检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
中检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(HPV)是一种DNA病毒，感染人类表皮及黏膜组织，目前约有170种类型的HPV被鉴别出来。流行病学研究已经证实，HPV病毒持续感染是引发宫颈癌的主要原因，根据HPV病毒和宫颈癌的关系，可以分为高危型、可能高危型和低危型，其中，16型(HPV16)和18型(HPV18)是世界范围内感染率最高的亚型。目前，HPV的检测有两种商业化方法，一种是由德国Qiagen公司生产的杂交捕获II代(HC2)检测试剂盒,作为检测其他方法的金标准，另一种是由瑞士Roche公司生产的LA检测方法，但由于这两种方法成本较高，难以大量推广使用。此外，常用的方法还有细胞学检查、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、SouthernBlot法等，细胞学检查灵敏度低，可能出现假阴性，PCR和实时荧光PCR需要热循环仪等复杂仪器，耗时较长，SouthernBlot法操作复杂，成本高。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何快速检测高危型人乳头瘤病毒HPV16和HPV18，并提高检测的特异性、灵敏性及降低检测成本。为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂。本发明所提供的检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂，由成套试剂1和成套试剂2组成；所述成套试剂1由名称为HPV16-FIP的单链DNA、名称为HPV16-BIP的单链DNA、名称为HPV16-F3的单链DNA和名称为HPV16-B3的单链DNA组成；所述HPV16-FIP为如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：a1)序列表中SEQIDNo.1所示的单链DNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述HPV16-BIP为如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：b1)序列表中SEQIDNo.2所示的单链DNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述HPV16-F3为如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：c1)序列表中SEQIDNo.3所示的单链DNA；c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述HPV16-B3为如下d1)至d4)中的任一种单链DNA：d1)序列表中SEQIDNo.4所示的单链DNA；d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；d3)与d1)或d2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述成套试剂2由名称为HPV18-FIP的单链DNA、名称为HPV18-BIP的单链DNA、名称为HPV18-F3的单链DNA和名称为HPV18-B3的单链DNA组成；所述HPV18-FIP为如下e1)至e4)中的任一种单链DNA：e1)序列表中SEQIDNo.5所示的单链DNA；e2)在e1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；e3)与e1)或e2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述HPV18-BIP为如下f1)至f4)中的任一种单链DNA：f1)序列表中SEQIDNo.6所示的单链DNA；f2)在f1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；f3)与f1)或f2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述HPV18-F3为如下g1)至g4)中的任一种单链DNA：g1)序列表中SEQIDNo.7所示的单链DNA；g2)在g1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；g3)与g1)或g2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；g4)在严格条件下与g1)或g2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述HPV18-B3为如下h1)至h4)中的任一种单链DNA：h1)序列表中SEQIDNo.8所示的单链DNA；h2)在h1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；h3)与h1)或h2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；h4)在严格条件下与h1)或h2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。上述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂中，a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在SEQIDNo.1所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在SEQIDNo.2所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在SEQIDNo.3所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。d2)所述在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在SEQIDNo.4所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。e2)所述在e1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在SEQIDNo.5所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。f2)所述在f1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在SEQIDNo.6所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。g2)所述在g1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在SEQIDNo.7所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。h2)所述在h1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA可为在SEQIDNo.8所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7或SEQIDNo.8所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。