黄体酮混悬型长效注射剂及其制备方法和黄体酮混悬注射粉针与流程

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种黄体酮的新剂型，特别涉及黄体酮混悬型长效注射剂及其制备方法，以及黄体酮混悬注射粉针。

背景技术：

黄体酮(progesterone)，又名孕酮，为白色或微黄色结晶粉末，熔点127～131℃，无臭，在空气中稳定，有右旋光性，不溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、二氧六环和浓硫酸。黄体酮的化学名称为：孕甾-4-烯-3,20-二酮，分子式：c21h30o2，分子量：314.47，结构式如下：

黄体酮是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，是维持妊娠的重要激素。黄体酮在怀孕期间有许多功能，其功能包括：通过诱导分泌的变化促进和帮助子宫内膜更容易接受早期胚胎，这是受精卵成功着床和维持正常妊娠所必需的，并通过一氧化氮合酶的负转录调控抑制子宫肌层的收缩引起子宫平静。黄体酮能显著增加血中孕激素浓度，改善因缺乏孕激素或黄体功能不足所导致的各种症状和疾病，包括：(1)主治黄体功能不全造成的经前综合征与流产；(2)由于无排卵所致的功能性子宫出血或闭经等进行撤退出血；(3)补充黄体不足造成的各种疾病；(4)与雌激素周期使用对抗单纯雌激素对内膜的作用。

目前国内已有的黄体酮制剂主要包括：胶囊，胶丸，凝胶，缓释凝胶，软胶囊，透皮吸收霜，注射液等。按照给药途径分类，黄体酮主要有口服和注射两种剂型等。

其中，口服制剂给药方便快捷，患者易于接受，但是口服黄体酮会在胃肠道及肝脏迅速破坏，难以起到补充和治疗作用。由于黄体酮溶解度极低，且首过效应严重，口服生物利用度仅为10％。口服制剂往往通过增加表面活性剂浓度来提高黄体酮溶解度，不能从根本上解决黄体酮首过效应强、生物利用度低的问题；每天的给药剂量仍需很大才能达到疗效，因此未能从根本上解决黄体酮体内代谢快，生物利用度低的问题。

由于上述种种原因，注射给药途径在中国仍是黄体酮的主要给药方式。辅助生殖过程中，用于提供黄体支持的现有制剂主要为黄体酮油溶液注射剂。由于该制剂为肌肉注射油溶液，且需每天注射，长期注射(约12周)。油溶液注射时极易引起患者不适，如疼痛、局部红肿、过敏等症状，个别病理报道甚至指出肌肉注射黄体酮可诱发急性嗜酸性粒细胞肺炎。且油剂黄体酮半衰期长，通常要数周时间才能恢复。长期高频次注射也会导致注射部位产生硬结等其他症状，不利于注射部位组织健康。患者均为孕妇，每天注射黄体酮极为不便，且黄体酮注射存在油溶剂易引起肌肉板结、疼痛等问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请提供一种黄体酮混悬型长效注射剂及其制备方法，本发明通过肌肉注射该混悬剂，能够达到为期一周或更久的缓释效果，使药物平稳释放，提高生物利用度，且生物相容性好，刺激性小，同时提高患者顺应性。

本发明提供一种黄体酮混悬型长效注射剂，包含以下重量百分比的组分：

2.5％～15％的黄体酮；

0.1％～2％的初级稳定剂，所述初级稳定剂选自聚乙二醇、聚维酮、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠和卵磷脂中的一种或多种；

0.01％～1％的次级稳定剂，所述次级稳定剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、聚氧乙烯蓖麻油和脱氧胆酸钠中的一种或多种；

0～1％的ph调节剂；

0～2％的渗透压调节剂；

余量的注射用水。

本发明还提供一种黄体酮混悬注射冻干粉针，由黄体酮混悬液经冷冻干燥制得，所述黄体酮混悬液包含以下重量百分比的组分：

2.5％～15％的黄体酮；

0.1％～2％的初级稳定剂，所述初级稳定剂选自聚乙二醇、聚维酮、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠和卵磷脂中的一种或多种；

