人源性抗胰淀素抗体及其制备方法与流程

文档序号：12342435阅读：456来源：国知局

本发明属于免疫球蛋白领域，具体是一种人源性抗胰淀素抗体及其制备方法。

背景技术：

胰淀素（Amylin）是胰岛B细胞分泌的激素，与胰岛素共贮存于B细胞的分泌颗粒中，两者在葡萄糖及非糖激素刺激下以一定比例相伴释放到胰岛B细胞外。体内代谢过程类似于C-肽，研究发现，胰淀素在肝脏的代谢速度远较胰岛素慢，而且胰淀素主要经肾脏排泄。现已发现胰淀素是一个多效激素，以多重角色参与了机体的物质及能量代谢过程，但其确切的生物学功能尚不清楚。胰岛淀粉样蛋白(IA)的主要构成成分是胰淀素，尸检发现90%以上Ⅱ型糖尿病者胰岛中有IA的沉积。研究表明，可溶性、具有细胞毒性的胰淀素聚集体是胰岛淀粉样蛋白变性纤维形成过程中的早期中间产物，这种聚集体被称之为中等大小毒性淀粉样蛋白颗粒，可以破坏胰岛细胞双层脂质膜，导致细胞内环境的紊乱、离子浓度的改变，引起氧化应激反应，最终胰岛细胞发生凋亡。

胰淀素与Ⅱ型糖尿病的关系越来越受到重视并逐步确认，同时也存在不少争议，而胰淀素的确切生物学功能尚未完全清楚，制备该激素高纯度抗体是进一步研究这一激素的生理病理作用的关键。然而由于该激素的分子量小、体内含量低，采用单克隆抗体免疫法检测其方法复杂，抗体缺乏稳定性和特异性；用传统制备抗体的方法，如杂交瘤技术和抗原免疫的方法制备抗体得到的抗体少，且工作繁琐，周期较长，制备出来的抗体缺乏稳定性和特异性，因此给研究这一激素在体内的广泛的生理和病理作用带来阻力，因此制备该激素高纯度抗体是进一步研究这一激素的关键。

抗体技术发展经历了三个阶段：第一代为抗血清多克隆抗体（Polyclonal Antibody，PcAb）, 第二代为70 年代中期德国学者Kohler和英国学者milstein利用B淋巴细胞杂交瘤技术（细胞工程生成抗体的技术）制备了杂交瘤单克隆抗体（Monoclonal Antibody，McAb），这一发现是生物技术发展的里程碑之一，在诊断、治疗、预防等方面已显示了重要作用。然而，由于异蛋白易引起人抗小鼠抗体（Human anti-mouse antibody ,HAMA）反应，而人杂交瘤技术又难以突破，因此出现了第三代抗体，既基因工程抗体。基因工程抗体包括三种,即嵌合抗体(chimeric antibody)、重构型抗体(reshaping antibody)和抗体库技术制备的抗体。其中前两者属于部分人源化抗体，抗体库技术制备的抗体属全人源化抗体。即用基因克隆技术将全套抗体（Repertoire）重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过在大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，筛选特异性的可变基因。采用基因工程的方法免除了杂交瘤技术繁杂的筛选过程，甚至可以不经过免疫获得针对任何抗原的特异性抗体，特别是人源抗体的获得，大大推进了抗体工程的进展，并解决了动物源性抗体用于人体治疗时产生异源反应的难题，拓宽了抗体的应用范围。

噬菌体抗体库技术的出现为人天然抗体的制备开辟了新的途径，为大量制备用于诊断和治疗的高效优质的人源抗体提供了可行性，它使得筛选潜在的人抗体片段成为可能性，较好的解决了抗体难制备的问题。该技术在肿瘤免疫治疗中取得了突破性进展。

技术实现要素：

本发明就是为了解决现有的胰淀素试剂盒比较昂贵，且传统方法制备的人源性胰淀素抗体易引起过敏反应，抗体稳定性和特异性差等问题，所提出的一种人源性抗胰淀素抗体及其制备方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种人源性抗胰淀素抗体，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

上述抗体的重链可变区DNA序列如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区DNA序列如SEQ ID NO：4所示；重链基因为IgG1 亚类VH3 基因家族，轻链基因为Lambda 基因家族。

