靶向JAML受体的单链抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种靶向JAML受体的单链抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术：

JAML(junctional adhesion molecule–like protein)，作为JAMs(Junctional adhesion molecules)蛋白家族的一员，可以促进嗜中性粒细胞以及单核细胞到内皮细胞上的粘附，介导血液循环中的白细胞在炎症部位聚集的过程；JAML也可以介导γδT细胞的活化增殖，促使细胞分泌细胞因子IL-2、TNFα、IFN-g。因此JAML可作为免疫治疗的靶点，例如急性或慢性创伤修复等。

目前已有文献发现HL4E10是针对于JAML受体靶点的外源刺激性抗体，HL4E10与JAML内源性受体CAR具有相同效应，两者结合后可使γδT细胞或者单核-巨噬细胞产生细胞因子、生长因子以及激活MAP通路的活化等，因此可引起细胞的增殖等效应。

单链抗体是抗体可变区轻链(VL)和重链(VH)由一个肽链linker(10-15个氨基酸)链接区来连接的。完整抗体的相对分子质量较大，体内应用时难以穿越血管进入靶部位。单链抗体相对分子质量小，容易通过血管壁，容易穿透实体瘤，是导向药物首选的载体；单链抗体免疫原性弱，不易引起超敏反应和排斥反应；单链抗体无FC段，不与非靶细胞的FC受体结合，单链抗体在体内清除快；单链抗体易于构建和表达，易于大批量制备等优点。目前，尚未发现有靶向JAML受体的相关单链抗体的报道。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种靶向JAML受体的单链抗体及其制备方法和应用，用于解决现有技术中的不足。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种靶向JAML受体的单链抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或其保守型变异序列，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或其保守型变异序列。

SEQ ID NO:1具体的为:V L E P L S L T V I S G W Q G L M I A T N L R I D K V K S Q T Y A F Y V Q Q V

SEQ ID NO:2具体的为:S L P V A Q T C D S Y W Q G P V E R S P F S G A T K A E Y Q D N W G T T G N

优选地，其重链可变区和轻链可变区的连接区序列如SEQ ID NO:3所示或其保守型变异序列。

SEQ ID NO:3具体的为G S G G G.

本发明的另一个方面提供了一种分离的DNA分子，编码如权利要求1-2任一权利要求所述的抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸序列。

所述DNA分子可以如SEQ ID NO:4所示，所述SEQ ID NO:4具体如下：GATATCCATCATCATCATCATCATAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGTTGCAGCCCTCACAGACCCTGTCTCTCACCTGCACTGTCTCTGGGATCTCATTATCGGACTATGGTGTACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGATGGGAATAATAGGTCATGCTGGAGGCACTGATTATAATTCAAATCTCAAATCCCGAGTCAGCATCAGCAGGGACACCTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTACAACAGGAGGACACAGCCATGTATTTCTGTGCTAGACATTTCTATACTTACTTTGATGTCTGGGGCCAGGGGATCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCAGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCTCATATACACTGACTCAACCTCCCTTAGTATCAGTGGCCCTAGGTCAAAAGGCCACAATCACCTGCTCTGGAGATAAACTCTCAGATGTGTATGTTCACTGGTATCAGCAGAAGGCAGGCCAGGCTCCTGTATTGGTCATATATGAAGATAATCGGCGTCCCTCTGGCATCCCAGACCACTTTTCTGGCTCCAACTCAGGGAACATGGCCACGCTGACCATCAGCAAAGCCCAGGCTGGAGATGAAGCTGACTATTACTGTCAATCTTGGGATGGTACTAATAGTGCTTGGGTGTTCGGTTCAGGCACCAAAGTGACTGTCCTAGGTCAGCCCAATTGAAAGCTT

所述靶向JAML受体的单链抗体、分离的DNA分子也可通过现有技术利用化学合成的方法获得。

本发明的另一个方面提供了一种构建体，包含如所述的分离的DNA分子。

本发明的另一个方面提供了一种单链抗体表达的表达系统，由上述的构建体转染到宿主细胞构建而成。

本发明的另一个方面提供了所述的靶向JAML受体的单链抗体的制备方法，包括如下步骤：

(5)获得目的基因；

(6)构建重组质粒：将步骤(1)所得的目的基因及其载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组质粒；

(7)将步骤(2)所得的重组质粒转化宿主感受态细胞；

(8)诱导表达单链抗体。

优选地，所述步骤(2)中限制性内切酶为HindIII，EcoR V，所述载体质粒为pET-20b(+)。所述pET-20b(+)载体质粒根据现有技术获得。

优选地，所述步骤(3)中所述感受态细胞为BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL感受态细胞。

优选地，还包括步骤(5)分离纯化单链抗体：采用His-Tag Ni柱纯化单链抗体，然后采用分子筛层析法进一步纯化。

本发明的另一个方面提供所述的靶向JAML受体的单链抗体在制备血液系统疾病、肿瘤、细菌性感染、血管动脉硬化、风湿性疾病治疗药物或诊断药物中的用途。

所述血液系统疾病可以是再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、骨髓增生异常综合征、急性早幼粒细胞白血病等。

