本发明属于生物燃料领域，具体涉及一种生产生物燃料的方法。
背景技术：
随着国际社会对全球气候变化影响大的日益关注，新能源的开发和应用再次成为全球关注的焦点话题，世界各国对于建设低碳经济以应对全球变暖的共识也不断得加强，向低碳经济转型已经成为世界经济发展的大趋势，作为经济正处于高速发展的最大的发展中国家，中国也同样面临经济发展与环境环保的双重挑战。在中国的化石能源中，基本特点是富煤、贫油、少气，即与石油和天然气比较而言，我国的煤炭的储量相对比较丰富，占世界储量的11.6％，这就决定了煤炭作为一次能源在我们经济建设中的重要地位，然而，随着我国经济建设的持续发展，化石能源中的煤炭使用所带来的环境污染问题日益突出，使得解决能源短缺问题和能源利用中的环境污染问题，将是人类可持续发展所面临的关键所在。为此，从长期的能源发展战略角度来审视，新能源和可再生能源的开发和利用，应从“零”排放或“低”排放的技术方向发展，也是保护环境、走向低碳经济社会可持续发展之路的基本保证。
生物燃料是利用来自生物量的原料生産的燃料。生物量在例如像植物那样具有光合作用能力的情况下从光能与二氧化碳产生的油脂或碳水化合物成了生物燃料的原料，因此能够生产对环境压力小的燃料。生物燃料有将碳水化合物糖化，经酒精发酵产生的生物乙醇、作为植物油的主成分的甘油三酯、由蜡酯等中性脂质产生的生物柴油和生物喷气燃料等。一般将生物燃料定义为通过直接燃烧、乙醇发酵和甲烷发酵等从生物质获得的能量。生物质，生物燃料的原料，尤其是对于生物醇，可以归类为糖基(甘蔗、甜菜等)、淀粉基(玉米、马铃薯、红薯等)和木基(废木材、稻草、废纸等)。糖基生物质可以在比较简单的预处理过程后容易地并且直接地转化成生物乙醇。而淀粉-或木-基生物质需要适当的预处理过程和糖化过程来产生生物乙醇。废木材，一种城市废物,或森林周围分散的森林副产物，也可以用作木基生物质。此外，因为它们不具有作为食物的可用性，可以稳定地保证原料需求。然而，对于待用作生物燃料的木基生物质，必须进行消除木质素的预处理，这增加了生产成本，并且由于纤维素的结晶氢键键合结构，糖化效率变得非常低。
对于在运输上经济可行的可替换燃料，生物燃料的价格必须与汽油相竞争。通常，原料与加工的成本比很大程度上取决于所用生物质的种类。例如，在糖基，如甘蔗和甜菜的情况中，原料与加工的成本比大约为75:25。同时，在淀粉-基，如玉米、马铃薯和木薯的情况中，比例为约50:50,在木基的情况中，比例大约为25:75。
迄今为止用于生物乙醇生产的最常用生物质是糖基和淀粉基的。然而，它们还可以用作食物，因此，如果食物需求快速增长，这些原料需求应当会受到影响，使得生产成本在经济上是不可行的。此外，发现作物如玉米的栽培需要大量农药和氮肥，导致环境问题，如土壤侵蚀和污染。
CN 102277211A中公开了一种生物汽油及其配制方法。由薯类淀粉、变性添加剂、改性剂、烃醇菌种混合制成，各组分所占的质量百分比例为：薯类淀粉90-98％、变性添加剂1-5％、改性剂1-5％、烃醇菌种0.01-1％。将上述薯类淀粉、配醪→糊化→灭菌→烃醇A6、A8、B11菌试管培养→培养瓶培养→种母罐培养→种母醪→罐化酵→发酵醪→醪液预处理器处理→醪塔→总溶剂→蒸馏塔→再将烃醇A6、烃醇A8、烃醇B11→混合→变性剂、改性剂后合成。本发明产品节能环保、使用成本低、延长发动机的使用寿命。但是该方法制备复杂，流程较长，并不适合工业化的大规模推广。
CN 101165188A中公开了一种以木薯为原料制取燃油生物丁醇的方法，它是采用木薯粉碎或木薯淀粉加水调浆，再加酸或加碱浸泡，除去杂质，然后加入S1010，催化剂反应，冷却后再接入CL·a-b Np-1菌种发酵，得出的混合液经分馏得到粗品燃油生物丁醇，粗品燃油生物丁醇经QR-W吸收剂处理后得精品燃油生物丁醇。按用途需要，加入QR-E改性剂，得合格燃油生物丁醇。但是该方法中菌的发酵效率还不高，产量较低，同样也不适宜大规模工业化生产。
CN 101899412A公开了一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌，该方法通过在大肠杆菌中过量表达硫脂酶基因，脂酰-CoA还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因等，使大肠杆菌获得生产生物汽油的能力，该方法生产迅速，但是生物汽油的产量还有待进一步的提高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种改造的用于制备生物汽油的工程大肠杆菌。