一种上述人源性抗胰淀素抗体的制备方法，包括以下步骤：

Ⅰ.人IgG Fab 段基因的PCR扩增：分离人外周血中的淋巴细胞，提取总RNA，将提取的RNA逆转录成cDNA，用人特异性IgG Kappa链、Lambda链及重链 Gamma链引物分别对人轻链和重链基因进行PCR扩增；

Ⅱ.噬菌体抗体库的建立：步骤Ⅰ中获得的PCR 产物按Fd、κ链和λ链分别进行混合；将双酶切后的轻链 PCR 混合物和噬菌粒进行连接反应，连接产物电转化入感受态细胞，扩增摇菌后构建轻链基因库；将构建好的轻链库噬菌粒DNA和重链Fd段 PCR混合物进行双酶切，连接后电转化感受态细胞，加入培养基培养，再加入辅助噬菌体继续培养；离心收集上清后加入PEG沉淀液，冰浴，离心弃上清并重悬沉淀，再次离心收集上清即为噬菌体抗体库；

Ⅲ. 噬菌体抗体库的特异性富集与筛选：用稀释后的胰淀素包被酶联板，BSA-PBS溶液封闭后加入噬菌体抗体库，孵育，先用PBST溶液洗涤，后用Gly-HCl缓冲液洗脱，并用Tris 缓冲液中和，感染培养至对数生长期的大肠杆菌，取梯度稀释后液体铺板测定滴度，计算每轮筛选的产出率；余菌加入辅助噬菌体感染进行下一轮的富集筛选，反复3-8次；

Ⅳ.抗胰淀素抗体的Phage-ELISA检测：从筛选后的细菌菌落中随机挑取多个克隆制备单克隆噬菌体抗体，用稀释后的胰淀素包被酶联板，BSA-PBS溶液封闭后加入噬菌体上清，孵育后用PBST溶液洗涤；加入HA-Tag Mouse mAb，孵育后用PBST溶液洗涤；再加入HRP-山羊抗小鼠IgG，孵育后用PBST溶液洗涤，加TMB溶液显色，测定A450值；

Ⅴ.可变区DNA序列测定：ELISA 检测后筛选阳性克隆进行DNA测序。

本发明获得了如下的有益效果。

本发明有效的解决了现有的胰淀素试剂盒比较昂贵，且传统方法制备的人源性胰淀素抗体易引起过敏反应，抗体稳定性和特异性差等问题。本发明建立了高容量的噬菌体抗菌库，筛选出了人源性胰淀素抗体，并且该抗体具有良好的抗原特异性和抗原结合活性，为进一步的生产胰淀素检测试剂盒提供了保障，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明重链Fd段基因PCR纯化产物电泳图；

图2是本发明轻链基因PCR纯化产物电泳图；

图3是本发明轻链库经SacⅠ和XbaⅠ双酶切电泳图；

图4是本发明噬菌体抗体库经SacⅠ和SpeⅠ双酶切电泳图；

图5是本发明Phage-ELISA法检测噬菌体抗体对amylin抗原的结合活性图。

图6是本发明C1重链的二级结构图；

图7是本发明C1轻链的二级结构图。

具体实施方式

一、实验材料

噬菌粒载体pComb3XSS（4900bp）购买于美国Scripps 研究所；大肠杆菌XL1-Blue 及辅助噬菌体 VCSM13 购于美国Stratagene公司；TRNzol-A⁺ Total RNA Reagent、Quantscript RT Kit、2×Taq PCR MasterMix、普通琼脂糖凝胶回收试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒均购自TIANGEN公司；限制性内切酶 SacⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ均购自TaKaRa 公司；Amylin 片段（8-37）购自Sigma 公司；HA-Tag Mouse mAb（26D11）购自Abmart 公司、HRP-山羊抗小鼠IgG（H+L）购自北京鼎国公司；HRP标记羊抗人Fab IgG抗体购自Sigma公司；其他试剂为国内分析纯。

二、实验方法

1.人IgG Fab 段基因的PCR扩增：

用淋巴细胞分离液从正常健康人的外周血中分离淋巴细胞，用TRNzol-A⁺提取细胞总RNA，用Oligo（dT）₁₅为引物将提取的RNA通过逆转录试剂盒逆转录成 cDNA，（参照文献 Kang AS, Burton DR, Jones TM, et al. Combinatorial immunoglubulin libraries in phage λ. Methods: Comp Methods Enzymol,1991;2(2): 111-118. 和Marks JD,Hoogenboom HK, Bonnert TP, et al. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol, 1991;222(3):581-597.）分别以人特异性IgG Kappa链、Lambda链及重链 Gamma链5’端和3’端引物的不同组合（引物序列如下）对人轻链（VC+HC）和重链（VH+CH1）基因进行PCR扩增，PCR条件为94℃预变性3min，94℃ 1min，54℃~58℃ （54℃、55℃、56℃、57℃、58℃）50s，72℃ 1min，30个循环后，72℃ 延伸10min。

