本发明属于制药领域，具体涉及一种七叶皂苷A的制备方法。
背景技术：
七叶皂苷又称七叶皂苷酸，为从七叶树科属植物种子提取得到的总皂苷、β-七叶皂苷或异七叶皂苷等的总称，属于三萜皂苷类。七叶皂苷的水溶解度较差，为增加其溶解度，常将其制成钠盐。七叶皂苷中含有很多种皂苷化合物，我国国家标准按液相出峰前后，依次命名为七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D。他们互为同分异构体(见附图1)，目前用于临床上的七叶皂苷钠是由七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D以及其它成分组成的钠盐混合物。七叶皂苷钠长期使用过程中发现药物对肌肉和粘膜具有强刺激作用，患者易出现静脉炎等副作用。此外，部分皂苷类成分具有溶血作用。由于七叶皂苷钠组合物的组分较多，七叶皂苷钠中杂质的定性和定量控制几乎无法实现。这种不可控性会导致七叶皂苷钠产品的质量的均一性和安全性难以得到保证，特别是血管刺激性等不良反应难以掌控。因此，对七叶皂苷的各单体的分离、药理活性和毒理性质的研究并筛选出最适合临床用药的更优单体显得尤为重要。药理实验研究表明，与七叶皂苷钠组合物相比，七叶皂苷A的药理活性最强，因此严重脑水肿的临床治疗效果更优。此外，高纯度的七叶皂苷A可解决目前七叶皂苷钠产品质量的均一性和安全性难以得到保证，肌肉和血管刺激性等不良反应难以掌控等问题。因此，七叶皂苷A的制备和开发具有重大的临床意义。现有技术中，提取七叶皂苷A主要通过制备液相分离的方法来实现。CN102532242公开了一种制备七叶皂苷单体A的方法。它是以七叶皂苷为原料，用己烷-氯仿-甲醇-水溶液系统和己烷-乙酸乙酯-甲醇-磷酸水(pH1-3)溶液系统，采用高速逆流色谱方法两次分离制得高纯度七叶皂苷A。该方法生产成本高，生产效率低，且难以工业化生产。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高纯度、高收率的七叶皂苷A的制备方法。该方法设备要求低、纯化费用低、毒性小、环境污染少，适合工业化生产。本发明提供的七叶皂苷A制备方法包括以下步骤：1)以娑罗子为原料，用乙醇提取，收集提取液并浓缩；2)将步骤1)得到的浓缩液调节pH至2～3，然后用水饱和的正丁醇萃取，分离有机层并浓缩；3)将步骤2)得到的浓缩液加入到2～5倍体积的丙酮/甲基叔丁基醚混合溶液中，搅拌下加热回流，然后冷却析晶并干燥；4)将干燥后的晶体溶解于热水中，然后再次冷却析晶并干燥；5)将二次析晶后的固体溶解到有机溶剂中，然后再向有机溶剂中加入占二次析晶后的固体重量的10-20％的L-脯氨酸，加热回流10～60min后再冷却到40-50℃，此时加入少量七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至0-20℃析晶，直到白色晶体不再析出，抽滤或离心，将滤液减压蒸馏去除有机溶剂得到浓缩液；6)将步骤5)得到的浓缩液加入至4-8倍体积的水/四氢呋喃混合溶剂中，调节pH至3-4，搅拌升温至80-100℃并回流10-60min，然后将溶液缓慢冷却析晶，抽滤或离心，将固体烘干，得七叶皂苷A。优选地，步骤1)中的乙醇为质量浓度为30-70％的乙醇水溶液。优选地，步骤3)中的丙酮/甲基叔丁基醚混合溶液中，丙酮与甲基叔丁基醚的体积比为2-8∶1。