0.01％～1％的次级稳定剂，所述次级稳定剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、聚氧乙烯蓖麻油和脱氧胆酸钠中的一种或多种；

0～1％的ph调节剂；

0～2％的渗透压调节剂；

余量的注射用水。

混悬型长效注射剂，是指将不溶性或难溶性固体药物分散于液体分散介质中制成的一类供肌肉或静脉注射用的制剂。药物注射后，在注射部位形成贮库结构，使药物缓慢释放，从而达到长效作用的目的。目前常用制备方法分为以下两大类：top-down(自上而下)法和bottom-up(自下而上)法，top-down法包括研磨法、高压均质法等，bottom-up法包括反溶剂法。粉针剂是将药物与试剂混合后，经消毒干燥形成的粉状物品，便于运输保存。

本发明的目的在于提供一种稳定的黄体酮长效注射剂，制剂通过微米化及纳米化，并加入稳定剂，可制成混悬剂或者冻干粉针或者普通粉针，可用于肌肉或皮下注射给药。该混悬剂能解决难溶药物给药的问题，所用辅料少，载药量大，可以显著改善生物利用度，减少给药次数。

本发明公开了一种用于先兆性流产及辅助生殖黄体支持的黄体酮混悬型长效注射剂，以及制备该混悬剂的方法。所述制剂，包括一般意义上的混悬液和冻干粉针等，可以用于皮下或肌肉注射。本发明通过肌肉注射混悬剂能够达到为期一周或更久的缓释效果，使药物平稳释放，提高生物利用度，同时提高患者顺应性。并且，本发明制备工艺简单可控，可实现工业化生产。实验数据表明，肌肉注射后，本发明所述黄体酮制剂可达到为期至少一周的缓释效果。

本发明实施例提供的其中一种黄体酮混悬剂，为普通意义上的混悬液，可制备为预充式注射剂，由以下成分按重量百分比组成：

本发明实施例提供的另一种黄体酮混悬冻干粉针，临用时加水振摇，即可分散成混悬液，由以下成分按重量百分比组成：

本发明所述的黄体酮混悬注射剂及冻干粉针中，所述的初级稳定剂选自聚乙二醇、聚维酮、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠和卵磷脂中的一种或多种。其中，所述聚乙二醇可采用聚乙二醇4000等市售产品。

本发明所述的黄体酮混悬注射剂及冻干粉针中，所述的次级稳定剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、聚氧乙烯蓖麻油和脱氧胆酸钠中的一种或多种。其中，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯如吐温80等市售产品。

在本发明中，所述初级稳定剂与次级稳定剂配合使用才可获得良好效果。在本发明的实施例中，羟丙甲纤维素、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、羧甲基纤维素钠的稳定效果相对较好；聚维酮、聚乙烯醇、卵磷脂等效果不佳。在本发明的优选实施例中，所述初级稳定剂选自聚乙二醇、羟丙甲纤维素或羧甲基纤维素钠；所述次级稳定剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯或维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。

在本发明的实施例中，所述黄体酮混悬型长效注射剂包含2.5％～15％的黄体酮，优选为3～10％。本发明所述的黄体酮混悬注射剂及冻干粉针中，黄体酮选自黄体酮晶型1、黄体酮晶型2或它们的混合物。在本发明的实施例中，所述黄体酮混悬型长效注射剂包含0.1～2％的初级稳定剂，优选包含0.3～1.5％，如用量方面，羟丙甲纤维素使用0.3％即可达到稳定效果。所述黄体酮混悬型长效注射剂包含0.01～1％的次级稳定剂，优选为0.02～0.5％。