（1）人免疫球蛋白重链（Gamma链）Fd 段可变区5’端引物：

VH1a：5’-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3’，

VH1f：5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’，

VH2f：5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3’，

VH3a：5’-CAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3’，

VH3f：5’-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’，

VH4f：5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3’，

VH6a：5’-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3’，

VH6f：5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3’。

人免疫球蛋白重链（Gamma链）CH1区3’端引物：

CG1z：5’-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3’，

CG2a：5’-CTC GAC ACT AGT TTT GCG CTC AAC TGT CTT-3’，

CG3a：5’-TGT GTG ACT AGT GTC ACC AAG TGG GGT TTT-3’，

CG4a：5’-GCA TGA ACT AGT TGG GGG ACC ATA TTT GGA-3’，

（2）人免疫球蛋白Kappa 链可变区5’端引物：

Vκ1a：5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA -3’，

Vκ1s：5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CC-3’，

Vκ2a：5’-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA -3’，

Vκ3a：5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA -3’，

Vκ3b：5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3’。

人免疫球蛋白Kappa 链恒定区3’端引物：

Cκ1d：5’-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G-3’。

（3）人免疫球蛋白Lambda 链可变区5’端引物：

VL1：5’-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC -3’，

VL2：5’-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG -3’，

VL3：5’-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG -3’，

VL4：5’-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3’，

VL5：5’-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3’，

VL6：5’-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3’，

VL7：5’-CAG GTT GAG CTC ACT CAA CCG CCC-3’，

（4）人免疫球蛋白Lambda 链恒定区3’端引物：

Cλ2：5’-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’

CTC GAG 为内切酶XhoⅠ识别位点；ACT AGT为内切酶SpeⅠ识别位点；GAG CTC 为内切酶SacⅠ识别位点；TCT AGA 为内切酶XbaⅠ识别位点。

2.噬菌体抗体库的建立：

上述 PCR 产物分别经琼脂糖凝胶纯化回收（680bp）后，按Fd、κ链和λ链分别混合。将轻链 PCR 混合产物及噬菌粒 pComb3XSS分别用XbaⅠ和SacⅠ双酶切，经电泳后纯化回收。然后将二者用T4连接酶进行连接反应，连接产物10μl电转化入300μl感受态细胞 XL1-Blue，电转条件为：Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5kV，扩增摇菌后构建轻链基因库。

将提取的轻链库噬菌粒DNA和重链Fd段PCR混合产物用SpeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接后电转化感受态菌XL1-Blue。电转后加入3ml 预热SOC培养基，37℃振荡培养1h后加入10ml 预热的SB-A⁺T⁺（Amp 50μg/ml ，Tet 10μg/ml）培养基，37℃振荡培养1h 后加Amp至100μg/ml，37℃振荡培养1h，加入辅助噬菌体VCSM13约10¹²pfu/ml 混匀后并入100ml SB-A⁺T⁺（Amp 50μg/ml ，Tet 10μg/ml）培养基，37℃振荡培养2h后加入Kan 至70μg/ml后振荡培养过夜。次晨离心收集上清后加入PEG沉淀液，冰浴30min后离心弃上清，2ml 1% BSA-PBS重悬沉淀后再次离心收集上清即为噬菌体抗体库。

其中

SOC培养基：

胰化蛋白胨 20g

酵母提取物 5 g

NaCl 0.5 g

KCl（1mol/L） 2.5ml

溶于800ml双蒸水中，用5mol/L NaOH 调PH至7.0，补双蒸水至1000ml，高温高压灭菌后，4℃保存。使用前加入除菌葡萄糖至20mmol/L和除菌MgCl₂至10mmol/L。

