本发明涉及一种沙门氏菌H抗原的位相变异试验方法。
背景技术：
沙门氏菌是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病病原菌，其正确的血清分型在传染病控制中意义重大。目前已检出沙门氏菌血清型2500种，我国已有290余个血清型的报道。沙门氏菌的血清型鉴定比较复杂，其血清型由O抗原、第1相和第2相H抗原等共同决定（有些仅有一相H因子），而H抗原的测定是沙门氏菌血清分型的主要依据。H抗原位于鞭毛上，本质为不稳定的蛋白质抗原，有较强的特异性，加热、干燥、冷冻或乙醇处理等因素均可使鞭毛结构受损，造成H抗原性减弱，从而对鉴定工作带来困难。例如，有实验者发现冷库中存放时间越长的样品分离的沙门菌株，达到H抗原性复原所需的传代次数越多。日常鉴定工作中经常遇到沙门氏菌的鞭毛发育不良而分型不明确的情况，在国家标准GB4789.4-2010中推荐了简易平板法、玻管法和倒管法3种传统的位相变异方法来诱导另一相H因子。其他科技工作者也公开了一些位相变异试验的改良方法，如营养肉汤-营养琼脂法、倍比稀释法等。其中简易平板法因其简单方便而应用广泛，但其明显缺点是成功率低；玻管法和倒管法对材料有一定要求，如毛细管和小倒管，且操作复杂。此外上述方法采用营养琼脂或半固体软琼脂作为菌株生长的底物，琼脂的存在抑制培养基的流动性，这与鞭毛的运动特性存在拮抗作用，从而阻碍H抗原性的复原。此外，沙门氏菌可突破低浓度琼脂，扩散至培养基内部生长，造成菌体挑取困难，因此在进行H抗原的玻片凝集试验时，培养基不可避免的随菌体进入血清液滴中，且无法完全分散，微小的固态培养基颗粒极易与血清凝集颗粒混淆，从而严重干扰凝集结果的判定。另外，H抗原的凝集物为絮状，不易观察，实验中往往需要挑取较多的菌体以增强凝集效果，这与降低固态培养基干扰的目的互相矛盾。鉴于上述原因，目前的位相变异试验方法存在干扰大、成功率低、操作复杂、费时多等缺点，无法满足日益增多的检验工作的需求。
技术实现要素：
针对上述缺点，本发明的目的在于提供一种成功率高、重复性好、干扰低、操作简便快捷的沙门氏菌H抗原的位相变异试验方法，为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种沙门氏菌H抗原的位相变异试验方法，包括以下步骤：
a.对待检的沙门氏菌菌株进行O抗原的血清凝集反应，根据O抗原的分群情况依次检查第1相和第2相H因子，当只检出一个相且待检菌株不是单相菌时，确定为目标菌株；
b.取已知相H因子血清至无菌营养肉汤中（血清与营养肉汤的体积之比为1:200~1:800），混匀，接种目标菌株，于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h，获得培养物；
c.将培养物转移至无菌离心管内，于5000~8000r/min条件下离心5~10min，移弃上清，保留离心管底部的菌体沉淀；
d.向含有菌体沉淀的离心管内添加无菌生理盐水（无菌生理盐水与培养物的体积之比为1:1~1:3），用移液器轻轻吹吸，直至菌体完全悬浮，再次于5000~8000 r/min条件下离心5~10 min，移弃上清，完成洗菌步骤；洗菌步骤可以重复1次或者多次；
e.向完成洗菌步骤的离心管内添加无菌生理盐水（菌体沉淀与无菌生理盐的体积之比为1:2~1:5），用移液器轻轻吹吸混匀，得到菌悬液；