本发明实施例所述的黄体酮混悬注射剂及冻干粉针中，所述的ph调节剂选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、盐酸、乳酸、氢氧化钠、枸橼酸盐和酒石酸盐中的一种或几种。所述渗透压调节剂优选选自氯化钠、葡萄糖和甘油中的一种或多种，更优选为氯化钠。所述黄体酮混悬型长效注射剂包含0～1％的ph调节剂；本发明实施例可以不使用ph调节剂，也可以使用0.1～0.5％。所述黄体酮混悬型长效注射剂包含0～2％的渗透压调节剂，优选包含0.05％～1％。

本发明实施例所述的黄体酮混悬注射冻干粉针中，所述的冻干保护剂可选自乳糖、麦芽糖、葡萄糖、海藻糖、丙三醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、磷酸盐、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、羧甲基纤维素钠(cmc-na)、聚乙二醇和白蛋白中的一种或几种，优选为甘露醇。

本发明实施例所述的黄体酮混悬注射剂及冻干粉针中，黄体酮微粒的平均粒径选自小于20微米、小于10微米、小于5微米以及小于1微米；具体可为1微米～3微米、2微米左右。

本发明所述的黄体酮混悬注射剂及冻干粉针，通过肌肉或者皮下注射后，混悬剂能够达到为期一周或更久的缓释效果，可明显改善生物利用度且提高患者顺应性。

上文所述的黄体酮混悬型长效注射剂的制备方法，包括：

采用湿法研磨法、反溶剂-高压均质法或微射流法，将黄体酮制成黄体酮混悬型长效注射剂。

本发明所述的第一种黄体酮混悬注射剂可以采用以下方法制备，包括：湿法研磨法、反溶剂-高压均质法、微射流法或它们的组合。

其中，湿法研磨法的步骤具体为：将黄体酮与水以及辅料按照一定比例混合，搅拌使分散均匀，用湿法研磨机进行研磨，得到黄体酮混悬剂。在本发明的优选实施例中，采用湿法研磨法时，所采用的研磨珠为氧化锆珠和聚苯乙烯珠。具体地，可以1500rpm的转速循环研磨10min，得到黄体酮混悬液。

反溶剂-高压均质法的步骤具体为：将黄体酮分散在有机溶剂如甲醇中，可加热超声，至黄体酮完全溶解，将该溶液加入一定量含有稳定剂的水中或将水加入有机溶液中，使黄体酮析出，得到黄体酮混悬液初液，然后用高压均质进行均质，得到小于220nm的黄体酮混悬剂，还可过膜过滤除菌。高压均质可包括：在低压300bar循环6次后，高压900bar循环10次。在反溶剂-高压均质法中，可通过过膜除菌解决无菌问题，不必全程无菌操作，降低了生产成本；同时加入某些稳定剂可获得适当粒径和形状的制剂。

微射流法的步骤具体为：将黄体酮分散在水中，并添加辅料，加入微射流机中，在10000psi压力下循环1次，在20000psi压力下循环3次，完成超微化处理，得到黄体酮混悬剂。

本发明所述的第二种黄体酮混悬注射冻干粉针，可通过在第一种混悬剂中加入一定量的冻干保护剂，分装，进行冷冻干燥，制得黄体酮混悬冻干粉针。制备所述黄体酮混悬注射冻干粉针的方法可包括：在黄体酮混悬液中加入1％～20％的冻干保护剂，进行冷冻干燥，获得黄体酮混悬注射冻干粉针。在本发明实施例的冻干过程中，在适宜冻干保护剂和冻干工艺条件下，晶体聚集长大，制备得到适宜粒径的黄体酮冻干粉针。具体的，冻干工艺可包括：-40℃预冻四小时，抽真空，-40℃维持两个小时，两个小时升至-20℃维持三个小时，一个小时升至-10℃维持两个小时，两个小时升至0℃维持两个小时，两个小时升至20℃维持两个小时。