所述肿瘤可以是胃癌、肺癌、肝癌等。

如上所述，本发明的靶向JAML受体的单链抗体及其制备方法和应用，具有以下有益效果：

(1)本发明首次对靶向JAML受体的HL4E10全抗进行单链抗体化改造，并且提供了HL-scfv的原核表达系统，使简单、大量制备抗JAML蛋白抗体成为可能，让靶向JAML的单链抗体HL-ScFv的应用更具有前景。

(2)本发明使用分子筛层析法进一步纯化由His-Tag Ni柱纯化得到的蛋白，这样的纯化方法使得到的目的蛋白纯度更高，有利于接下来实验的开展。

(3)本发明利用多种实验手段验证了HL-ScFv对细胞表面JAML受体的亲和活性，确保了最后得到的单链抗体分子较高的亲和活性、内化活性，为靶向JAML受体的临床应用奠定了基础。

附图说明

图1双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图

图2 Western Blot检测超声破菌后粗提得到的HL-scFv

图3蛋白粗提液的His-Tag Ni柱亲和层析图谱

图4蛋白粗提液纯化后收集洗脱峰样品SDS-PAGE电泳图

图5蛋白质分子筛层析图谱

图6蛋白质分子筛层析纯化后收集洗脱峰样品SDS-PAGE电泳图

图7流式细胞仪检测结果图

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1靶向JAML受体的单链抗体序列设计及表达载体pET-20b(+)/HL-scFv构建并获取目的蛋白

1.HL-ScFv基因序列的设计

2.载体pET-20b(+)与目的片段HL-ScFv的制备

(1)从DH5α感受态细胞中提取质粒作为载体，将pET-20b(+)载体(委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成)与pUC57/HL-scFv全基因分别进行EcoR V/HindIII双酶切反应。按照双酶切体系加入量将反应物加入，37度，酶切反应1h。

(2)1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。如图1所示，构建好的载体经HindIII，EcoRV双酶切后，得到两个片段，大小与目的基因序列(HL-scFv)和载体(pET-20b(+))吻合。

(3)回收线性化载体和目的片段。

3.载体pET-20b(+)与目的片段HL-scFv的连接

将线性化pET-20b(+)载体片段和目的DNA片段HL-ScFv按摩尔比1:3用T4连接酶

连接，反应物按连接反应体系加入量加入混匀，16度，过夜连接反应。

4.pET-20b(+)/HL-scFv转化DH5α感受态细胞将连接反应液转化。

5.双酶切验证pET-20b(+)/HL-scFv是否构建成功。

6.将构建成功的转化后混合物涂布于含有氨苄青霉素(Amp)，链霉素(Str)，氯霉素(Chl)的培养板，37摄氏度过夜培养。挑取单克隆菌落接种于含Amp、Str、Chl的LB培养基，37℃过夜培养后得种子液。取300ul BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL/pET-20b(+)/HL-scFv甘油菌，1:100接种到30ml LB培养基(Amp+，Str+，chl+)中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。取30ml菌液按1:100接种到3000ml LB培养基(Amp+，Str+，Chl+)中，37℃，200rpm,振荡培养约3h至OD600为0.2，降温至16℃，加入IPTG诱导终浓度为0.2mM，16℃,200rpm诱导16h。收集菌液，8000rpm，4℃离心30分钟，弃上清，取菌体沉淀。

7.HL-scfv的粗提取及纯化

采用超声破菌的方法粗提取目的蛋白：按照每1L培养基菌体量加入30ml裂解缓冲液，震荡重悬菌体，在冰水浴上平衡30min。然后置于冰上超声，参数为：5s on，8s off，30min，250w。超声后溶液13000rpm，4℃离心30分钟，弃沉淀，保留上清，0.45um滤头过滤，即得蛋白粗提液。Western Blot检测超声破菌后粗提得到的HL-scFv，结果如图2所示。

蛋白粗提液用AKTA-purifier蛋白纯化仪，配His-Tag Ni柱(GE)纯化，亲和层析图谱如图3所示。

纯化参数为：平衡条件：5％B

洗脱条件：梯度洗脱10％B-20％B-30％B-100％B

流速：1ml/min

分管收集洗脱峰蛋白溶液，1ml/管。SDS-PAGE检测每管样品，如图4所示，合并含有目的蛋白的样品，超滤至终体积10ml，上样品至琼脂糖凝胶柱，分子筛层析分离目的蛋白，如图5所示。分子筛层析纯化后收集洗脱峰样品SDS-PAGE电泳，结果如图6所示。将得到的目的蛋白溶液用截留分子量为10kDa透析袋透析除掉缓冲体系中的咪唑，超滤浓缩后得到纯化的HL-scFv蛋白样品。

实施例2单链抗体HL-scFv与JAML过表达细胞的亲和力检测

选择JAML过表达人外周血的单核细胞系THP-1和JAML过表达小鼠巨噬细胞Raw264.7作为亲和力检测的细胞系。

流式细胞仪检测HL-ScFv和阳性细胞的结合

1)细胞计数：阳性细胞，5*10^5个/管。

2)孵育HL-ScFv：Staining Buffer洗2遍，加入HL-scFv样品，5ug/管，4℃孵育1h。

3)孵育二抗：Staining Buffer洗3遍，加入PE-His Tag antibody，1ug/管，4℃孵育30min。

4)检测：Staining Buffer洗3遍，流式细胞仪检测结合效率，PE通道下计数10000个细胞Flowjo 6.0分析结果，结果如图7所示。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。