优选地，步骤5)中的有机溶剂为乙醇/正己烷混合溶剂，所述乙醇与正己烷的体积比为10-30∶1。优选地，步骤5)中，所述L-脯氨酸占二次析晶后的固体重量的15％。优选地，步骤6)中，所述水/四氢呋喃混合溶剂，水与四氢呋喃的体积比为3-5∶1。本发明的有益效果是：本发明针对七叶皂苷A单体制备存在的问题，首次采用了手性氨基酸——L-脯氨酸诱导重结晶，先从β-七叶皂苷中分离除去七叶皂苷B，再从浓缩液中析晶获得高纯度、高收率的七叶皂苷A，本发明避免了使用柱层析、离子交换树脂等方法，具有操作简便、设备要求低、纯化费用低、毒性小、环境污染少，可执行性好、适合工业化生产等优点。与七叶皂苷相比，七叶皂苷A的药理活性最强，因此严重脑水肿的临床治疗效果更优。此外，高纯度的七叶皂苷A作为单一有效组分，能够从根本上解决目前七叶皂苷钠组合物产品质量的均一性和安全性等问题。附图说明图1是七叶皂苷A、B、C、D的结构式。具体实施方式以下通过实施例对本发明进行详细地说明。实施例11)提取：取娑罗子粉末1kg提取两次，每次用10L质量浓度为70％的乙醇水溶液，45℃搅拌提取2h，过滤，将两次过滤的滤液合并，在减压条件下旋转回收溶剂并浓缩至2L；2)萃取：将步骤1)中得到的浓缩液用1mol/L的盐酸调节pH至2，用2L的水饱和的正丁醇萃取3次，合并有机层并浓缩至400mL；3)第一次析晶：将步骤2)得到的浓缩液加入到960mL丙酮和240mL甲基叔丁基醚混合溶剂中，搅拌下加热回流，然后冷却至20℃析出白色沉淀，过滤、45℃干燥得白色晶体49g；4)第二次析晶：将步骤3)得到的49g晶体溶解于200mL的100℃的热水中，搅拌20min，然后将溶液冷却至0℃，析出白色固体，抽滤，将固体在45℃条件下烘干，得β-七叶皂苷32g；5)七叶皂苷B的去除：将步骤4)得到的32gβ-七叶皂苷溶解于300mL乙醇和15mL正己烷混合溶剂中，向上述体系加入4.8gL-脯氨酸，加热回流30min，将体系冷却到50℃，此时加入0.2g纯度达98％的七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至20℃，析晶，直到白色晶体不再析出，抽滤，将滤液减压蒸馏去除有机溶剂得到浓缩液60ml；6)七叶皂苷A的分离：将步骤5)得到的60ml浓缩液加入至240ml水和60ml四氢呋喃混合溶剂中，用稀盐酸调节pH至3，搅拌升温至100℃并回流30min，然后将溶液缓慢冷却至0℃析晶，抽滤，将固体烘干，得七叶皂苷A13.4g。本实施例中，步骤1)的目的是将七叶总皂苷从娑罗子中提取分离出来，这是娑罗子总皂苷提取的常规工艺，提取方法可以采用本领域常用的回流、浸泡、渗漏等方法。其中，乙醇的浓度会对七叶总皂苷的纯度、收率产生重要影响，乙醇浓度过低会导致产物提取不充分，乙醇浓度过高会导致杂质含量增加。步骤2)的萃取和步骤3)、4)的两次析晶目的都是纯化提取物，得到高纯度的β-七叶皂苷。其中，调节pH的目的是提高七叶皂苷的稳定性和萃取效率，pH过高会导致七叶皂苷的水溶性增加，正丁醇萃取效率降低；pH过低会降低七叶皂苷的稳定性。步骤(3)中丙酮与甲基叔丁基醚的比例会影响七叶皂苷晶体的析出速度和收率。步骤5)中的有机溶剂还可以选择甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、正己烷、正庚烷等中的一种或者多种的任意混合，目的是使β-七叶皂苷能很好的溶解，同时又能在诱导重结晶中能更好地析出七叶皂苷B。