩以得到2-氟-4-硝基苯甲酸(式37)(0.32mg，81％)作为白色固体。1HNMR δ 8.06(ddd，1H，J＝9.9，2.2和0.3)，8.13(ddd，1H，J＝8.6，2.2和0.9)，8.25(ddd，1H，J＝8.6，7.0和0.3)。
式38 将亚硫酰氯(0.15g，1.30mmol)慢慢加入在-5℃下冷却的2-氟-4-硝基苯甲酸(式37)(0.20g，1.10mmol)在DMF(5mL)中的溶液。将混合物在-5℃下再搅拌1小时。将过量甲胺(从其40％水溶液中新蒸馏的)加入反应介质。将该第二混合物再搅拌1小时。将乙酸乙酯(50mL)加入该混合物，其用盐水(2x50ml)洗涤。将有机层在MgSO4上干燥和浓缩以得到N-甲基-2-氟-4-硝基苯甲酰胺(式38)(0.18g，85％)作为带黄色的固体。1H NMR(丙酮-d6)δ 3.05(d，3H，J＝4.3)，6.31(dd，1H，J＝13.5和2.1)，6.40(dd，1H，J＝8.6和2.1)，7.64(dd，1H，J＝8.6和8.6)。
式39 将N-甲基-2-氟-4-硝基苯甲酰胺(式38)(0.18g，0.91mmol)和铁(0.31g，5.60mmol)在乙酸乙酯(5mL)和乙酸(5mL)中的混合物回流1小时。过滤掉固体颗粒。将滤液用水洗涤和用乙酸乙酯提取。将有机层在MgSO4上干燥、浓缩和将残余物用SiO2柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，95:5)纯化以得到N-甲基-2-氟-4-氨基苯甲酰胺(式39)(0.14g，92％)作为灰白色固体。1H NMR(丙酮-d6)δ 2.86(d，3H，J＝4.3)，5.50(br s，2H)，6.37(dd，1H，J＝14.7和2.1)，6.50(dd，1H，J＝8.6和2.1)，7.06(br s，1H)，7.68(dd，1H，J＝8.8和8.8)。
式40 将N-甲基-2-氟-4-氨基苯甲酰胺(式39)(96mg，0.57mmol)、丙酮氰醇(0.3mL，3.14mmol)和硫酸镁(50mg)的混合物加热至80℃和搅拌12小时。向介质中加入乙酸乙酯(25mL)并随后用水(2 x 25mL)洗涤。将有机层在MgSO4上干燥和浓缩，和将残余物用SiO2柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，95:5)纯化以得到N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺(式40)(101mg，75％)作为白色固体。1H NMR δ 1.74(s，6H)，2.98(dd，3H，J＝4.8和1.1)，6.58(dd，1H，J＝14.6和2.3)，6.63(dd，1H，J＝8.7和2.3)，6.66(br s，1H)，7.94(dd，1H，J＝8.7和8.7)。
式41 将4-氨基-2-三氟甲基苄腈(2.23g，12mmol)在室温下在15分钟内分批(portionwise)加入硫光气(1mL，13mmol)在水(22mL)中的搅拌良好的非均匀混合物。搅拌继续再1小时。将反应介质用氯仿(3 x 15ml)提取。将混合的有机相在MgSO4上干燥和在减压下蒸发至干燥以得到所需产物4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈(式41)作为带褐色的固体和原样用于下一步骤(2.72g，11.9mmol，99％)。1H NMR δ 7.49(dd，1H，J＝8.3和2.1)，7.59(d，1H，J＝2.1)，7.84(d，1H，J＝8.3)。
NC54(式42) 56-1)NC54 将N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺(式40)(30mg，0.13mmol)和4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈(式41)(58mg，0.26mmol)在DMF(1mL)中的混合物在微波照射下在100℃下加热11小时。向该混合物中加入甲醇(20mL)和1N HCl水溶液(5mL)。将该第二混合物回流1.5小时。在冷却至室温之后，将反应混合物倒入冷水(50mL)中和用乙酸乙酯(50mL)提取。将有机层在MgSO4上干燥、浓缩和将残余物用SiO2柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，95:5)纯化以得到NC54(式42)(15mg，25％)作为无色晶体。1H NMR δ1.61(s，6H)，3.07(d，3H，J＝4.1)，6.71(m，1H)，7.15(dd，1H，J＝11.7和2.0)，7.24(dd，1H，J＝8.4和2.0)，7.83(dd，1H，J＝8.2和2.1)，7.95(d，1H，J＝2.1)，7.99(d，1H，J＝8.2)，8.28(dd，1H，J＝8.4和8.4)。
实施例57
式43 将N-甲基-2-氟-4-氨基苯甲酰胺(式39)(62mg，0.37mmol)、环戊酮(0.07mL，0.74mmol)和TMSCN(0.1mL，0.74mmol)的混合物加热至80℃和搅拌13小时。向介质中加入乙酸乙酯(2 x 20mL)并随后用水(2 x 20mL)洗涤。将有机层在MgSO4上干燥和浓缩，和将残余物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，95:5)纯化以得到N-甲基2-氟-4-(1-氰基环戊基)氨基苯甲酰胺(式43)(61mg，63％)作为白色固体。1H NMR δ 7.95(dd，1H，J＝8.8，8.8Hz)，6.65(br s，1H)，6.59(dd，1H，J＝8.8，2.3Hz)，6.50(dd，1H，J＝14.6，2.3Hz)，4.60(br s，1H)，2.99(dd，3H，J＝4.8，1.1Hz)，2.36-2.45(m，2H)，2.10-2.18(m，2H)，1.82-1.95(m，4H)。
NC55(式44) 57-1)NC55 将N-甲基2-氟-4-(1-氰基环戊基)氨基苯甲酰胺(式43)(57mg，0，22mmol)和4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈(0.15g，0.65mmol)在DMF(3mL)中的混合物在微波照射(开式容器)下在130℃下加热12小时。向该混合物中加入甲醇(20mL)和1N HCl水溶液(5mL)。将该第二混合物回流1.5小时。在冷却至室温之后，将反应混合物倒入冷水(50mL)中和用乙酸乙酯(50mL)提取。将有机层在MgSO4上干燥、浓缩和将残余物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，95:5)纯化以得到4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-2-硫代-1，3-二氮杂螺[4.4]壬烷-1-基)-2-氟-N-甲基苯甲酰胺，NC55(式44)(8mg，7％)作为带黄色的固体。1H NMR δ 8.28(dd，1H，J＝8.4，8.4Hz)，7.98(d，1H，J＝8.3Hz)，7.96(d，1H，J＝1.8Hz)，7.84(dd，1H，J＝8.3，1.8Hz)，7.27(dd，1H，J＝8.4，1.8Hz)，7.17(dd，1H，J＝11.7，1.8Hz)，6.67-6.77(m，1H)，3.07(d，3H，J＝4.3Hz)，2.32-2.41(m，2H)，2.13-2.21(m，2H)，1.85-1.96(m，2H)，1.49-1.59(m，2H)。
实施例58
式45 在0℃下将三氟乙酸酐(0.85mL，6.14mmol)加入4-(4-氨基苯基)丁酸(0.5g，2.79mmol)在氯仿(10mL)中的溶液。将混合物加温至室温和搅拌3小时。将混合物用氯仿(20mL)和水(20mL)分配。将有机层在MgSO4上干燥、浓缩和将残余物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，9:1)纯化以得到4-[4-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)苯基]丁酸(式45)(0.53g，69％)。1H NMR δ 7.81(br s，1H)，7.48(d，2H，J＝8.5Hz)，7.22(d，2H，J＝8.5Hz)，2.68(t，2H，J＝7.5Hz)，2.38(t，2H，J＝7.5Hz)，1.96(p，2H，J＝7.5Hz)。