本发明的又一目的在于提供一种利用上述工程大肠杆菌制备中短链烷烃即生物汽油的方法。
本发明的另外一个目的是提供一种蜡样芽孢杆菌脱氢酶，该酶的氨基酸序列如：SEQ ID No：1所示。该酶能够使得大肠杆菌生物流量通路转向脂肪酸合成途径，从而使得短链烷烃的合成量得到大幅度的提高。
本发明另外提供一种增强蜡样芽孢杆菌脱氢酶活性的方法，所述方法包括针对氨基酸序列的活性位点进行取代验证，通过200多种取代实验，最终筛选得到G63、N70、K84、I93、S110、R119、D128、L137、I 145、K146、L181、S182、T196、V243、A252、S263、F303、Y362、E379、L404、K422这21种位点为酶活关键位点，被取代后能够增强相应的酶活，而其余的均不能导致酶活提高有的甚至导致酶活降低或消失。
本发明另外提供一种位点取代的方法，所述的取代为优化后的具有提高酶活活性的取代方式，具体为G63A、N70S、K84T、I93D、S110G、R119F、D128S、L137D、I145S、K146K、L181G、S182H、T196Q、V243I、A252S、S263P、F303G、Y362T、E379M、L404W、K422E。其中G63A表示在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第63位置的G被取代为A。
本发明提供一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌的制备方法，通过下述方法得到：
通过PCR(聚合酶链式反应)扩增乙酰-CoA羧化酶基因GeneID(NCBI)：2878573、硫脂酶基因GI(NCBI)：170555、脂酰-CoA还原酶基因GI(NCBI)：1684885和脂肪醛脱羧酶基因GI(NCBI)：145334982以及蜡样芽孢杆菌脱氢酶GI(NCBI)：KZD31264，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)或pACYCDuet-1，载体片断胶回收后，将载体∶基因片段按摩尔比为1∶4的比例混合，加入T4DNA连接酶后4℃连接20小时，连接产物38-42℃热击转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布平板培养过夜，PCR筛选阳性克隆；阳性克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴定后，热击转化E.coliBL21(DE3)，最后敲除该工程大肠杆菌的fadE基因后即得目标工程大肠杆菌。
本发明提供一种利用上述工程大肠杆菌制备中短链烷烃即生物汽油的方法，是将构建好的工程大肠杆菌以1-2∶100-130的比例接种内含卡那霉素和氯霉素的M9液体培养液中，35-37℃，225rpm条件下培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-0.2mmol·L-1，诱导目的蛋白的过量表达，然后转入28-30℃，225rpm继续培养18-24小时；培养后的菌液离心取上清液，用等体积的正己烷萃取，减压蒸发除去正己烷后制得生物汽油。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：烷烃的生产效率得到大幅度的提高，而且制备简单，烷烃分泌在保外便于分离和纯化，能够适用于工业化的生产。
具体实施方式
实施例1蜡样芽孢杆菌脱氢酶的克隆及载体的构建
蜡样芽孢杆菌菌脱氢酶基因的克隆
蜡样芽孢杆菌CMCC 63303的总mRNA，然后反转录为cDNA，根据GenBank：KZD31264设计引物在引物两端加入酶切位点，PCR扩增克隆其脱氢酶基因BcDHD，再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
将胶回收后的脱氢酶基因BcDHD与pACYCDuet-1载体(Novagen)用BamH I和Sal 1进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-BcDHD后，再通过限制性酶切和测序鉴定。通过鉴定，重组质粒构建正确。