SB培养基：

胰化蛋白胨 30g

酵母提取物 20 g

MOPS 10 g

溶于800ml双蒸水中，用5mol/L NaOH 调PH至7.0，补双蒸水至1000ml，高温高压灭菌后，4℃保存。

实验结果：取血正常健康人的新鲜外周血，分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA并逆转录合成 cDNA ，用13对轻链引物和21对重链Fd段引物进行PCR扩增，在680bp处出现特异性条带（参见图1，2；其中，图1中1-5泳道分别是用人免疫球蛋白重链Gamma链Fd 段可变区5’端引物和CH1区3’端引物作为引物进行PCR后的产物：VH1a+CG2a、VH1f+CG2a、VH2f+CG2a、VH3a+CG2a、VH4f+CG2a；图2中1-5泳道分别是用人免疫球蛋白Lambda 链可变区5’端引物和人免疫球蛋白Lambda 链恒定区3’端引物作为引物进行PCR后的产物：VL3+ Cλ2、VL4+ Cλ2、VL5+ Cλ2、VL6+ Cλ2、VL7+ Cλ2）。轻链PCR产物混合后经酶切电转入XL1-Blue 细菌，建立轻链基因库（4380bp）。用SacⅠ和 XbaⅠ双酶切将转入的轻链（680bp）基因切下来，电泳在3700bp和680bp处得到两条特异性条带（参见图3，其中1-10泳道为轻链库经SacⅠ和XbaⅠ双酶切后的产物，M1为Marker DL15000，从上到下依次为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、1500bp、1000bp、500bp；M2 为Marker DL2000，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）。将提取的轻链库噬菌粒DNA和重链Fd段 PCR 产物均用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切，连接后电转化感受态菌XL1-Blue，建立了噬菌体抗体基因库（4760bp），库容为8.4×10⁷。用SacⅠ和SpeⅠ双酶切将转入的含轻链（680bp）和重链Fd（680bp）的共同片段切下来，电泳在3260bp和1500bp处得到两条特异性条带（参见图4，其中1-10泳道为噬菌体抗体库经SacⅠ和SpeⅠ双酶切后的产物；M1为Marker DL15000，从上到下依次为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、1500bp、1000bp、500bp；M2 为Marker DL2000，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；3-7，9、10为阳性克隆，释放出1500bp的基因片段，为Fab片段）。

3. 噬菌体抗体库的特异性富集与筛选：（参照文献Griffiths AD, Duncan AR. Strategies for selection of antibodies by phage display [J] . Curr Opin Biotechnol, 1998; 9(1): 102-108, 和Barbas C Ⅲ, Kang AS, Lenner RA, et al. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces : the gene Ⅲ site. Proc Natl Acad Sci USA, 1991; 89: 10164-10168, 以及 Barbas C Ⅲ, Lenner RA, Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (phabs) : rapid selection of antigen specific Fabs. Methods: Comp Methods Enzymol, 1991; 2(2): 119-124. ）用碳酸氢盐缓冲液（pH8.6）稀释胰淀素至浓度为50μg/ml，每孔50μl包被酶联板，湿盒中4℃过夜；次日用3% BSA-PBS（牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS））封闭1h，加入新鲜制备的噬菌体抗体库（100μl/孔），湿盒中37℃孵育2小时；弃抗体库液，用含0.05% Tween-20的PBS（PBST）洗去非特异性结合或结合力弱的噬菌体抗体（第一轮筛选时洗1次；第二轮洗5次；第三轮洗10次），每孔以 50μl pH2.2 的0.1mol/L Gly-HCl 缓冲液洗脱下与胰淀素特异性结合的噬菌体抗体，并用8μl pH9.6的2M Tris 缓冲液中和，感染2ml新鲜培养至对数生长期（OD600为0.6~1.0）的大肠杆菌XL1-blue ，37℃孵育30 min。取10μl梯度稀释后铺板测定滴度，计算每轮筛选的产出率；余菌加入VCSM13感染后进行下一轮的富集筛选，如此“吸附-洗脱-扩增”反复3-8次，优选5次。

其中PBS组成及配制方法：

在800ml蒸馏水中溶解

NaCl 8g

KCl 0.2g

Na₂HPO₄1.44g

KH₂PO₄0.24g

用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L，高压下蒸汽灭菌30min。保存于室温。

实验结果：用固相化的人Amylin作为抗原对噬菌体抗体库进行了3轮筛选，计算每一轮产率（yield%）见表1，虽然洗涤强度逐轮增加，但洗脱下来的特异性噬菌体抗体滴度却明显增加，产率也增加，特异性噬菌体抗体得到了明显富集。经3轮筛选后富集的滴度为4×10⁹。