f.取10~15 μL待检相H因子血清滴加于干净玻片上，取1~2 μL菌悬液添加至血清液滴中，混匀并倾斜摇动玻片，1 min之内观察凝集现象；同时在玻片另一区域用无菌生理盐水代替待检相H因子血清，与菌悬液混匀后作为对照。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用液体的营养肉汤代替含琼脂的培养基作为菌株生长的底物，消除了琼脂对玻片凝集的干扰和鞭毛生长发育的拮抗作用。液体培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，鞭毛作为沙门氏菌的运动器官，在液体培养基中可以充分的发挥运动作用而显著的被诱导生长，更利于H抗原性的恢复。凝集试验时，较高的H抗原性使凝集现象更明显，且没有固态培养基颗粒的干扰，凝集结果更容易观察和判定。
本发明通过离心收集菌体沉淀，更容易获得较多的菌体以实现增强凝集效果的目的，凝集试验时所用的菌体相对分散的悬浮于菌悬液中，更容易于血清中扩散均匀，使凝集速度更快、现象更明显、干扰更小。此外，方法中定量的明确了各步骤的试验条件和各组分的适用量，使位相变异试验的重复性更好、成功率更高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明，应当理解，所描述的实施例仅仅用以解释本发明。凡是基于本发明的技术方案所作的简化或者等同变化，均属于本发明的保护范围。
实施例1:
2015国家食品药品监督管理总局食品安全抽检检测承检机构盲样考核（沙门氏菌检验），共10份样品，编号为CODE1~10，如果检出沙门氏菌需对分离菌株进行血清分型。经检测，10份样品中CODE1、CODE4、CODE5、CODE6共4份样品为沙门氏菌阳性。之后按以下步骤进行后续试验：
a.对待检的4个沙门氏菌菌株进行O抗原的血清凝集反应，根据O抗原的分群情况依次检查第1相和第2相H因子，鉴定结果为CODE1（O 7:H r）、CODE4（O 4:H i）、CODE5（O 4:H f,g,s）、CODE6（O 19:H i），其中CODE5的待检菌株为单相菌，所以确定CODE1、CODE4 、CODE6共3个样品的沙门氏菌阳性菌株为目标菌株。
b.取已知相H因子血清至无菌营养肉汤中（血清与营养肉汤的体积之比为1:200），混匀，接种目标菌株，于36 ℃±1 ℃培养18 h，获得培养物；
c.将培养物转移至无菌离心管内，于5000 r/min条件下离心10 min，移弃上清，保留离心管底部的菌体沉淀；
d.向含有菌体沉淀的离心管内添加无菌生理盐水（无菌生理盐水与培养物的体积之比为1:1），用移液器轻轻吹吸，直至菌体完全悬浮，再次于5000 r/min条件下离心10 min，移弃上清，完成洗菌步骤；
e.向完成洗菌步骤的离心管内添加无菌生理盐水（菌体沉淀与无菌生理盐的体积之比为1:2），用移液器轻轻吹吸混匀，得到菌悬液；
f.取10 μL待检相H因子血清滴加于干净玻片上，取1 μL菌悬液添加至血清液滴中，混匀并倾斜摇动玻片，1 min之内观察凝集现象；同时在玻片另一区域用无菌生理盐水代替待检相H因子血清，与菌悬液混匀后作为对照；H抗原位相变异试验结果为CODE1（H 7）、CODE4（H 2）、CODE6（H z6）。
血清型的完整鉴定结果如表1所示，同时用简易平板法对鉴定结果进行多次的平行验证，验证实验显示两种方法的鉴定结果相同，并且与盲样考核测量结果完全一致。
实施例2:
2016年国家食品药品监督管理总局局本级食品安全抽检检测承检机构盲样考核工作，其中沙门氏菌检验共10份样品，编号为CODE1~10，报告检出或未检出沙门氏菌。经检测10份样品中CODE2、CODE7、CODE8共3个样品为沙门氏菌阳性。之后按以下步骤进行后续试验：
a.对待检的3个沙门氏菌菌株进行O抗原的血清凝集反应，根据O抗原的分群情况依次检查第1相和第2相H因子，检查结果为CODE2（O 7:H c）；CODE7（O 4:H f,g,s）、CODE8（O 7:H c），其中CODE7的待检菌株为单相菌，所以确定CODE2、CODE8共2个样品的沙门氏菌阳性菌株为目标菌株。
b.取已知相H因子血清至无菌营养肉汤中（血清与营养肉汤的体积之比为1:500），混匀，接种目标菌株，于36 ℃±1 ℃培养20 h，获得培养物；