式46 将亚硫酰氯(71mg，0.60mmol)慢慢加入在-5℃下冷却的4-[4-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)苯基]丁酸(式45)(0.15g，0.55mmol)在DMF(5mL)中的溶液。将混合物在-5℃下再搅拌1小时。将过量二甲胺(从其40％水溶液中新蒸馏)加入反应介质。将第二混合物再搅拌1小时。将乙酸乙酯(50mL)加入混合物，其用盐水(2 x 50ml)洗涤。将有机层在MgSO4上干燥和浓缩以得到N，N-二甲基4-[4-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)苯基]丁酰胺(式46)(0.17g，定量)作为带黄色的固体。1H NMR δ 9.70(br s，1H)，7.55(d，2H，J＝8.6Hz)，7.11(d，2H，J＝8.6Hz)，2.91(s，3H)，2.89(s，3H)，2.60(t，2H，J＝7.7Hz)，2.27(t，2H，J＝7.7Hz)，1.89(p，2H，J＝7.7Hz)。
式47 在室温下将1N NaOH溶液(3mL)加入N，N-二甲基4-[4-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)苯基]丁酰胺(式46)(0.17g，0.55mmol)在甲醇(2mL)中的溶液。将混合物搅拌14小时。将混合物用氯仿(25mL)和水(25mL)分配。将有机层在MgSO4上干燥和浓缩，和将残余物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，9:1)纯化以得到N，N-二甲基4-(4-氨基苯基)丁酰胺(式47)(74mg，66％)作为白色固体。1H NMR δ 6.97(d，2H，J＝8.3Hz)，6.61(d，2H，J＝8.3Hz)，3.56(br s，2H)，2.92(s，6H)，2.56(t，2H，J＝7.7Hz)，2.28(t，2H，J＝7.7Hz)，1.91(p，2H，J＝7.7Hz)。
式48 将N，N-二甲基4-(4-氨基苯基)丁酰胺(式47)(74mg，0.36mmol)、环丁酮(54mg，0.78mmol)和TMSCN(77mg，0.78mmol)的混合物加热至80℃和搅拌15小时。向介质中加入乙酸乙酯(2 x 20mL)并随后用水(2 x 20mL)洗涤。将有机层在MgSO4上干燥和浓缩，和将残余物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，9:1)纯化以得到N，N-二甲基4-[4-(1-氰基环丁基氨基)苯基]丁酰胺(式48)(58mg，57％)作为白色固体。1H NMR δ 7.07(d，2H，J＝8.5Hz)，6.59(d，2H，J＝8.5Hz)，3.94(br s，1H)，2.94(s，3H)，2.93(s，3H)，2.75-2.83(m，2H)，2.60(t，2H，J＝7.6Hz)，2.33-2.42(m，2H)，2.30(t，2H，J＝7.6Hz)，2.11-2.28(m，2H)，1.93(p，2H，J＝7.6Hz)。
NC56(式49) 将N，N-二甲基4-[4-(1-氰基环丁基氨基)苯基]丁酰胺(式48)(58mg，0.20mmol)和4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈(74mg，0.32mmol)在DMF(3mL)中的混合物在回流下加热2小时。向该混合物中加入甲醇(20mL)和1N HCl水溶液(5mL)。将第二混合物回流1.5小时。在冷却至室温之后，将反应混合物倒入冷水(50mL)中和用乙酸乙酯(50mL)提取。将有机层在MgSO4上干燥、浓缩和将残余物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，95:5)纯化以得到4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)-N，N-二甲基丁酰胺，NC56(式49)(44mg，42％)作为浅带黄色的固体。1H NMR δ 7.98(s，1H)，7.97(d，1H，J＝8.2Hz)，7.86(d，1H，J＝8.2Hz)，7.42(d，2H，J＝8.3Hz)，7.22(d，2H，J＝8.3Hz)，2.99(s，3H)，2.96(s，3H)，2.78(t，2H，J＝7.5Hz)，2.62-2.70(m，2H)，2.52-2.63(m，2H)，2.40(t，2H，J＝7.5Hz)，2.15-2.30(m，1H)，2.04(p，2H，J＝7.5Hz)，1.62-1.73(m，1H)。
实施例59
式50 将4-(4-氨基苯基)丁酸(0.20g，1.12mmol)、环丁酮(0.17mL，2.23mmol)和TMSCN(0.30mL，2.23mmol)的混合物加热至80℃和搅拌13小时。向介质加入乙酸乙酯(2 x 30mL)并随后用水(2 x 30mL)洗涤。将有机层在MgSO4上干燥和浓缩，和将残余物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，9:1)纯化以得到4-[4-(1-氰基环丁基氨基)苯基]丁酸(式50)(0.21g，74％)作为带黄色的固体。1H NMR δ 7.06(d，2H，J＝8.6Hz)，6.59(d，2H，J＝8.6Hz)，2.75-2.83(m，2H)，2.59(t，2H，J＝7.5Hz)，2.37(t，2H，J＝7.5Hz)，2.33-2.42(m，2H)，2.11-2.28(m，2H)，1.92(p，2H，J＝7.5Hz)。
式51 将4-[4-(1-氰基环丁基氨基)苯基]丁酸(式50)(0.21g，0.83mmol)和4-异硫代氰酸基-2-三氟苄腈(0.25g，1.08mmol)在甲苯(10mL)中的混合物在回流下加热1小时。向该混合物中加入1N HCl水溶液(5mL)。将第二混合物回流1.5小时。在冷却至室温之后，将反应混合物倒入冷水(50mL)中和用乙酸乙酯(50mL)提取。将有机层在MgSO4上干燥、浓缩和将残余物用硅胶柱色谱法(二氯甲烷:丙酮，95:5)纯化以得到4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酸，NC122(式51)(60mg，15％)。1H NMR δ 7.98(d，1H，J＝1.8Hz)，7.97(d，1H，J＝8.3Hz)，7.86(dd，1H，J＝8.3，1.8Hz)，7.42(d，2H，J＝8.5Hz)，7.24(d，2H，J＝8.5Hz)，2.79(t，2H，J＝7.5Hz)，2.62-2.68(m，2H)，2.51-2.59(m，2H)，2.47(t，2H，J＝7.5Hz)，2.14-2.26(m，1H)，2.06(p，2H，J＝7.5Hz)，1.60-1.70(m，1H)。
实施例61
NC57式53 在-78℃下将DMSO(0.01mL，0.12mmol)在无水二氯甲烷(1mL)中的溶液加入草酰氯(0.01mL，0.09mmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的搅拌溶液。在15分钟之后，将4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酰胺，NC47(式52)(35mg，0.07mmol)的二氯甲烷溶液加入反应混合物。在-78℃下继续搅拌20分钟，并随后加入三乙胺(0.03mL，0.22mmol)。在-78℃下30分钟之后，将反应混合物加温至室温并随后用饱和NH4Cl水溶液猝灭(quench)。将反应混合物用二氯甲烷稀释，和用二氯甲烷提取。将有机层在MgSO4上干燥、浓缩和色谱分离(二氯甲烷:丙酮，95:5)以得到4-(5-(4-(3-氰基丙基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)-2-(三氟甲基)苄腈，NC57(式53)(29mg，87％)作为粘性油。1HNMR δ 7.98(d，1H，J＝1.8Hz)，7.98(d，1H，J＝8.3Hz)，7.86(dd，1H，J＝8.3，1.8Hz)，7.43(d，2H，J＝8.4Hz)，7.27(d，2H，J＝8.4Hz)，2.90(t，2H，J＝7.3Hz)，2.63-2.73(m，2H)，2.52-2.62(m，2H)，2.42(t，2H，J＝7.3Hz)，2.18-2.30(m，1H)，2.07(p，2H，J＝7.3Hz)，1.63-1.73(m，1H)。
本领域技术人员可改变和/或混合本文所述的合成以制备其它二芳基乙内酰脲化合物。
化合物的药理学检查 上述合成路径所针对的化合物采用类似于PCT申请US04/42221和US05/05529的筛选程序通过在激素难治的前列腺癌细胞上对AR的拮抗和激动活性进行筛选而确定，所述PCT申请在此作为参考并入。许多化合物对激素难治的前列腺癌中的过度表达AR展现出有效的拮抗活性以及最小激动活性。