或者，本发明实施例将混悬液喷雾干燥，制得普通的黄体酮混悬注射粉针剂。

在本发明中，上述的黄体酮混悬注射剂可以用于先兆性流产及辅助生殖中提供黄体支持等。本发明所述混悬剂通过微米化及纳米化，并加入一些稳定剂，可制成混悬剂或者冻干粉针等，可用于肌肉或皮下注射给药。本发明混悬剂解决了难溶药物给药的问题，所用辅料少，载药量大，可以显著改善生物利用度，达到为期一周或更久的缓释效果，减少给药次数。并且，本发明制剂的制备工艺简单可控，可实现工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例2所得黄体酮混悬液的粒度分布图；

图2为本发明实施例2所得黄体酮混悬液中黄体酮微粒显微成像图；

图3为本发明实施例2所得黄体酮混悬液与市售制剂sd大鼠肌肉注射病理切片；

图4为本发明实施例2所得黄体酮混悬液与市售制剂sd大鼠肌肉注射血浆药时曲线。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的黄体酮混悬型长效注射剂及其制备方法和黄体酮混悬注射粉针进行具体地描述。

以下实施例中，所用的黄体酮晶型为晶型1，黄体酮原料药粒径为60μm，所得到的混悬液平均粒径为2μm；所用的cmc-na和聚维酮均为药用级。

实施例1

黄体酮混悬注射剂的制备(湿法研磨法)

处方(100支)：

制备工艺：

(1)制备研磨介质，将3g聚乙二醇4000、0.3g吐温80和2.7g氯化钠溶于300ml注射用水中，搅拌直到完全溶解，作为研磨介质。

(2)将200ml氧化锆研磨珠倒入研磨腔体，将15g黄体酮分散于150ml研磨介质中，倒入腔体，用剩余介质转移残留药物。

(3)以1500rpm转速循环研磨10min，得到黄体酮混悬液，在无菌条件下分装入预充式注射器中，制得100支预充式注射液。

实施例2

黄体酮混悬注射剂的制备(湿法研磨法)

处方(100支)：

制备工艺：

(1)制备研磨介质，将1.35g羧甲基纤维素钠、0.15g吐温80和2.7g氯化钠溶于300ml注射用水中，搅拌直到完全溶解，作为研磨介质。

(2)将200ml氧化锆研磨珠倒入研磨腔体，将7.5g黄体酮分散于150ml研磨介质中，倒入腔体，用剩余介质转移残留药物。

(3)以1500rpm转速循环研磨10min，得到黄体酮混悬液在无菌条件下分装入预充式注射器中，制得100支预充式注射液。

实施例3

黄体酮混悬注射剂的制备(微射流法)

处方(100支)：

制备工艺：

(1)称取黄体酮15g，加入聚维酮3g、吐温800.3g，加入300ml注射用水，搅拌均匀，得到初混悬液。

(2)将初混悬液加入微射流机中，在10000psi压力下循环1次，在20000psi压力下循环3次，进行微粉化处理，得到粒径均匀的黄体酮混悬液。

(3)将得到的黄体酮混悬液在无菌条件下分装入预充式注射器中，制得100支预充式注射液。

实施例4

黄体酮混悬注射冻干粉针的制备(反溶剂-高压均质法)

处方(100支)：

制备工艺：

(1)称取黄体酮10g，加入甲醇100ml，加热溶解，缓慢加入到含有0.3g吐温80的5000ml蒸馏水中，在转速为500rpm搅拌下加入，加入完成后继续搅拌30min，得到初混悬液。

(2)将初混悬液加入高压均质机中，在低压300bar循环6次后，高压900bar循环10次，得到粒径小于220nm的均匀黄体酮混悬液，过220nm滤膜除菌。

(3)向混悬液中加入甘露醇15g作为冻干保护剂，搅拌均匀，分装入西林瓶中，每瓶3ml，共100瓶，进行冷冻干燥，其工艺包括：-40℃预冻四小时，抽真空，-40℃维持两个小时，两个小时升至-20℃维持三个小时，一个小时升至-10℃维持两个小时，两个小时升至0℃维持两个小时，两个小时升至20℃维持两个小时，制得黄体酮混悬注射冻干粉针。

