本发明属于水产品加工技术领域。更具体地，涉及一种鱿鱼抗氧化多肽及其制备方法和应用。
背景技术：
鱿鱼，即枪乌贼，是软体动物门头足纲管鱿目开眼亚目的动物，主要分布于南北纬40°之间的热带和温带海域，世界主要枪乌贼渔场在中国南海北部、暹罗湾、日本九州、菲律宾群岛中部、西欧西部和美国东部、西部海域。生产世界枪乌贼的主要捕捞国为泰国、中国、菲律宾和越南，其总渔获量约占世界枪乌贼科总渔获量的60%，最重要的捕捞对象为中国枪乌贼。
鱿鱼肉质鲜美、口感佳，而且营养价值非常高，其富含蛋白质、钙、牛磺酸、磷、维生素B1等多种人体所需的营养成分，且含量极高。此外，脂肪含量极低。胆固醇含量较高。每100克枪乌贼鲜肉含蛋白质约15克，维生素A的含量为230国际单位，约为乌贼的2倍。研究显示，鱿鱼中还含有丰富的多肽活性物质。如林琳（2006）等研究显示，鱿鱼皮胶原蛋白水解肽具有很好的抗氧化活性。
目前，与鱿鱼多肽有关的技术如下：专利“一种抗动脉硬化鱿鱼蛋白质短肽的分离方法” 和“一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法”，前者利用鱿鱼内脏制备短肽，具有抗动脉硬化作用，后者利用肝脏制备ACE抑制肽。专利“鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法”和“ 一种利用纳豆芽孢杆菌发酵鱿鱼碎肉制备高F值寡肽方法”都是制备高F值寡肽。专利“一种鱿鱼皮低分子量胶原蛋白肽的制备方法”、 “医用鱿鱼皮胶原蛋白寡肽凝胶的制备方法”和“鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法和应用”都是采用鱿鱼皮制备活性肽。“一种鱿鱼活性肽的提取方法” 通过乳酸菌来处理鱿鱼，具有促进蛋白质、单糖的分解，以及促进钙、 镁等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质，还可以增加肠道 有益菌群，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用，免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力等作用。“ 一种鱿鱼蛋白肽的制造方法”提供一种总蛋白肽，应用于水产饲料添加剂。“一种鱿鱼活性肽的制备方法”制备鱿鱼总的活性肽。
目前为止，尚未见有利用鱿鱼肉通过可控酶解技术制备抗氧化多肽的研究和报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中鱿鱼抗氧化多肽的研究和制备工艺的缺陷和不足，提供一种利用可控酶解技术针对性制备鱿鱼抗氧化多肽的方法，该方法酶解条件简单可控，反应条件温和，且避免了常规酸水解对产品的污染，酶解产物的种类和含量更加稳定，抗氧化肽得率高，功能性强，易于工业化生产，为鱿鱼的深加工利用开辟了新途径。
本发明的目的是提供一种鱿鱼抗氧化多肽的制备方法。
本发明另一目的是提供所述制备方法制备得到的鱿鱼抗氧化多肽。
本发明再一目的是提供所述鱿鱼抗氧化多肽的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种鱿鱼抗氧化多肽的制备方法，包括如下步骤：
S1.向鱿鱼肉糜中加入磷酸盐缓冲液，再加入木瓜蛋白酶进行酶解；
S2.将S1得到的酶解液灭酶，离心，收集上清液；
S3.上清液先经过滤膜过滤，再利用透析袋进行透析处理，除去大分子物质，收集透过液；
S4.将透过液浓缩至原体积的15%～40%，浓缩液经过冷冻干燥，得到鱿鱼抗氧化肽产品。
其中，优选地，步骤S1所述木瓜蛋白酶的用量为鱿鱼肉糜质量的4%～7%。
更优选地，步骤S1所述木瓜蛋白酶的用量为鱿鱼肉糜质量的5%～7%。
更优选地，步骤S1所述木瓜蛋白酶的用量为鱿鱼肉糜质量的7%。
优选地，步骤S1所述酶解的条件为50～60℃酶解4～7h。
更优选地，步骤S1所述酶解的条件为60℃酶解5.5h。
优选地，步骤S1中鱿鱼肉糜和磷酸盐缓冲液的质量体积比为1g：8～12mL。
更优选地，步骤S1中鱿鱼肉糜和磷酸盐缓冲液的质量体积比为1g：10mL。
优选地，步骤S1所述鱿鱼肉糜的获得方法：选择从市场购买的新鲜、无损伤、无病斑的鱿鱼，清洗干净，去掉内脏、眼，表面脏的皮等，只留肌肉组织，切成小块，洗净后绞成肉糜。
优选地，步骤S1所述磷酸盐缓冲液的pH为5.8～6.0。
更优选地，步骤S1所述磷酸盐缓冲液的pH为5.8。
优选地，步骤S1所述木瓜蛋白酶为5000～7000U/mg的木瓜蛋白酶。
更优选地，步骤S1所述木瓜蛋白酶为6000U/mg的木瓜蛋白酶。
优选地，步骤S2所述灭酶是置于沸水浴中灭酶10～20min，冷却到室温后再离心。