体外生物分析 通过报道分子分析的化合物对AR的作用 使化合物经历使用人造AR响应报道分子系统在激素难治的前列腺癌细胞系中的试验。在该系统中，前列腺癌LNCaP细胞改造成稳定地表达内源水平的约5-倍高水平的AR。外源AR具有与内源AR类似的性能，因为；两者都通过合成雄激素R1881稳定化。AR-过度表达的细胞还改造成稳定地引入AR响应报道分子，和这些细胞的报道分子活性表现出激素难治的前列腺癌的特征。它响应于低浓度的合成雄激素R1881，仅受高浓度的比卡鲁胺抑制(参见表1)，和显示用比卡鲁胺的激动活性(图1和表2)。与公开的数据一致，比卡鲁胺抑制AR响应报道分子和在激素敏感的前列腺癌细胞中不具有激动活性(图2)。
表1 我们检查了上述合成所针对的化合物在100pM R1881存在下的拮抗活性。所改造的LNCaP细胞(LNCaP-AR，也简称为LN-AR)保持在包含10％胎牛血清(FBS)的Iscove′s培养基中。在药物治疗前的两天，细胞在包含10％木炭处理的(charcoal-stripped)FBS(CS-FBS)的Iscove′s培养基中生长以去雄激素。细胞在包含10％CS-FBS以及100pM R1881和增加浓度的试验化合物的Iscove′s培养基中分裂和生长。在两天培养之后，分析报道分子活性。
表1列出了这些化合物在激素难治的前列腺癌中抑制AR的IC50。对照物质比卡鲁胺具有889nM的IC50。所确定的化合物(二芳基硫代乙内酰脲)的大部分在抑制激素难治的前列腺癌中的AR中具有100至200nM的IC50。相反，在美国专利No.5,705,654中作为例子列出的抗雄激素化合物如实施例30-2、30-3、31-2、31-3和24-3(NC24-NC28)在该体系中不具有对AR的抑制活性。通过AR响应报道分子和通过内源PSA表达测量对激素难治的前列腺癌中的AR的拮抗活性。
(*)无该化合物不抑制AR响应报道分子；(**)n/a该化合物在该分析中未被检查。
表2 激素难治的前列腺癌中的AR过度表达的一个以前未被认识的性质是其将拮抗剂转变成激动剂的能力。因此，仅具有最小或没有激动活性的那些化合物适于成为用于该疾病的抗雄激素。为了确定不同化合物的激动活性，我们使用AR响应报道分子作为LN-AR体系中的度量在不存在R1881的情况下检查它们对AR的刺激活性。表2列出了不同的化合物的激动活性。与以前结果一致，比卡鲁胺活化激素难治的前列腺癌中的AR。二芳基硫代乙内酰脲衍生物如实施例7-3b(NC7)、33(NC34)、34(NC35)和35(NC36)不具有激动活性。相反，RU59063和在美国专利No.5,705,654中作为例子列出的其它抗雄激素化合物如实施例30-2、30-3、31-2、31-3和24-3(NC24-NC28)强烈地活化激素难治的前列腺癌中的AR。
选择的试验物质对激素难治的前列腺癌中的AR响应报道分子的激动活性 通过增加化合物的浓度而产生的诱导倍数 *(*)诱导倍数由特定试验物质对在DMSO载体中的活性所诱导的活性； (**)n/a该化合物在该分析中未被检查。
为了检查AR抑制剂的特异性，选择的化合物在具有糖皮质激素受体(GR)(核受体族中AR的最接近的成员)的过度表达的LNCaP细胞中测试。这些细胞还携带GR响应报道分子，和报道分子活性通过地塞米松(GR激动剂)诱导，和诱导通过RU486(GR抑制剂)阻断。实施例7-3b(NC7)(4-(8-氧代-6-硫代-5-(4-甲基苯基)-5，7-二氮杂螺[3.4]辛-7-基)-2-三氟甲基苄腈)在该体系中有对GR没有作用。
通过测量前列腺特异性抗原(PSA)的分泌水平得到的化合物对AR的作用 已经充分确定的是，PSA水平是前列腺癌中的AR活性的指示物。为了检查化合物在生理环境中是否影响AR功能，我们测定由R1881在AR-过度表达LNCaP细胞(LNCaP-AR，也简称为LN-AR)中引起的内源PSA的分泌水平。LNCaP-AR细胞是以制造表达雄激素受体的质粒转导(transduce)的前列腺细胞的淋巴腺癌系。LNCaP-AR细胞保持在包含10％FBS的Iscove′s培养基中。在药物治疗前的两天，细胞在包含10％CS-FBS的Iscove′s培养基中生长以去雄激素。细胞在包含10％CS-FBS以及合适浓度的R1881和试验化合物的Iscove′s培养基中分裂和生长。在四天培养之后，使用PSA ELISA试剂盒(American Qualex，San Clemente，CA)分析分泌PSA水平。
LNCaP-AR细胞的分泌PSA水平受25pM的R1881强烈诱导。相反，PSA在母体LNCaP细胞中不被诱导直至R1881的浓度达到100pM。这与我们以前报告一致，即激素难治的前列腺癌中的AR对雄激素是过度敏感的。进行对AR活性的剂量依赖性抑制以确定不同的化合物在抑制PSA表达中的IC50，和结果列于表1。选择的化合物对PSA表达的IC50接近地类似通过报道分子分析测定的那些，证实二芳基乙内酰脲衍生物是激素难治的前列腺癌中的AR的强抑制剂。
我们还使用分泌PSA作为替代品标记检查了选择的化合物对激素难治的前列腺癌中的AR的激动活性。为此，雄激素缺少的AR过度表达的LNCaP细胞使用增加浓度的上述合成所针对的化合物在不存在R1881下培养，和培养基中的分泌PSA在4天之后测量。
表3列出了选择的化合物的激动活性。与由报道分子分析得到的结果一致，二芳基硫代乙内酰脲衍生物如实施例7-3b(NC7)、33(NC34)、34(NC35)和35(NC36)不具有激动活性。相反，RU59063和在美国专利No.5,705,654中作为例子列出的其它抗雄激素化合物如实施例30-2(NC24)、30-3(NC25)和31-2(NC26)刺激激素难治的前列腺癌中的PSA表达。
表3 选择的试验物质在激素难治的前列腺癌中对内源PSA的激动活性 通过增加化合物的浓度产生的诱导倍数 (*)诱导倍数由特定试验物质相对在DMSO载体中的活性所诱导的活性； (**)n/a该化合物在该分析中未被检查。
通过MTS分析的化合物对AR线粒体活性的作用 LNCaP-AR细胞保持在包含10％FBS的Iscove′s培养基中。检查化合物对激素难治的前列腺癌细胞生长的影响。使用过度表达LNCaP细胞，因为这些细胞在体外和体内表现为激素难治的前列腺癌细胞(1)。我们通过MTS分析(生长的替代者)测定线粒体活性。具有过度表达AR的LNCaP细胞(LN-AR)保持在包含10％FBS的Iscove′s培养基中。在药物治疗前的两天，细胞在包含10％CS-FBS的Iscove′s培养基中生长以去雄激素。细胞随后在包含10％CS-FBS以及合适浓度的R1881和增加浓度的试验化合物的Iscove′s培养基中分裂和生长。在四天培养之后，细胞生长通过MTS(Promega，Madison，WI)监控。
与报道分子分析和PSA分析一致，AR-过度表达LNCaP的生长被25μM的R1881刺激，但母体细胞不被刺激直至R1881浓度达到100μM。图2显示了所选化合物在100pM R1881存在下对激素难治的前列腺癌生长的抑制作用。目前的临床药物比卡鲁胺不抑制激素难治的前列腺癌。相反，实施例5-3b(NC2)(4-[3-(4-甲基苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基]-2-三氟甲基-苄腈)和实施例7-3b(NC7)(4-(8-氧代-6-硫代-5-(4-甲基苯基)-5，7-二氮杂螺[3.4]辛-7-基)-2-三氟甲基苄腈)高效地抑制激素难治的前列腺癌。
我们检查MTS分析中的生长抑制是否通过标靶AR而发生，实施例5-3b(NC2)(4-[3-(4-甲基苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基]-2-三氟甲基-苄腈)和实施例7-3b(NC7)(4-(8-氧代-6-硫代-5-(4-甲基苯基)-5，7-二氮杂螺[3.4]辛-7-基)-2-三氟甲基苄腈)在DU-145细胞(缺少AR表达的前列腺癌细胞系)中测试。这些化合物不具有对DU-145细胞的生长抑制作用。这些化合物不抑制除AR-表达前列腺癌细胞之外的细胞，因为它们对MCF7和SkBr3(两种常用的乳腺癌细胞)或3T3(一种正常的小鼠成纤细胞系)不具有生长作用。
二芳基硫代乙内酰脲衍生物的体外生物活性的例子在图3和4中给出。例如，基于相对萤光素酶活性，图3显示在浓度500nM下，化合物按照最大活性至最小活性的顺序分级如下NC67>NC68>NC66>NC69>NC77＝NC53>比卡鲁胺。例如，基于相对PSA水平，发现在浓度500nM下，化合物按照最大活性至最小活性的顺序分级如下NC50>NC48>NC7>NC43>NC44>NC49>NC50>NC45>比卡鲁胺。例如，基于相对MTS单元，图4显示在浓度500nM下，化合物按照最大活性至最小活性的顺序分级如下NC70>NC7>NC122>NC53>比卡鲁胺。