*：产率（%）=（产出的噬菌体量）/（投入的噬菌体量）×100%

4. 抗胰淀素抗体的Phage-ELISA检测：

从筛选后的细菌菌落中随机挑取28个克隆制备单克隆噬菌体抗体，将Amylin抗原稀释至10μg/ml包被酶联板，同时设空载体pComb3XSS 噬菌体上清、无关抗原BSA 作为阴性对照。3% BSA-PBS封闭后加入上述噬菌体上清，37℃ 孵育2h。PBST洗6次，每次5min。每孔加入50μl HA-Tag Mouse mAb（26D11）（1：600），37℃ 孵育1 h 后 PBST 洗6次；每孔再加入50μl HRP-山羊抗小鼠IgG（H+L）（1：2000），37℃ 孵育1 h，PBST洗板后加TMB 显色，酶标仪测A₄₅₀值（见表2）。

C10：空载体噬菌体上清阴性对照；C11：无关抗原BSA对照；C12：空白对照

ELISA 检测后选阳性克隆的菌株送上海Invitrogen 公司完成DNA测序。

实验结果：其中有4个克隆（A12，B11，C1，C2）呈阳性（以OD₄₅₀>阴性对照值2.1倍判定为阳性），阳性率为14.3%（表2）。用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，阳性克隆组与空载体对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；阳性克隆组与无关抗原BSA对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。上述结果表明阳性克隆的抗体具有amylin抗原的特异结合活性（参见图5，其中^bP<0.01 vs 空载体对照组；^dP<0.01 vs BSA对照组）。

取C1阳性克隆扩大培养后，提取噬粒DNA，对其进行测序分析。用NCB1中的NucleotidemBlast和Blast Analysis of Immunoglobulin Sequences分析软件对其序列进行分析发现：C1号阳性克隆的轻链可变区与人免疫球蛋白λ链有93%的同源性，重链可变区基因与人免疫球蛋白IgG重链VH3有88%的同源性。λ轻链V基因属于Vλ 2亚群，J基因属于Jλ3；重链V基因属于VH3-15亚群，D基因来自D3-16，J基因来自JH5。

5.氨基酸序列翻译

将阳性克隆C1轻链和重链Fd段核苷酸序列按正确的读码框翻译成氨基酸序列并对其决定簇互补区(CDR)进行了定位。用分析软件对阳性克隆轻链和重链Fd段的氨基酸序列进行了二级结构模拟，结果显示二者均符合抗体二级结构构型（图6、7）。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津医科大学总医院

<120> 人源性抗胰淀素抗体及其制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1重链可变区氨基酸序列

<222> (1)..(60)

<400> 1

Glu Glu Phe Lys Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

35 40 45

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala Trp Met

50 55 60

<130> 2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 104

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1轻链可变区氨基酸序列

<222> (1)..(104)

<400> 1

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ala

100

<130> 3

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 679

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1重链可变区DNA序列

<222> (1)..(679)

<400> 1

aactcataat ttataatgtc agtcatcagc cctcaggggt ttctagtcgc ttctctggct 60

ccaagtctgg caacacggcc tccctgacca tctctgggct ccaggctgag gacgaggctg 120

attattactg cagctcacat acaagcagca gaacttgggt gttcggcgga gggaccaagc 180

tgaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg ccctcctctg 240

aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc tacccgggag 300

ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg gagaccacca 360

caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctacctgagc ctgacgcctg 420

agcagtggaa gtcccacaaa agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg agcaccgtgg 480

agaagacagt ggcccctaca gaatgttcat aattctagat aattaattag gaggaattta 540

aaatgaaata cctattgcct acggcagccg ctggattgtt attactcgct gcccaaccag 600

ccatggccga ggtgcagctg ctcgagtctg ggggaggctt ggtaaagcct ggggggtccc 660

tcagactctc ctgtgcagc 679

<130> 4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 676

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> C1轻链可变区DNA序列

<222> (1)..(676)

<400> 1

ctccaggctg aggacgaggc tgattattac tgcagctcac atacaagcag cagaacttgg 60

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 120

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 180

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 240

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 300

agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca aaagctacag ctgccaggtc 360

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc ataattctag 420

ataattaatt aggaggaatt taaaatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg 480

ttattactcg ctgcccaacc agccatggcc gaggtgcagc tgctcgagtc tgggggaggg 540

ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc tcctgtgcag cctctggatt cgctttcaga 600

gccgcctgga tgaactgggt ccgccaggct ccagggaagg gctggagtgg ttggccgcat 660

taacagacaa attatg 676