c.将培养物转移至无菌离心管内，于6000 r/min条件下离心5 min，移弃上清，保留离心管底部的菌体沉淀；
d.向含有菌体沉淀的离心管内添加无菌生理盐水（无菌生理盐水与培养物的体积之比为1:2），用移液器轻轻吹吸，直至菌体完全悬浮，再次于6000 r/min条件下离心5 min，移弃上清，完成洗菌步骤；
e.向完成洗菌步骤的离心管内添加无菌生理盐水（菌体沉淀与无菌生理盐的体积之比为1:3），用移液器轻轻吹吸混匀，得到菌悬液；
f.取13 μL待检相H因子血清滴加于干净玻片上，取1 μL菌悬液添加至血清液滴中，混匀并倾斜摇动玻片，1 min之内观察凝集现象；同时在玻片另一区域用无菌生理盐水代替待检相H因子血清，与菌悬液混匀后作为对照；H抗原位相变异试验结果为CODE2（H 5）、CODE8（H 5）。
血清型的完整鉴定结果如表2所示，同样用简易平板法对血清分型结果进行平行验证，验证结果显示两种方法的鉴定结果完全一致。
实施例3:
对一株鼠伤寒沙门氏菌（菌株编号：CGMCC1.1174）进行血清分型的验证实验。即将菌株活化后按以下步骤进行后续试验：
a.对待检的沙门氏菌菌株进行O抗原的血清凝集反应，根据O抗原的分群情况依次检查第1相和第2相H因子，鉴定结果为O 4: H i，所以确定为目标菌株;
b.取已知相H因子血清至无菌营养肉汤中（血清与营养肉汤的体积之比为1:800），混匀，接种目标菌株，于36 ℃±1 ℃培养24 h，获得培养物；
c.将培养物转移至无菌离心管内，于8000 r/min条件下离心5 min，移弃上清，保留离心管底部的菌体沉淀；
d.向含有菌体沉淀的离心管内添加无菌生理盐水（无菌生理盐水与培养物的体积之比为1:3），用移液器轻轻吹吸，直至菌体完全悬浮，再次于8000 r/min条件下离心5 min，移弃上清，完成洗菌步骤；洗菌步骤再重复1次；
e.向完成洗菌步骤的离心管内添加无菌生理盐水（菌体沉淀与无菌生理盐的体积之比为1:5），用移液器轻轻吹吸混匀，得到菌悬液；
f.取15 μL待检相H因子血清滴加于干净玻片上，取2 μL菌悬液添加至血清液滴中，混匀并倾斜摇动玻片，1 min之内观察凝集现象；同时在玻片另一区域用无菌生理盐水代替待检相H因子血清，与菌悬液混匀后作为对照；
目标菌株的第2相H抗原的玻片凝集检查结果为H 2，符合鼠伤寒沙门氏菌的血清型特征。
在上述3个实施例的实施过程中，发现采用本发明的技术方案时位相变异后的H因子血清凝集速度更快、现象更明显、干扰小，位相变异试验的重复性更好、成功率更高。可靠的鉴定结果也说明本发明的沙门氏菌H抗原的位相变异试验方法具有较高的可行性和实用性。
熟悉本领域的一般技术人员应该认识到，本发明技术方案的试验条件包括一定的范围，例如：培养目标菌株时血清与营养肉汤的体积之比为1:200~1:800，目标菌株的培养时间为18~24 h，将培养物离心时离心转速为5000~8000 r/min、离心时间为5~10 min，洗菌步骤中无菌生理盐水与培养物的体积之比为1:1~1:3，洗菌步骤可以重复1次或者多次，制备菌悬液时菌体沉淀与无菌生理盐的体积之比为1:2~1:5，在干净玻片上滴加待检相H因子血清时血清的滴加量为10~15 μL，向血清液滴中添加菌悬液时菌悬液的添加量为1~2 μL。当采用上述范围内的试验条件时，本发明的技术方案也能达到实施例1、实施例2或实施例3相同的效果。
以上通过对所列实施方式的介绍，阐述了本发明的基本构思和基本原理。显然，所述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，并非限定性穷举。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。