对激素难治的和激素敏感的前列腺癌异种移植肿瘤的抑制作用 使用本发明化合物检查二芳基乙内酰脲衍生物是否对激素难治的前列腺癌具有体内作用。首先，我们检查在由AR-过度表达LNCaP细胞确立的异种移植肿瘤上的该化合物。Matrigel(Collaborative Biomedical)中所改造的细胞被皮下注入去势雄性SCID小鼠的胁腹。肿瘤尺寸每周使用测径仪三维测定。在确立异种移植肿瘤(肿瘤尺寸至少40mm3)之后，将具有肿瘤的小鼠随机分配并用不同剂量的化合物一日一次口服治疗。对AR-过度表达LNCaP异种移植模型的生长的抑制作用研究如下。具有所确立的LN-AR异种移植肿瘤的小鼠被随机分配并用所指定的化合物一日一次口服治疗。肿瘤尺寸通过测径仪而测量。
与临床观察一致，目前的临床药物比卡鲁胺不抑制激素难治的前列腺癌的生长(与载体相同)。相反，根据本发明的化合物抑制这些肿瘤的生长，和抑制是剂量依赖性的。另外，这些化合物抑制PSA表达(激素难治的前列腺癌的临床标志物)。
本发明化合物还在激素难治的前列腺癌的另一异种移植模型，激素难治的LAPC4中测试。该模型由去势小鼠中激素敏感的前列腺癌的传代(passaging)确立，其模拟前列腺癌的临床传变(2)。类似于使用AR-过度表达LNCaP异种移植模型的发现，目前的临床药物比卡鲁胺在激素难治的LAPC4异种移植模型中不抑制生长和PSA表达(与载体相同)。相反，本发明化合物抑制这些肿瘤的生长和PSA表达。
图6给出了实验结果，其中来自LNCaP激素敏感的模型的细胞异种移植到小鼠中(106个LNCaP细胞被注入小鼠中)。第一组小鼠用NC53治疗，第二组小鼠用Casodex治疗，和第三组小鼠用载体溶液治疗。每组包括6只小鼠。小鼠用10mg/kg/天治疗。图6以作为时间函数的肿瘤体积的图给出了结果。作为对照的用载体溶液治疗的小鼠展现出最快速的肿瘤体积的增加。用Casodex治疗的小鼠和用NC53治疗的小鼠具有类似肿瘤生长速率，慢于用载体溶液治疗的小鼠。
对荷尔蒙敏感性前列腺癌细胞的生长的抑制性作用 为了确定二芳基硫代乙内酰脲衍生物是否还抑制激素敏感的前列腺癌细胞，我们通过测量线粒体活性的MTS而对LNCaP细胞的生长测试了一些选择的化合物。雄激素缺乏的LNCaP细胞用增加浓度的DMSO作为载体或试验物质在1pM R1881存在下进行处理。在4天培养之后，细胞生长通过MTS分析测量。本发明化合物以高于比卡鲁胺的效力抑制激素敏感的前列腺癌。
体内生物分析 所有动物实验按照洛杉矶加利福尼亚大学的动物研究委员会(theAnimal Research Committee of the University of California at Los Angeles)的指导方针进行。动物买自Taconic和在规定的菌群菌落的层流塔中供养。LNCaP-AR和LNCaP-载体细胞保持在补充有10％FBS的RPMI培养基中。100μl的1:1Matrigel:RPMI培养基中的106个细胞被皮下注入未受损伤或去势的雄性SCID小鼠的胁腹。肿瘤尺寸每周使用测径仪三维(长度x宽度x深度)测量。当肿瘤尺寸达到约100mm3时，小鼠被随机分配至治疗组。药物每天以10mg/kg和50mg/kg口服供给。为了得到药效(pharmacodynamic)读出，动物在最后的剂量的治疗之后3小时时通过光学CCD照相机成像。在肿瘤上画出ROI用于萤光素酶活性测量，以光子/秒计。右面表示ROI测量。数据在图7和8中给出。在18天中NC53有效地防止肿瘤生长和甚至造成肿瘤收缩，和明显比比卡鲁胺更有效。
比卡鲁胺、4-[7-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂-螺[3.4]辛-5-基]-甲苯[NC7]、N-甲基-4-{4-[7-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂-螺[3.4]辛-5-基]苯基}丁酰胺[NC48]和N-甲基-4-[7-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂-螺[3.4]辛-5-基]-2-氟苯甲酰胺(52d)[NC53]的药代动力学使用购自Charles River Laboratories的8周龄FVB小鼠进行体内评估。小鼠分成三组用于每一时间点。两只小鼠未用药物治疗，和另两只小鼠用载体溶液处理。每组用10mg/千克体重治疗。
药物溶解在DMSO:PEG400:H2O的1:5:14混合物(载体溶液)中和通过尾部静脉向小鼠给药。在治疗之前，将动物在热灯下加温约20分钟使其尾部静脉扩大。每只小鼠放在小鼠限制器(Fisher Sci.Cat#01-288-32A)中和向扩张的尾部静脉中注入200μl在载体溶液中的药物。在药物给药之后，对动物在以下不同的时间点通过CO2吸入进行无痛致死5分钟、30分钟、2小时、6小时、16小时。动物在暴露于CO2之后通过心脏穿刺(1ml BD注射器+27G5/8针)而立即放血。对于口服剂量，在通过加料注射器口服给药之前，将药物溶解在DMSO:羧甲基纤维素Tween 80:H2O的50:10:1:989的混合物中。
将血清样品通过配有Alltima C18柱(3μ，150mm x 4.6mm)的HPLC(Waters 600泵、Waters 600控制器和Waters 2487检测器)分析以测定药物浓度。NC7、NC48和NC53化合物在254nm波长处检测和比卡鲁胺在270nm波长处检测。
用于HPLC分析的样品根据以下程序制备 -血液细胞通过离心从血清中分离。
-向400μl血清中加入80μl内标的10μM溶液和520μl乙腈。发生沉淀。
-将混合物涡旋3分钟并随后在超声下放置30分钟。
-将固体颗粒滤出或通过离心分离。
-将滤液在氩流动下干燥至干燥状态。在通过HPLC分析以测定药物浓度之前，将样品用乙腈重构成80μl。
-使用药物的标准曲线以改善精确度。
由静脉内和口服给药得到的作为时间函数的NC53在血浆中的浓度在图9中给出。比卡鲁胺、NC48和NC53的稳定态浓度(Css)示于表4。NC53的稳定态浓度基本上与比卡鲁胺一样好，和基本上优于NC48。
表4比卡鲁胺、NC48和NC53在小鼠血浆中的稳态浓度。
雄激素受体活性可包括雄激素受体行为的刺激和抑制的几个方面，包括，但不限于，以下在AR响应报道分子系统或前列腺特异性抗原分泌体系中的抑制浓度(IC50)；与AR响应报道分子系统或前列腺特异性抗原分泌体系中的增加浓度有关的诱导倍数；在动物中的相关肿瘤生长；雄激素受体与化合物的结合亲合性；雄激素受体向前列腺特异性抗原增强子或前列腺特异性抗原启动子的募集；雄激素受体核易位；和雄激素受体蛋白质的不稳定作用。
体外分析 图10给出了化合物对小鼠雄激素受体(小鼠AR)的配体结合域的相对结合亲和性，如使用竞争者分析试剂盒(Invitrogen)确定的。荧光偏振用作读出。每一激素剂量一式三份地进行和相对误差通过由平均值计算三个值的标准误差而确定。该研究控制用于最小竞争(单独的载体)、无受体、无荧光配体和最大竞争(10-5M R1881、黄体酮、E2或地塞米松)。使用单结合位点竞争模型拟合曲线(使用Prism统计分析软件包。R1881具有最低的平衡离解常数，Ki＝4nM(和因此小鼠雄激素受体对于所测试的四种化合物中的R1881具有最高的亲合性)。RU59063具有平衡离解常数Ki＝20nM，和NC53具有平衡离解常数Ki＝0.8μM。Casodex具有平衡离解常数Ki＝0.4μM(和因此小鼠雄激素受体对于所测试的四种化合物中的Casodex具有最低的亲合性)。NC53和Casodex具有类似平衡离解常数，和因此，小鼠雄激素受体对于这些化合物具有类似的亲合性。
NC53防止雄激素受体(AR)和RNA聚合酶II(Pol II)向PSA增强子和PSA启动子的募集。图11给出了研究结果。所用材料是具有AR(Upstate，cat#06-680)和Pol II(Covance，cat#MMS-126R)的Chromatin IP。LNCaP(ATCC)细胞在全血清中制板(plate)。在实验那天，将板用1x PBS洗涤一次，和加入5％CSS3天。对于第一组实验，加入10μM NC53(R)，对于第二组实验，加入10μM比卡鲁胺(C)，和对于第三组实验，加入1nM R1881(+)。这些化合物各自加入6小时。在第四组实验中，加入对照物，无额外的化合物(-)。6小时时间点在28个循环处运行。使用来自Upstate的ChIP试剂盒(cat#17-295)。增强子和启动子引物分别得自Louie(PNAS 2003 Vol.100，pp.2226-2230)和Shang(Molecular Cell 2002 vol.9，pp.601-610)。对于其中加入NC53(R)的实验的较暗图像表明NC53防止雄激素受体和防止RNA聚合酶II在前列腺特异性抗原(PSA)基因上形成转录复合物。相反，对于其中加入比卡鲁胺(Casodex，C)的实验的较亮图像表明在比卡鲁胺存在下，雄激素受体和RNA聚合酶II仍募集到PSA成分以转录PSA mRNA。