L-脯氨酸的用量直接影响了七叶皂苷B的分离和析出，本实施例七叶皂苷B不仅能够选择性地顺利析出晶体，并且收率和纯度都较高，晶体形态好。步骤6)中，选择水/四氢呋喃混合溶剂，能使七叶皂苷A较好地析出，从而将七叶皂苷A与L-脯氨酸和其它七叶皂苷组分分离。调节pH的目的一是减少L-脯氨酸的残余量，二是防止七叶皂苷A降解和转化。采用高效液相法对产物中的七叶皂苷A进行检测，结果产物中七叶皂苷A的含量为96.4％，收率(产物中七叶皂苷A的总量占投料娑罗子中七叶皂苷A的总量的百分比)为53％。实施例21)提取：取娑罗子粉末1kg回流提取三次，每次用6L质量浓度为30％的乙醇水溶液，过滤，将滤液合并，在减压条件下旋转回收溶剂并浓缩至2L；2)萃取：将步骤1)中得到的浓缩液用3mol/L的盐酸调节pH至3，用水饱和的正丁醇萃取3次，合并有机层并浓缩至200mL；3)第一次析晶：将步骤2)得到的浓缩液加入到300mL丙酮和100mL甲基叔丁基醚混合溶剂中，搅拌下加热回流，然后冷却至析出白色沉淀，过滤、干燥得白色晶体38g；4)第二次析晶：将步骤3)得到的38g七叶皂苷晶体溶解于100ml80℃的热水中，搅拌60min，然后将溶液冷却析出白色固体，抽滤，将固体烘干，得β-七叶皂苷27g；5)七叶皂苷B的去除：将步骤4)得到的27gβ-七叶皂苷溶解于150mL乙醇和15mL正己烷混合溶剂中，向上述体系加入2.7gL-脯氨酸，加热回流10min，将反应体系冷却到45℃，此时加入0.1g七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至20℃，析晶，直到白色晶体不再析出，抽滤，将滤液减压蒸馏去除有机溶剂得到浓缩液50ml；6)七叶皂苷A的分离：将步骤5)得到的50ml浓缩液加入至300ml水和100ml四氢呋喃混合溶剂中，用稀盐酸调节pH至3，搅拌升温至80℃并回流60min，然后将溶液缓慢冷却至0℃析晶，抽滤，将固体烘干，得七叶皂苷A12.1g。产物中七叶皂苷A的含量为96.1％，收率为47.7％。实施例31)提取：取娑罗子粉末1kg回流提取二次，每次用15L质量浓度为50％的乙醇水溶液，过滤，将滤液合并，在减压条件下旋转回收溶剂并浓缩至3L；2)萃取：将步骤1)中得到的浓缩液用0.5mol/L的盐酸调节pH至3，用水饱和的正丁醇萃取5次，合并有机层并浓缩至300mL；3)第一次析晶：将步骤2)得到的浓缩液加入到1200mL丙酮和150mL甲基叔丁基醚混合溶剂中，搅拌下加热回流，然后冷却至析出白色沉淀，过滤、干燥得白色晶体43g；4)第二次析晶：将步骤3)得到的43g七叶皂苷晶体溶解于215mL的沸水中，搅拌30min，然后将溶液冷却析出白色固体，离心，将固体烘干，得β-七叶皂苷29g；5)七叶皂苷成品的制备：将步骤4)得到的29gβ-七叶皂苷溶解于300mL乙醇和10mL正己烷混合溶剂中，向上述体系加入5.8gL-脯氨酸，加热回流60min，将反应体系冷却到40℃，此时加入少量七叶皂苷B作为晶种，继续搅拌冷却至0℃析晶，直到白色晶体不再析出，离心，将滤液减压蒸馏去除有机溶剂得到浓缩液30ml；6)七叶皂苷A的分离：将步骤5)得到的30ml浓缩液加入至100ml水和20ml四氢呋喃混合溶剂中，用稀盐酸调节pH至4，搅拌升温至100℃并回流10min，然后将溶液缓慢冷却析晶，抽滤，将固体烘干，得七叶皂苷A12.7g。产物中七叶皂苷B的含量为95.4％，收率为49.7％。