另外，根据已经验证的具有较好取代提高酶活的位点，同时通过多重PCR将相应的突变位点引入到基因序列中，从而获得了不同突变体基因，利用上述相同的方法，构建表达载体，分别命名为：pA-BcDHD-G63A、pA-BcDHD-N70S、pA-BcDHD-K84T、pA-BcDHD-I93D、pA-BcDHD-S110G、pA-BcDHD-R119F、pA-BcDHD-D128S、pA-BcDHD-L137D、pA-BcDHD-I 145S、pA-BcDHD-K146K、pA-BcDHD-L181G、pA-BcDHD-S182H、pA-BcDHD-T196Q、pA-BcDHD-V243I、pA-BcDHD-A252S、pA-BcDHD-S263P、pA-BcDHD-F303G、pA-BcDHD-Y362T、pA-BcDHD-E379M、pA-BcDHD-L404W、pA-BcDHD-K422E。
实施例2重组大肠杆菌的构建
按照CN 101899412A实施例1的方法获得了含有pA-accABCD和pET-acr1/BTE/CER1两个表达载体。
将实施例1制备得到的重组质粒pA-BcDHD与pA-accABCD和pET-acr1/BTE/CER1三个表达载体一起热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定。由此获得了含有pA-BcDHD、pA-accABCD和pET-acr1/BTE/CER1三个表达载体的工程大肠杆菌。转化后的工程大肠杆菌，采用TargeTronTM基因敲除系统(Sigma-Aldrich)对大肠杆菌的fadE基因进行敲除。所述菌株为DHD/accABCD/acr1/BTE/CER1/-fadE大肠杆菌，简单命名为：BcDHD菌株。
实施例1中制备得到的取代的表达载体，也采用上述相似的方法，替换pA-BcDHD然后pA-accABCD和pET-acr1/BTE/CER1这二个表达载体一起转化分别构建获得相应的工程大肠杆菌。采用TargeTronTM基因敲除系统(Sigma-Aldrich)对大肠杆菌的fadE基因进行敲除。分别采用BcDHD取代后的位点的名称来命名所述的菌株。
实施例3发酵生产
工程大肠杆菌的培养
将构建好的工程菌活化后按1∶100的比例接种到M9液体培养液中(内含50μg·mL-1的卡那霉素和34μg·mL-1氯霉素)，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，然后转入在30℃，225rpm条件下，继续培养24h。诱导培养后的菌液在12000g条件下，离心10min，收集上清液，并用等体积的正己烷萃取2-3次，旋转蒸发除去正己烷后即得中短链烷烃。正己烷回收利用。将得到的烷烃通过GC-MS测定其组成及含量。通过检测发现，实施例1和2构建的多种大肠杆菌可以有效的生产烷烃，具体的含量如下：
从以上结果可以看出，通过导入了蜡样芽孢杆菌脱氢酶的大肠杆菌在烷烃产量的提高方面具有显著的作用，产量提高了超过100％，具有很显著的的效果，其效果是无法预料的。
另外，通过质谱发现，导入了蜡样芽孢杆菌脱氢酶的大肠杆菌生产的烷烃的结构与汽油的组分更加接近，更加适合于汽油的燃烧，其加热比值可以达到汽油的热比值的95.3％，基本可以用于替换汽油。而没有导入所述脱氢酶的大肠杆菌生产的烷烃热比值为汽油的77.8％，效率稍微差一些。
以上列举的具体实施例是对本发明进行的说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
序列表
〈110〉门东东
〈120〉一种生产生物燃料的方法
〈160〉1
<210>1
<211>436
<212>PRT
<400> dehydrogenase
1 MKHFDVAIVG GGLAGLTASI YLAKAGRKVI VLEKSSHFGG RGMTINKNGI CMNLGAHALY
61 RGGEAFITFN ELGVNLPGGI PSTKAHGIWK GDIYTIPTDF RSILSTPLLS WSAKVQFARL
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