NC53抑制LNCaP细胞中的雄激素受体核易位。图12和13给出了研究的结果。LNCaP细胞在5％CSS中制板。第一组细胞用10μM NC53(R)处理，第二组细胞用10μM比卡鲁胺(C)处理，和第三组细胞用1nM R1881(+)处理。第四组细胞用作对照物(-)。TOPO I(Santa Cruz，cat#sc-32736)用于控制核部分，和GAPDH(Santa Cruz，cat#sc-20357)用于控制细胞质部分。LNCaP细胞被采集用于亚细胞分级或用对雄激素受体(AR)的FITC(Santa Cruz)标记的抗体(Santa Cruz，cat#sc-815)染色(stain)。由亚细胞分级得到图像，如图12所示。对于比卡鲁胺(Casodex，C)处理样品的核部分中的较暗图像表明，比卡鲁胺诱导雄激素受体核易位。对于NC53处理样品的亮图像表明，NC53取消了核易位。对于AR-FITC分析，使用含DAPI的培养基将盖片安装在载玻片上，和使用荧光Nikon显微镜在x60下以对于DAPI和FITC的滤光器在24小时之后对细胞进行成像。在AR-FITC分析中，R1881和比卡鲁胺处理的细胞的核明显是绿色的，如图13所示，表明雄激素受体发生核易位。相反，DMSO和NC53处理的细胞的核绿色较淡的。
NC53使LNCaP细胞中的雄激素受体蛋白质不稳定。图14给出了研究的结果。该研究通过将105LNCaP(fgc)细胞在5％CSS中制板3天而进行。将100pM R1881加入第一组细胞(+)，将10μM比卡鲁胺加入第二组细胞(B)，将10μM NC53加入第三组细胞(RD)，将100pM R1881和10μM比卡鲁胺加入第四组细胞(B+)，和将100pM R1881和10μM NC53加入第五组细胞(RD+)。R1881、比卡鲁胺或NC53都不加入第六组细胞(-)。细胞与加入比卡鲁胺、NC53和/或R1881一起存在24小时(或在(-)组的情况下，在没有任何这些的情况下24小时)。在图14中，对于加入比卡鲁胺(B)的组和对于加入比卡鲁胺和R1881(B+)的组的暗图像表明，当加入这些化合物的组合时，雄激素受体蛋白质是同一水平的。相反，对于加入NC53(RD)的组和对于加入NC53和R1881(RD+)的组的亮图像表面，NC53的加入导致雄激素受体蛋白质的退化，无论R1881是否存在。
各等级化合物的分等 表5-10给出了分成等级1-6的二芳基乙内酰脲化合物。表11给出了未放入等级中的二芳基乙内酰脲化合物。将化合物分为各等级是基于可得数据以及分析判断。所考虑的数据包括体外分析(在LNCaP细胞系中的AR响应报道分子系统、PSA水平测量、MTS线粒体分析)和体内试验(直接测量的肿瘤尺寸或通过萤光素酶报道基因所诱导的发射、基于血液血浆水平的药代动力学分析)。不是每一化合物都进行每一分析。不是所产生的所有数据都给出。在根据它们在治疗前列腺癌中的效用对化合物相对于彼此进行分等时，尤其是当对未进行相同试验的两种化合物分等时，进行判断。在确立分等时所考虑的特征包括AR拮抗作用活性、在激素难治的细胞中AR激动作用的缺乏、防止肿瘤生长、肿瘤收缩和药代动力学行为，且在血液中较长的停留时间是有利的。
等级1 通常，等级1化合物是在右乙内酰脲碳上被二取代的具有二取代的左手芳基环的二芳基硫代乙内酰脲，和在左乙内酰脲碳上具有氧或N取代基。预计酰氨基取代基在例如生物体系所遇到的水溶液中体外和体内水解成氧。NC63因在左手芳基环上具有碘代替CF3取代基而具有良好活性。
判断等级1化合物(见表5)对于治疗前列腺癌比比卡鲁胺好得多。但发现NC7和NC48代谢快，即在血液中具有短停留时间。NC53具有期望的药代动力学。
图16显示，在用比卡鲁胺处理时，对于LNCaP细胞的PSA水平相对用载体溶液处理时保持相同或增加，而在用NC53处理时，PSA水平下降。图17说明，在用载体溶液处理时，肿瘤尺寸继续增加。相反，在用NC53在剂量1mg/kg体重/天下处理时，肿瘤增加的速率下降，和肿瘤尺寸在约17天之后似乎稳定。在用NC53在剂量10mg/kg体重/天下处理时，肿瘤尺寸随着时间而减小。图18说明，在用NC53在剂量10mg/kg体重/天下处理时，与萤光素酶活性有关的光子发射下降。图19显示，在该剂量下的NC53处理导致肿瘤尺寸的减小或稳定和与萤光素酶活性有关的光子发射的下降。
图20显示，在用NC53、NC54、NC55、NC56和NC57在剂量100、200、500和1000nM下处理时，LN-AR细胞的PSA水平下降。另外，剂量越高，PSA水平越低。图22给出了对未受损伤和去势小鼠在初始时和用比卡鲁胺或用NC53治疗14天之后的泌尿生殖道重量和与萤光素酶活性有关的光子发射速率。重量和光子发射速率对于未受损伤和去势小鼠都增加。相对未治疗的去势小鼠，用NC53治疗去势小鼠导致重量和光子发射的下降，如同用比卡鲁胺治疗的那样。
因此，等级1化合物对于用作AR拮抗剂和用作用于激素难治的前列腺癌的治疗剂是特别有利的。它们可用于治疗其它AR相关疾病或病况如良性前列腺增生、头发损失和粉刺。这些和相关化合物也可用作其它核受体如糖皮质激素受体、雌激素受体和过氧化物酶体增殖剂-活化的受体的调节剂，和用作其中核受体发挥作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心脏疾病和新陈代谢相关疾病的治疗剂。它们可用于分析如作为标准，或作为中间体或前药。
表5
等级2 等级2化合物(参见表6)对于治疗前列腺癌明显好于比卡鲁胺，尽管有迹象NC12可作为激动剂。图3说明，在浓度125nM至1000nM下给药的等级1中的化合物NC66、NC67、NC68、NC53和NC69和等级2中的NC57起到降低LNCaP-AR细胞的萤光素酶活性的作用，而DMSO和比卡鲁胺的对照溶液具有很小的作用或不具有作用。发现在浓度1000nM下，等级1中的化合物NC7和NC48与等级2中的NC43、NC44和NC50相比造成LNCaP-AR细胞的PSA水平的更大下降。图7给出了随着时间的肿瘤体积，和说明在用比卡鲁胺或载体溶液处理时，肿瘤继续生长，而在用等级1中的NC53处理时，肿瘤尺寸下降。图8说明相对于用载体溶液处理，在用比卡鲁胺处理时与萤光素酶活性有关的光子发射保持大约相同或增加，而在用NC53处理时光子发射下降。图23说明在用比卡鲁胺处理时，PSA水平下降很小或不下降，而在用NC48和NC53处理时，PSA水平下降。图24说明，等级1中的NC7、NC48和NC53的IC50比比卡鲁胺的IC50低得多。
通常，等级2化合物在结构上类似于等级1化合物，但在右手芳基环上具有不同的取代基。等级2化合物对于用作AR拮抗剂和用作用于激素难治的前列腺癌的治疗剂是有利的。它们可用于治疗其它AR相关疾病或病况如良性前列腺增生、头发损失和粉刺。这些和相关化合物也可用作其它核受体如雌激素受体和过氧物酶体增殖剂-活化的受体的调节剂，和用作其中核受体发挥作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心脏疾病和新陈代谢相关疾病的治疗剂。它们可用于分析如作为标准，或作为中间体或前药。
表6
等级3 判断等级3化合物(参见表7)对于治疗前列腺癌稍好于比卡鲁胺。NC43、NC44和NC50(等级2中)与等级3中的NC45和NC49相比造成LNCaP-AR细胞的PSA水平更大下降。所有这些化合物造成大于比卡鲁胺的PSA水平下降。
其它等级3化合物(未示出)不是二芳基硫代乙内酰脲，和在活性上相当于现有技术单芳基乙内酰脲化合物NC83、NC79和NC80。
因此，等级3化合物可用作AR拮抗剂，和用作用于激素难治的前列腺癌的治疗剂。它们可用于治疗其它AR相关疾病或病况如良性前列腺增生、头发损失和粉刺。这些和相关化合物也可用作其它核受体如雌激素受体、和过氧物酶体增殖剂-活化的受体的调节剂，和用作其中核受体发挥作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心脏疾病和新陈代谢相关疾病的治疗剂。它们可用于分析如作为标准，或作为中间体或前药。
表7
等级4 判断等级4化合物(参见表8)对于治疗前列腺癌不优于比卡鲁胺。等级4的NC93和NC94和等级1的NC7，例如，仅在乙内酰脲环的下右碳上的取代基上不同。右手芳基环上的取代基也可影响活性。
一些等级4化合物(包括所示的那些和其他未示出的)不是二芳基化合物(缺少右手芳基环)，不是硫代乙内酰脲，在乙内酰脲环的下右手的碳上未被二取代，和/或在乙内酰脲环的下左手碳上具有不同于氧或酰氨基的取代基。这提供了在乙内酰脲环的下右手碳上被二取代和在乙内酰脲环的下左手碳上具有氧或酰氨基的二芳基硫代乙内酰脲的预料不到的优点的证据。