实施例5

黄体酮混悬注射冻干粉针的制备

处方(100支)：

制备工艺：

(1)制备研磨介质，将3g聚乙二醇4000、0.3g吐温80和2.7g氯化钠溶于300ml注射用水中，搅拌直到完全溶解，作为研磨介质。

(2)将200ml氧化锆研磨珠倒入研磨腔体，将15g黄体酮分散于150ml研磨介质中，倒入腔体，用剩余介质转移残留药物，以1500rpm转速循环研磨10min，得到黄体酮混悬液。

(3)向混悬液中加入甘露醇15g作为冻干保护剂，搅拌均匀，分装入西林瓶中，每瓶3ml，进行冷冻干燥，工艺同实施例5，制得黄体酮混悬注射冻干粉针。

实施例6

试验1粒径大小和粒度分布

将本发明实施例2所得混悬液用注射用水稀释，用激光粒度分析仪测定粒径大小和粒度分布，结果见图1，图1为本发明实施例2所得黄体酮混悬液的粒度分布图。由图1可知，本发明实施例2采用羧甲基纤维素钠和吐温80相配合，该混悬液样品粒径约为2μm，且粒度分布较为均匀。

在本发明的实施例中，羟丙甲纤维素、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、羧甲基纤维素钠的稳定效果相对较好；聚维酮、聚乙烯醇、卵磷脂等效果相对不佳。相对较好的稳定剂，粒度分布较窄，跨度控制在2以内；效果差的稳定剂，研磨过程中沉降严重且粒度分布宽，跨度均大于3。

试验2微粒显微成像图

将本发明实施例2所得混悬液用注射用水稀释，用显微镜观察其形态及聚集情况，结果见图2，图2为本发明实施例2所得黄体酮混悬液中黄体酮微粒显微成像图。由图2可知，该混悬液样品粒径约为2μm，与激光粒度测定结果一致，说明混悬液较为稳定，粒度均匀。

实施例7

sd大鼠肌肉注射黄体酮混悬剂、黄体酮油溶液舐足试验

试验动物：sd雄性大鼠，体重190g～210g，24只，随机分为四组，每组6只。

黄体酮混悬剂a，按照实施例2制得，稀释至浓度为20mg/ml；

黄体酮注射液b，市售(浙江仙琚制药股份有限公司，黄体酮油溶液)，1ml：20mg；

阳性对照：50％葡萄糖；

阴性对照：生理盐水。

试验方法与结果：

向每只大鼠右后爪的足垫皮下注射0.1ml；注射后，记录第一次舐足的时间，同时记录在3、6、9、12、15和30分钟内累积舐足时间，结果见表1。

表1sd大鼠给药30min内舐足试验结果

根据表1可得出以下结论：本发明黄体酮混悬剂和油溶液与阳性对照组有显著性差异(p1<0.05)，而与阴性对照组无显著性差异(p2>0.05)。说明二者对大鼠皮下注射后，对足下组织的刺激性较小。然而，比较舐足发生率、开始时间、持续时间以及抬足行为，黄体酮油溶液会导致较为明显的刺激性；而黄体酮混悬剂舐足时间更短，且与阴性对照组(生理盐水)相近，说明本发明黄体酮混悬剂局部刺激性非常微弱，有明显优势。

实施例8

sd大鼠肌肉注射黄体酮混悬剂、黄体酮油溶液刺激性评价

试验动物：sd雄性大鼠，体重190g～210g，6只，随机分为两组，每组3只。

黄体酮混悬剂，按照实施例2制得，稀释至浓度为20mg/ml；

黄体酮注射液，市售(浙江仙琚制药股份有限公司，黄体酮油溶液)，1ml：20mg。

试验方法与结果：

对大鼠肌内给药，并分别于给药1d、7d、14d处死，制作病理切片，观察炎症反应。

结果参见图3，图3为本发明实施例2所得黄体酮混悬液与市售制剂sd大鼠肌肉注射病理切片。图3中，上排“a-”为本发明黄体酮混悬液给药后1天、7天和14天后的肌肉组织切片结果；下排“b-”为油溶液给药后1天、7天和14天后的肌肉组织切片结果。