更优选地，所述沸水浴中灭酶的时间为15min，所述冷却到室温是用自来水冷却到室温。
优选地，步骤S2所述离心是利用冷冻离心机进行离心。
更优选地，所述离心的条件是5000～10000rpm条件下离心15～25min。
更优选地，所述离心的条件是5000～10000rpm离心20min。
优选地，步骤S3所述滤膜是0.4～0.5微米的滤膜。
更优选地，步骤S3所述滤膜是0.45微米的滤膜。
优选地，步骤S3所述透析袋为截留分子量为3000～4000D的透析袋。
更优选地，步骤S3所述透析袋为截留分子量为3500D的透析袋。
优选地，步骤S4所述冷冻干燥的具体方法是将浓缩液首先在-10～-20℃条件下冷冻8～12小时，然后-35～-55℃冻干25～45h。
更优选地，步骤S4所述冷冻干燥的具体方法是将浓缩液首先在-18℃条件下冷冻10小时，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，冻干温度为-40～-50℃，冻干时间为30～40h。
另外，利用上述制备方法制备得到的鱿鱼抗氧化多肽，以及所述鱿鱼抗氧化多肽在制备保健品方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。
具体优选地，所述应用是鱿鱼抗氧化多肽在制备具有抗氧化功能的食品或保健品方面的应用。
在实际应用中，本发明的方法主要适用于水产品，尤其是鱿鱼深加工企业以及保健品开发企业。在抗氧化多肽生产过程中主要用到以下设备：酶解罐、冷却罐、过滤设备、冷冻干燥设备以及包装设备等。中等规模的生产企业，连同设备、厂房、工人等，需要投资100万左右即可。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种利用可控酶解技术针对性制备鱿鱼抗氧化多肽的方法，首先采用可控酶解技术制备鱿鱼抗氧化多肽，然后经过微米滤膜和半透膜过滤掉大分子物质，制备得到的鱿鱼抗氧化多肽具有抗氧化活性，能够清除羟自由基。
本发明利用酶解法制备抗氧化肽克服避免了传统酸水解对产品污染的问题，酶解产物的种类和含量更加稳定，同时在产品制备过程采用冷冻干燥技术更有效最大限度的保持了抗氧化肽的活性，使产品抗氧化功能大大增加，制成的鱿鱼抗氧化肽粉，功能性强，易保存，也为鱿鱼的深加工利用开辟了新途径。
本发明方法的酶解条件更加简单可控，反应条件温和，抗氧化肽得率高，功能性强，易于工业化生产，为鱿鱼的深加工利用开辟了新途径。
利用本发明方法对鱿鱼进行深加工制备得到抗氧化多肽，对于水产行业发展和鱿鱼附加值具有重要的意义。同时得到的抗氧化多肽，既营养又保健，对于促进社会居民的健康也会起到一定作用。在目前重视养生和保健的环境下，开发具有功能性的天然的食品备受青睐，利用本发明方法制备鱿鱼抗氧化多肽产品具有较好的市场前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、一种鱿鱼抗氧化多肽的制备方法，步骤如下：
S1. 选择新鲜、无损伤、无病斑的鱿鱼，清洗干净，只留肌肉组织，切成小块，洗净后绞成肉糜；精确称取10g鱿鱼肉糜，加入100mL pH5.8磷酸盐缓冲液，再加入鱿鱼肉糜质量的6%的木瓜蛋白酶（6000U/mg），60℃酶解4h；
S2.酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中灭酶15min，然后用自来水冷却到室温，再用冷冻离心机5000～10000rpm条件下离心20min，收集上清液；
S3.上清液先经过0.45微米的滤膜过滤，再利用截留分子量为3500D的透析袋进行透析处理，除去大分子物质，收集透过液；
S4.将透过液浓缩至原体积的15%～40%，浓缩液经过冷冻干燥，得到鱿鱼抗氧化肽产品。
2、经过测定，所得鱿鱼抗氧化肽产品对羟自由基的清除率为69.7%。
实施例2
1、一种鱿鱼抗氧化多肽的制备方法，步骤如下：
S1. 选择新鲜、无损伤、无病斑的鱿鱼，清洗干净，只留肌肉组织，切成小块，洗净后绞成肉糜；精确称取10g鱿鱼肉糜，加入100mL pH5.8磷酸盐缓冲液，再加入鱿鱼肉糜质量的6%的木瓜蛋白酶（6000U/mg），55℃酶解5.5h；
S2.酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中灭酶15min，然后用自来水冷却到室温，再用冷冻离心机5000～10000rpm条件下离心20min，收集上清液；
S3.上清液先经过0.45微米的滤膜过滤，再利用截留分子量为3500D的透析袋进行透析处理，除去大分子物质，收集透过液；
S4.将透过液浓缩至原体积的15%～40%，浓缩液经过冷冻干燥，得到鱿鱼抗氧化肽产品。