因此，等级4化合物可用作AR拮抗剂，和用作用于激素难治的前列腺癌的治疗剂，至少达到它们相当于比卡鲁胺的程度。它们可用于治疗其它AR相关疾病或病况如良性前列腺增生、头发损失和粉刺。这些和相关化合物也可用作其它核受体如雌激素受体和过氧物酶体增殖剂-活化的受体的调节剂，和用作其中核受体发挥作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心脏疾病和新陈代谢相关疾病的治疗剂。它们可用于分析如作为标准，或作为中间体或前药。
表8
等级5 等级5化合物(参见表9)是非活性的或几乎非活性的，和因此对于治疗前列腺癌比比卡鲁胺差。右手芳基环上的取代基对于确定活性是重要的。
一些等级5化合物(所示的一些和未示出的一些)不是二芳基化合物(缺少右手芳基环)，不是硫代乙内酰脲，在乙内酰脲环的下右手的碳上未被二取代，和/或在乙内酰脲环的下左手碳上具有不同于氧或酰氨基的取代基。这提供了在乙内酰脲环的下右手碳上被二取代和在乙内酰脲环的下左手碳上具有氧或酰氨基的二芳基硫代乙内酰脲的预料不到的优点的证据。尤其是，在NC103、NC104和NC106中的端取代基(CH2NRxRy，其中Rx，y＝H或甲基)不被认为有助于这些化合物的活性。
等级5化合物对于治疗前列腺癌或作为AR拮抗剂不是理想的，尽管这些和相关化合物可用作其它核受体如雌激素受体和过氧物酶体增殖剂-活化的受体的调节剂，和用作其中核受体发挥作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心脏疾病和新陈代谢相关疾病的治疗剂。它们可用于分析如作为标准，或作为中间体或前药。
表9
等级6 等级6化合物(参见表10)是非活性或几乎非活性的，而且是强激动剂，和因此对于治疗前列腺癌比比卡鲁胺差得多。相对于本发明化合物，对比化合物分等为非常差。特别地，NC107因在左手芳基环上具有氯取代基而具有非常差的活性，而具有三氟甲烷的NC2和具有碘的NC63分等在等级1中。等级6化合物的结果提供了在乙内酰脲环的下右手碳上被二取代和在乙内酰脲环的下左手碳的具有氧或酰氨基，和在左手芳基环上具有某些取代基的二芳基硫代乙内酰脲的预料不到的优点的证据。
等级6化合物对于治疗前列腺癌或作为AR拮抗剂是不理想的。
表10
未分等级的化合物 对于几种化合物，实验数据不足以对它们分等。这些未分等级的化合物在表11中给出。
基于本发明的数据和方法，和基于许多化合物(包括本文未示出的一些)的观察进行判断，可以对未分等级的化合物进行一些评论。预计对比例NC108与对比例NC78-NC80一起在等级3中。预计NC113水解成NC7(等级1)，和应该因此具有相当的活性。预计NC114水解成NC16(等级1)，和应该因此具有相当的活性。预计NC115水解成NC3(等级1)，和预计NC120和NC121水解成NC50(等级2)，和它们应该因此具有相当的活性。
表11
简而言之，表明在治疗前列腺癌方面远优于比卡鲁胺的新型化合物被确认和制造。
化合物的抗癌活性对结构差异的敏感度 发明人已经确定，看起来似乎是乙内酰脲化合物结构上小的变化可导致化合物在治疗前列腺癌的性能上大的改变。例如，NC77和NC53的不同仅在于芳基环上的单氟取代基，和NC53在等级1中，而NC77在等级2中，两者对于治疗前列腺癌都优于比卡鲁胺，但NC53是优异的。但是，与NC77不同仅在于在甲基氨基甲酰基和芳基环之间具有额外的碳原子的NC98对于治疗前列腺癌不优于比卡鲁胺和分等在等级4中。NC77、NC53和NC98对萤光素酶活性的作用可在图25中看出。在给定的化合物浓度下，暴露于NC77和NC53的萤光素酶活性低于暴露于NC98时的萤光素酶活性。
NC4与NC3的不同仅在于氨基被羟基代替。但NC3在等级1中，对于治疗前列腺癌比比卡鲁胺好得多，而NC4在等级4中，不优于比卡鲁胺。NC3和NC4对在1AR细胞系的萤光素酶活性的作用通过将各种化合物在浓度1.25至10μmol下给药和观察PSA水平而研究。对于给定的剂量，暴露于NC3的萤光素酶活性小于暴露于NC4的萤光素酶活性。NC3和NC4对在4AR细胞系的萤光素酶活性的作用通过将各种化合物在浓度1.25至10μmol下给药和观察PSA水平而研究。对于给定的剂量，暴露于NC3的萤光素酶活性小于暴露于NC4的萤光素酶活性。NC3和NC4对在LN/AR细胞系的萤光素酶活性的作用通过将各种化合物在浓度1.25至10μmol下给药和观察PSA水平而研究。对于给定的剂量，暴露于NC3的PSA水平小于暴露于NC4的PSA水平。
NC47和NC48彼此不同于仅在于氨基甲酰基末端上的甲基取代基和这两种化合物分等在等级1中，尽管发现NC48是特别有利的。NC46与NC47相同，除了甲氧基被氨基代替。但是，NC46分等在等级3中。NC42类似于NC46，但在将酯基连接至芳基环的链中少一个碳；NC42分等在等级3中。NC47、NC48、NC42和NC46对在LN/AR细胞系的PSA水平的作用通过将各种化合物在浓度125nmol至1000nmol下给药和观察PSA水平而研究。对于给定浓度，暴露于NC47和NC48的PSA水平低于暴露于NC42和NC46的PSA水平。
NC68和NC103的相互区别在于，前者具有连接到芳基环上的甲基氨基甲酰基基团和连接到硫代乙内酰脲基团上的二甲基取代基，而后者具有连接到右手芳基环上的甲基氨基基团和连接到硫代乙内酰脲基团上的环丁基取代基。但NC68在等级1，明显优于比卡鲁胺用于治疗前列腺癌，NC103在等级5，在治疗前列腺癌时无活性或几乎无活性。NC68和NC103在LN/AR细胞系中对萤光素酶活性的作用通过将各种化合物在浓度125nmol至1000nmol下给药和观察萤光素酶活性而研究。对于给定的浓度，暴露于NC68的萤光素酶活性不如暴露于NC103的萤光素酶活性。
NC16和NC18相互区别在于，将硫代替换为氧代基团和二甲基取代基替换为环丁基取代基。但NC16在等级1，NC18在等级4。
药物组合物和给药 本发明化合物可用作使用治疗有效量本文所限定的本发明化合物和可药用载体或稀释剂制备的药物组合物。
本发明二芳基乙内酰脲化合物可被配制成药物组合物和以适用于所选给药途经的各种形式向需要治疗的患者例如哺乳动物如人患者给药，例如口服给药、鼻内给药、腹膜内给药、或非消化道给药、通过静脉内、肌内、局部或皮下路径给药、或通过注入组织给药。
因此，本发明二芳基乙内酰脲化合物可与可药用载体如惰性稀释剂或可同化的食用载体一起例如口服而系统给药，或通过吸入或吹入法而系统给药。它们可被包封在硬或软壳明胶胶囊中，可被压成片剂，或可直接与病人饮食的食品混合。对于口服治疗给药，化合物可与一种或多种赋形剂组合和以可摄取的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、干胶片(wafer)等的形式使用。二芳基乙内酰脲化合物可与细的惰性粉状载体组合和由患者吸入或吹入。这种组合物和制剂应该包含至少0.1％的二芳基乙内酰脲化合物。组合物和制剂的百分数当然可以变化和可适宜地在给定单元剂型的约2％至约60％重量之间。二芳基乙内酰脲化合物在这种治疗有用的组合物中的量使得获得有效的剂量水平。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可包含以下粘合剂如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；和甜味剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或可加入芳香剂如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单元剂型是胶囊时，除了以上类型的材料，它还可包含液体载体如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可存在作为涂层或以其它方式改变固体单元剂型的外形(physicalform)。例如，片剂、丸剂或胶囊可涂有明胶、蜡、虫胶或糖等。糖浆或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料、和调味剂如樱桃或橙子调味剂。当然，用于制备任何单元剂型的任何材料在用量上应该是可药用的和实质上无毒的。另外，二芳基乙内酰脲化合物可引入持续释放制剂和设备。例如，二芳基乙内酰脲化合物可引入延时释放胶囊、延时释放片剂和延时释放丸剂。
二芳基乙内酰脲化合物也可通过输注或注射而静脉内或腹膜内给药。二芳基乙内酰脲化合物的溶液可在水中制备，任选地与非毒性表面活性剂混合。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇、三醋汀、和其混合物中和在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可包含防腐剂以防止微生物生长。