从图3可以看出，在显微镜下，黄体酮油溶液注射7d和14d的后肌肉细胞均被大量炎性细胞浸润，即产生急性炎症反应；而对于本发明黄体酮混悬剂，给药7d后，肌肉细胞周围有少量炎性细胞。而在14d后，肌肉组织无炎性细胞浸润，说明本发明黄体酮混悬剂注入肌肉组织后引起了轻微的炎症反应，两周后肌肉细胞恢复到正常状态。

舐足试验和病理性研究结果一致，与黄体酮油溶液相比，本发明黄体酮混悬液生物相容性好，且肌肉刺激性低。

实施例9

sd大鼠肌肉注射黄体酮混悬剂、黄体酮油溶液的血浆药动学比较试验

黄体酮混悬剂，按照实施例2制得；

黄体酮注射液，市售(浙江仙琚制药股份有限公司，黄体酮油溶液)，1ml：20mg。

试验动物：sd雄性大鼠，体重190g～210g，12只，随机分为两组，每组6只。

给药剂量：黄体酮混悬剂：44.1mg/kg，一周注射一次；

黄体酮注射液(油溶液)：6.3mg/kg，每天注射；

给药方式：肌肉注射。

试验仪器：waters液相色谱-质谱联用仪，包括四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，电喷雾离子化接口，三重四级杆质谱检测器，waters系统色谱工作站，acquitytmultraperformancelc超高相液相系统为美国waters公司产品。

试验方法与结果：

黄体酮混悬液组：3只大鼠，分别肌肉注射黄体酮混悬液，剂量为44.1mg/kg，并于给药后0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，12h，1d，1n(night)，2d，2n，3d，3n，4d，4n，5d，5n，6d，6n，7d，7n，由大鼠眼内眦取血，置经肝素处理的离心管中，离心分离血浆，-20℃冰箱保存。检测血浆中黄体酮的血药浓度，所得黄体酮的血浆药物浓度经时变化曲线见图4，图4为本发明实施例2所得黄体酮混悬液与市售制剂sd大鼠肌肉注射血浆药时曲线。

黄体酮注射液组：3只大鼠，分别肌肉注射黄体酮注射液，用注射用油稀释至适当浓度，剂量为6.3mg/kg，于首次给药后0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，12h，取血；后每日给药一次，在每天给药前和给药12h后取血，测定血浆药物浓度，持续7天；第八天达到血药浓度稳定后再于给药后0.5h，1h，1.5h，2h，3h，4h，6h，8h，12h取血置经肝素处理的离心管中，离心分离血浆，-20℃冰箱保存。检测血浆中黄体酮的血药浓度，所得黄体酮的血浆药物浓度经时变化曲线见图4，具体数据分别见表2和表3。黄体酮混悬液组和油溶液组auc计算结果见表4。

表2黄体酮混悬液sd大鼠肌肉注射时间-血药浓度表

表3黄体酮注射液组多次给药时间-血药浓度表

表4黄体酮混悬液组和油溶液组auc计算结果

从以上结果可以得出结论：本发明黄体酮混悬液单次肌肉注射后，与普通市售制剂每日给药一次药时曲线趋势基本一致，黄体酮混悬液组相对生物利用度能够达到94.20％，且混悬剂肌肉注射后释放平缓，血药浓度在较长时间内处于一种稳定释放的状态。因此，本发明黄体酮混悬液注射液能够达到缓释效果，大大减少给药次数，提高患者顺应性，具有开发价值。