2、经过测定，所得鱿鱼抗氧化肽产品对羟自由基的清除率为87.7%。
实施例3
1、一种鱿鱼抗氧化多肽的制备方法，步骤如下：
S1. 选择新鲜、无损伤、无病斑的鱿鱼，清洗干净，只留肌肉组织，切成小块，洗净后绞成肉糜；精确称取10g鱿鱼肉糜，加入100mL pH5.8磷酸盐缓冲液，再加入鱿鱼肉糜质量的7%的木瓜蛋白酶（6000U/mg），50℃酶解5.5h；
S2.酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中灭酶15min，然后用自来水冷却到室温，再用冷冻离心机5000～10000rpm条件下离心20min，收集上清液；
S3.上清液先经过0.45微米的滤膜过滤，再利用截留分子量为3500D的透析袋进行透析处理，除去大分子物质，收集透过液；
S4.将透过液浓缩至原体积的15%～40%，浓缩液经过冷冻干燥，得到鱿鱼抗氧化肽产品。
2、经过测定，所得鱿鱼抗氧化肽产品对羟自由基的清除率为80.6%。
实施例4
1、一种鱿鱼抗氧化多肽的制备方法，步骤如下：
S1. 选择新鲜、无损伤、无病斑的鱿鱼，清洗干净，只留肌肉组织，切成小块，洗净后绞成肉糜；精确称取10g鱿鱼肉糜，加入100mL pH5.8磷酸盐缓冲液，再加入鱿鱼肉糜质量的7%的木瓜蛋白酶（6000U/mg），60℃酶解5.5h；
S2.酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中灭酶15min，然后用自来水冷却到室温，再用冷冻离心机5000～10000rpm条件下离心20min，收集上清液；
S3.上清液先经过0.45微米的滤膜过滤，再利用截留分子量为3500D的透析袋进行透析处理，除去大分子物质，收集透过液；
S4.将透过液浓缩至原体积的15%～40%，浓缩液经过冷冻干燥，得到鱿鱼抗氧化肽产品。
2、经过测定，所得鱿鱼抗氧化肽产品对羟自由基的清除率为89.6%。
实施例5
1、一种鱿鱼抗氧化多肽的制备方法，步骤如下：
S1. 选择新鲜、无损伤、无病斑的鱿鱼，清洗干净，只留肌肉组织，切成小块，洗净后绞成肉糜；精确称取10g鱿鱼肉糜，加入100mL pH5.8磷酸盐缓冲液，再加入鱿鱼肉糜质量的6%的木瓜蛋白酶（6000U/mg），60℃酶解7h；
S2.酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中灭酶15min，然后用自来水冷却到室温，再用冷冻离心机5000～10000rpm条件下离心20min，收集上清液；
S3.上清液先经过0.45微米的滤膜过滤，再利用截留分子量为3500D的透析袋进行透析处理，除去大分子物质，收集透过液；
S4.将透过液浓缩至原体积的15%～40%，浓缩液经过冷冻干燥，得到鱿鱼抗氧化肽产品。
2、经过测定，所得鱿鱼抗氧化肽产品对羟自由基的清除率为81.3%。
实施例6 蛋白酶用量的优化
1、首先，参照实施例4的方法制备鱿鱼抗氧化多肽，唯一不同之处在于所用蛋白水解酶的类型不同，经过筛选优化，结果显示，对于鱿鱼抗氧化多肽的制备，木瓜蛋白酶是最合适的，而且是5000～7000U/mg的木瓜蛋白酶。
2、制备鱿鱼抗氧化多肽，步骤方法同实施例4，唯一不同之处在于：以步骤S1中木瓜蛋白酶的用量为变量（分别为占鱿鱼肉糜质量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%），酶解温度为55℃，时间为6h。研究木瓜蛋白酶用量对产物羟自由基清除效果的影响。
3、结果如表1所示，结果表明，木瓜蛋白酶的用量占鱿鱼肉糜质量的4%～6%时，产品对羟自由基的清除效果最好。
表1 鱿鱼抗氧化肽产品对羟自由基的清除率
实施例7 酶解温度的优化
1、制备鱿鱼抗氧化多肽，步骤方法同实施例4，唯一不同之处在于：以步骤S1中酶解温度为变量，加酶量为5%，酶解时间为6h。研究酶解温度对产物羟自由基清除效果的影响。
2、结果如表2所示，结果表明，在55～60℃的酶解温度下，产品对羟自由基的清除效果最好。
表2 鱿鱼抗氧化肽产品对羟自由基的清除率
实施例8 酶解时间的优化
1、制备鱿鱼抗氧化多肽，步骤方法同实施例4，唯一不同之处在于：以步骤S1中酶解时间为变量，加酶量为5%，酶解温度为55℃。研究酶解时间对产物羟自由基清除效果的影响。
2、结果如表3所示，结果表明，在酶解5～7h的条件下，产品对羟自由基的清除效果最好。
表3 鱿鱼抗氧化肽产品对羟自由基的清除率
另外，综合各方面因素，实验显示，本发明制备鱿鱼抗氧化多肽的方法中，所述木瓜蛋白酶的用量为鱿鱼肉糜质量的4%～7%，优选用量为鱿鱼肉糜质量的5%～7%，最佳用量为鱿鱼肉糜质量的7%。所述酶解的条件为50～60℃酶解4～7h，优选酶解条件为60℃酶解5.5h。