适用于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散体或无菌粉末，其包含任选地包封在脂质体中的适用于即时制备无菌的可注射或可输注的溶液或分散体的本发明化合物。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下应该是无菌的、流动的和稳定的。液体载体可以是溶剂或液体介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、非毒性甘油酯、和其合适的混合物。合适的流动性可例如通过形成脂质体、在分散体情况下通过保持所需颗粒尺寸或通过使用表面活性剂而保持。可通过各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等产生预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂例如糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而产生。
无菌可注射溶液通过将所需量的二芳基乙内酰脲化合物与以上列举的各种其它成分(根据需要)一起引入合适溶剂中，随后过滤杀菌而制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上存在于之前无菌过滤溶液中的任何其它的所需成分的粉末。
对于局部给药，二芳基乙内酰脲化合物可以纯的形式施用。但是，通常期望将它们作为组合物或制剂与可以是固体或液体的皮肤学上可接受载体一起向皮肤给药。
有用的固体载体包括细分散的固体如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、矾土等。其它固体载体包括非毒性聚合物纳米颗粒或微颗粒。有用的液体载体包括水、醇或二醇或水/醇/二醇共混物，其中二芳基乙内酰脲化合物可在有效的水平下任选地借助于非毒性表面活性剂而溶解或分散。可加入助剂如香料和另外的抗微生物剂以针对给定用途而优化性能。所得液体组合物可由吸收剂垫施用、用于浸渍绷带和其它敷料、或使用泵-型或气溶胶喷雾器喷雾到受影响的区域上。
增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性的纤维素或改性的矿物材料也可与液体载体一起使用以形成可铺展的糊、凝胶、软膏、皂等，用于直接施用到使用者的皮肤上。
可用于将二芳基乙内酰脲化合物传输至皮肤上的有用的皮肤组合物的例子是本领域已知的；例如，参见Jacquet等人(美国专利No.4,608,392)、Geria(美国专利No.4,992,478)、Smith等人(美国专利No.4,559,157)和Wortzman(美国专利No.4,820,508)，其全部在此作为参考并入本发明。
式I的化合物的有用剂量可通过比较其体外活性和通过在动物模型中比较其体内活性而确定。用于将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人体的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利No.4,938,949，其在此作为参考并入本发明。
例如，二芳基乙内酰脲化合物在液体组合物如洗剂中的浓度可以是约0.1至25％重量，或约0.5至10％重量。在半固体或固体组合物如凝胶或粉末中的浓度可以是约0.1至5％重量，或约0.5至2.5％重量。
二芳基乙内酰脲化合物用于治疗所需的量不仅随着所选的特定盐变化，而且随着给药路径、正在治疗的病况的性质以及病人的年龄和病况而变化，且最终由主治医师(attendant physician)或临床医师决定。
本发明试剂给药的有效剂量和路径是常规的。试剂的精确量(有效剂量)因患者不同而变化，取决于例如患者的种类、年龄、重量和一般或临床状态、正在治疗的任何病症的严重性或机理、所用的特定试剂或载体、给药的方法和进度等。治疗有效剂量可通过本领域技术人员已知的常规程序经验地确定。参见如The Pharmacological Basis of Therapeutics，Goodman andGilman，eds.，Macmillan Publishing Co.，New York。例如，有效剂量可起始在细胞培养物分析中或在合适的动物模型中估计。动物模型也可用于确定给药的合适浓度范围和路径。这种信息可随后用于确定用于人体给药的有用剂量和路径。治疗剂量也可对类似的治疗剂的剂量用类推的方法选择。
特殊给药模式和给药方案由主治临床医师考虑到情况的详情(如患者、疾病、所涉及的疾病状态和该治疗是否是预防性的)而选择。治疗可涉及在几天至数月或甚至数年内化合物的日剂量或多-日剂量(multi-daily dose)。
但一般来说，合适的剂量可以是约0.001至约100mg/kg/天，如约0.01至约100mg/kg体重/天，如大于约1mg/千克/天，或约1至约10mg/kg受者体重/天。例如，合适的剂量可以是约1mg/kg、10mg/kg或50mg/kg体重/天。
本发明化合物便利地以单元剂型给药；例如，每单元剂型包含0.05至10000mg、0.5至10000mg、5至1000mg、或约100mg活性成分。
二芳基乙内酰脲化合物可给药以实现例如约0.5至约75μM、约1至50μM、约2至约30μM、或约5至约25μM的血浆浓度峰值。示例性的期望血浆浓度包括至少或不超过(at least or no more than，大约)0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100或200μM。例如，血浆水平可为约1-100微摩尔或约10至约25微摩尔。这可例如通过以下实现静脉注射二芳基乙内酰脲化合物的0.05-5％溶液(任选地在盐水中)，或以包含约1-100mg二芳基乙内酰脲化合物的大丸剂口服给药。期望的血液水平可通过连续输注以提供约0.00005至5mg/kg体重/小时，例如至少或不超过0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5或5mg/kg/小时而保持。或者，这种水平可通过包含约0.0002至20mg/kg体重，例如至少或不超过0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20或50mg二芳基乙内酰脲化合物/kg体重的间歇输注而得到。
二芳基乙内酰脲化合物可便利地以单剂量供给或作为在合适的间隔给药的分剂量例如作为2、3、4或更多子剂量(sub-dose)/天供给。子剂量自身可进一步例如分成许多离散的松散分开的给药；如从吹入器多次吸入。
许多以上确定的化合物对于激素难治的前列腺癌细胞展现出很小的或没有激动活性。因为这些化合物是强AR抑制剂，它们可不仅用于治疗前列腺癌，而且用于治疗其它AR相关疾病或病况如良性前列腺增生、头发损失和粉刺。因为AR属于核受体类，这些化合物可作为用于标靶其它核受体如雌激素受体和过氧物酶体增殖剂-活化的受体的药物合成的骨架。因此，它们可被进一步开发用于其中核受体发挥作用的其它疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心脏疾病和新陈代谢相关疾病。
以下给出根据本发明的几种化合物的化学合成顺序。氰醇10abc通过与三种不同的苯胺11abc反应转化成四种不同的氰胺12abcd(10a和11a得到12a，10b和11a得到12b，10c和11b得到12c，和10c和11c得到12d)。在分离工艺中，苯胺13在一个步骤中被转化成异硫氰酸盐14，将12abcd加入14，随后用温和酸处理，以良好产率得到所需硫代乙内酰脲4(NC54)、5(NC55)、6(NC56)和7。
在该说明书中说明和讨论的实施方案仅意味着向本领域熟练技术人员教导发明人所知晓的制备和使用本发明的最佳方法。该说明书决不应被看作对本发明范围的限定。所给出的所有实施例是代表性和非限定性的。本发明的上述实施方案可在不背离本发明的情况下被改进或变化，这是本领域熟练技术人员根据以上教导所理解的。因此可以理解，在权利要求和其等同物的范围内，本发明可以具体描述之外的方式实现。
权利要求
1.具有下式的化合物
其中R1和R2独立地是甲基或，与它们所连接的碳一起形成4至5个碳原子的环烷基，
其中R3选自氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基烷基、烷基氨基甲酰基烷基、氰基和氰基烷基，和
其中R4是氢或氟。
2.药物组合物，包含治疗有效量根据权利要求1的化合物或其可药用盐，和可药用载体或稀释剂。
3.权利要求1的化合物，具有下式
4.权利要求1的化合物，具有下式
5.药物组合物，包含治疗有效量根据权利要求4的化合物或其可药用盐，和可药用载体或稀释剂。
6.权利要求1的化合物，具有下式
7.药物组合物，包含治疗有效量的权利要求6的化合物或其可药用盐，和可药用载体或稀释剂。
8.权利要求1的化合物，具有下式
9.权利要求1的化合物，具有下式
10.一种用于治疗过度增生病症的方法，包括将权利要求2的药物组合物向需要这种治疗的患者给药，由此治疗过度增生病症。
11.权利要求10的方法，其中组合物具有选自溶液、分散体、悬浮液、粉末、胶囊、片剂、丸剂、延时释放胶囊、延时释放片剂和延时释放丸剂的形式。
12.权利要求10的方法，其中化合物通过静脉内注射、通过注入组织、腹膜内、口服、或鼻内给药。
13.权利要求10的方法，其中组合物以约0.001mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的化合物剂量给药。
14.权利要求10的方法，其中组合物以约0.01mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的化合物剂量给药。
15.权利要求10的方法，其中组合物以约0.1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天的化合物剂量给药。
16.权利要求10的方法，其中组合物以约1mg/kg体重/天的化合物剂量给药。
17.一种用于治疗前列腺癌的方法，包括将根据权利要求2的组合物向需要这种治疗的患者给药，由此治疗前列腺癌。
18.权利要求10的方法，其中药物组合物干扰前列腺特异性抗原mRNA的转录。
19.权利要求10的方法，其中药物组合物防止雄激素受体蛋白质的核易位。
20.权利要求10的方法，其中药物组合物使雄激素受体蛋白质不稳定。
21.权利要求10的方法，其中组合物以口服给药。
22.权利要求10的方法，其中组合物具有选自胶囊、片剂和丸剂的形式。
23.权利要求10的方法，其中化合物选自NC54、NC55、NC56、NC57、这些中任一种的可药用盐、和其组合。
24.权利要求10的方法，其中化合物是NC53或可药用盐。
25.合成下式二芳基化合物的方法
包括将化合物I
化合物I
与化合物II
化合物II
在第一极性溶剂中混合以形成混合物，
加热该混合物，
将与第一极性溶剂相同或不同的第二极性溶剂和含水酸加入该混合物，
回流该混合物，
冷却该混合物并与水混合，和
从该混合物中分离该二芳基化合物，
其中R51包括具有1至4个碳原子的烷基链，R52选自氰基、羟基、甲基氨基甲酰基、甲基氨基甲酰基-取代的烷基、甲基砜氨基甲酰基-取代的烷基、甲基氨基甲基、二甲基氨基甲基、甲基磺酰氧基甲基、甲氧基羰基、3-氰基-4-三氟甲基苯基氨基甲酰基、氨基甲酰基-取代的烷基、羧甲基、甲氧基羰基甲基、甲磺酰基、4-氰基-3-三氟甲基苯基氨基甲酰基-取代的烷基、羧基-取代的烷基、4-甲磺酰基-1-哌嗪基、哌嗪基、羟乙基氨基甲酰基-取代的烷基、和羟基乙氧基羰基-取代的烷基，和R53选自F和H。
26.权利要求25的方法，其中R51包括1至2个碳原子的烷基链，R52选自氨基甲酰基和甲基氨基甲酰基，和R53是F。
27.合成下式化合物的方法
包括将4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈和N-甲基-4-(1-氰基环丁基氨基)-2-氟苯甲酰胺在二甲基甲酰胺中混合以形成第一混合物，
加热该第一混合物以形成第二混合物，
将醇和酸加入该第二混合物以形成第三混合物，
回流该第三混合物以形成第四混合物，
冷却该第四混合物，
将该第四混合物与水混合和提取有机层；
从该有机层中分离该化合物。
28.合成权利要求4的化合物[NC54]的方法，包括
将N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺和4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈在DMF中混合和加热以形成第一混合物；
将醇和酸加入该第一混合物以形成第二混合物；
回流该第二混合物；
冷却该第二混合物，
将该第二混合物与水混合和提取有机层；
从该有机层中分离该化合物。
29.合成权利要求6的化合物[NC55]的方法，包括
将N-甲基-2-氟-4-(1，1-氰基环戊基)氨基苯甲酰胺、4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈和DMF混合和在回流下加热以形成第一混合物；
将醇和酸加入该第一混合物以形成第二混合物；
回流该第二混合物；
冷却第二混合物；
将该第二混合物与水混合和提取有机层；
从该有机层中分离该化合物。
30.合成权利要求8的化合物[NC56]的方法，包括
将N，N-二甲基4-[4-(1-氰基环丁基氨基)苯基]丁酰胺、4-异硫代氰酸基-2-三氟甲基苄腈和DMF混合和在回流下加热以形成第一混合物；
将醇和酸加入该第一混合物以形成第二混合物；
回流该第二混合物；
冷却该第二混合物；
将该第二混合物与水混合和提取有机层；
从该有机层中分离该化合物。
31.合成权利要求9的化合物[NC57]的方法，包括
将DMSO、二氯甲烷和草酰氯混合以形成第一混合物，
将4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮杂螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酰胺加入该第一混合物以形成第二混合物；
将三乙胺加入该第二混合物以形成第三混合物；
加温该第三混合物和用含水NH4Cl猝灭以形成第四混合物；
从该第四混合物中提取有机层；
从该有机层中分离该化合物。
32.一种方法，包括
提供至少一种二芳基硫代乙内酰脲化合物；
测量该化合物对雄激素受体活性的抑制和确定该抑制是否在第一预定水平之上，
测量该化合物对在激素难治的癌细胞中的雄激素受体活性的刺激和确定该刺激是否在第二预定水平之下，
如果该抑制在第一预定水平之上和该刺激在第二预定水平之下，则选择该化合物。
33.权利要求32的方法，其中所述预定水平是比卡鲁胺的那些水平。
34.权利要求32的方法，其中测量抑制的步骤包括在AR响应报道分子系统或前列腺特异性抗原分泌体系中测量抑制浓度(IC50)。
35.权利要求32的方法，其中测量刺激的步骤包括通过在AR响应报道分子系统或前列腺特异性抗原分泌体系中增加浓度测量诱导倍数。
36.权利要求32的方法，其中测量抑制和/或刺激的步骤包括测量该化合物对动物中的肿瘤生长的作用。
37.权利要求32的方法，其中测量雄激素受体活性的抑制和/或刺激的步骤包括测量雄激素受体与该化合物的结合亲合性。
38.权利要求32的方法，其中测量雄激素受体活性的抑制和/或刺激的步骤包括测量对雄激素受体向前列腺特异性抗原增强子和前列腺特异性抗原启动子中的至少一种的募集的防止。
39.权利要求32的方法，其中测量雄激素受体活性的抑制和/或刺激的步骤包括测量对雄激素受体核易位的防止。
40.权利要求32的方法，其中测量雄激素受体活性的抑制和/或刺激的步骤包括测量雄激素受体蛋白质的不稳定作用。
41.权利要求32的方法，其中二芳基硫代乙内酰脲化合物具有下式
其中R1和R2独立地是甲基或，与它们所连接的碳一起形成4至5个碳原子的环烷基，
其中R3选自氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基烷基、烷基氨基甲酰基烷基、氰基和氰基烷基，和
其中R4是氢或氟。
42.一种方法，包括将能够表达前列腺特异性抗原的哺乳动物细胞与足量的二芳基硫代乙内酰脲化合物接触以干扰前列腺特异性抗原mRNA的转录。
43.权利要求42的方法，其中二芳基硫代乙内酰脲化合物具有下式
其中R1和R2独立地是甲基或，与它们所连接的碳一起形成4至5个碳原子的环烷基，
其中R3选自氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基烷基、烷基氨基甲酰基烷基、氰基和氰基烷基，和
其中R4是氢或氟。
44.权利要求42的方法，其中二芳基硫代乙内酰脲化合物选自NC53、NC54、NC55、NC56和NC57。
45.权利要求42的方法，其中化合物防止转录复合物在前列腺特异性抗原基因上形成。
46.权利要求42的方法，其中化合物防止雄激素受体蛋白质与前列腺特异性抗原基因复合。
47.权利要求42的方法，其中化合物防止RNA聚合酶II与前列腺特异性抗原基因复合。
48.一种方法，包括将哺乳动物细胞与足量的二芳基硫代乙内酰脲化合物接触以防雄激素受体蛋白质的核易位和/或使雄激素受体蛋白质不稳定。
全文摘要
本发明涉及二芳基硫代乙内酰脲化合物及合成它们和在治疗激素难治的前列腺癌中使用它们的方法。
文档编号C07D233/86GK101460467SQ200780020099
公开日2009年6月17日 申请日期2007年3月29日 优先权日2006年3月29日
发明者迈克尔·E·琼格, 刘东沅, 查尔斯·L·索耶斯, 克里斯·特兰 申请人:加利福尼亚大学董事会