上述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂中，所述成套试剂1为检测人乳头瘤病毒及HPV16的成套试剂，所述检测人乳头瘤病毒及HPV18的成套试剂。上述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂中，所述成套试剂1和所述成套试剂2克独立包装，所述成套试剂1和所述成套试剂2中的各单链DNA也均可独立包装。上述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂中，所述成套试剂1中所述所述HPV16-FIP、所述HPV16-BIP、所述HPV16-F3和所述HPV16-B3的摩尔比可为4:4:1:1。所述成套试剂2中所述HPV18-FIP、所述HPV18-BIP、所述HPV18-F3和所述HPV18-B3的摩尔比可为4:4:1:1。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述P1)或P2)的成套试剂：P1)检测人乳头瘤病毒HPV16的成套试剂，为所述成套试剂1；P2)检测人乳头瘤病毒HPV18的成套试剂，为所述成套试剂2。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Q1)或Q2)或Q3)的系统：Q1)检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的系统(将其命名为系统甲)，包括所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂和链置换型DNA聚合酶；Q2)检测人乳头瘤病毒HPV16的系统(将其命名为系统1)，包括所述成套试剂1和所述链置换型DNA聚合酶；Q3)检测人乳头瘤病毒HPV18的系统(将其命名为系统2)，包括所述成套试剂2和所述链置换型DNA聚合酶。上述系统中，所述链置换型DNA聚合酶可为BstDNA聚合酶。所述系统甲可由所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂和所述链置换型DNA聚合酶组成。所述系统甲还可由所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂、所述链置换型DNA聚合酶以及进行环介导等温扩增所需要的其它试剂和/或仪器组成。进行环介导等温扩增所需要的其它试剂可为2×LAMPBuffer。所述2×LAMPBuffer由溶质和溶剂组成。所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为Tris20mM,KCl10mM,MgSO48mM,(NH4)2SO410mM,Tween200.1％,Betaine0.8M,dNTPs1.4mM(四种dNTP中每种dNTP的浓度均为1.4mM),MnCl20.5mM,Calcein25μM。所述系统1可由所述成套试剂1和所述链置换型DNA聚合酶组成。所述系统1还可由所述成套试剂1、所述链置换型DNA聚合酶以及进行环介导等温扩增所需要的其它试剂和/或仪器组成。进行环介导等温扩增所需要的其它试剂可为所述2×LAMPBuffer。所述系统2可由所述成套试剂2和所述链置换型DNA聚合酶组成。所述系统2还可由所述成套试剂2、所述链置换型DNA聚合酶以及进行环介导等温扩增所需要的其它试剂和/或仪器组成。进行环介导等温扩增所需要的其它试剂可为所述2×LAMPBuffer。上述系统可为环介导等温扩增试剂或试剂盒。为解决上述技术问题，本发明还提供了所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂的制备方法。本发明所提供的所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂的制备方法，包括将所述HPV16-FIP、所述HPV16-BIP、所述HPV16-F3、所述HPV16-B3、所述HPV18-FIP、所述HPV18-BIP、所述HPV18-F3和所述HPV18-B3分别单独包装。为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂1或所述成套试剂2的制备方法。本发明所提供的所述成套试剂1或所述成套试剂2的制备方法，为下述M1)或M2)：M1)包括将所述成套试剂1中所述HPV16-FIP、所述HPV16-BIP、所述HPV16-F3和所述HPV16-B3分别单独包装；M2)包括将所述成套试剂2中所述HPV18-FIP、所述HPV18-BIP、所述HPV18-F3和所述HPV18-B3分别单独包装。为解决上述技术问题，本发明还提供了所述系统的制备方法。本发明所提供的所述系统的制备方法，包括将所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂、所述成套试剂1或所述成套试剂2中的各单链DNA与各试剂分别单独包装。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1-X15中任一用途：X1、所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂在制备检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18产品中的应用；X2、所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂在制备检测人乳头瘤病毒产品中的应用；X3、所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂在制备筛查人乳头瘤病毒患者产品中的应用；X4、所述成套试剂1或所述成套试剂2在制备检测人乳头瘤病毒HPV16或HPV18产品中的应用；X5、所述成套试剂1或所述成套试剂2在制备检测人乳头瘤病毒产品中的应用；X6、所述成套试剂1或所述成套试剂2在制备筛查人乳头瘤病毒患者产品中的应用；X7、所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂在检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18中的应用；X8、所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂在检测人乳头瘤病毒中的应用；X9、所述检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂在筛查人乳头瘤病毒患者中的应用；X10、所述成套试剂1或所述成套试剂2在检测人乳头瘤病毒HPV16或HPV18中的应用；X11、所述成套试剂1或所述成套试剂2在检测人乳头瘤病毒中的应用；X12、所述成套试剂1或所述成套试剂2在筛查人乳头瘤病毒患者中的应用；X13、所述系统在检测人乳头瘤病毒HPV16和/或HPV18中的应用；X14、所述系统在检测人乳头瘤病毒中的应用；X15、所述系统在筛查人乳头瘤病毒患者中的应用。上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1)或H2)或H3)的方法：H1)检测或辅助检测人乳头瘤病毒HPV16的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，用所述成套试剂1进行LAMP，根据LAMP反应体系中的反应产物确定所述待测样品中是否含有人乳头瘤病毒HPV16或是否为人乳头瘤病毒HPV16；H2)检测或辅助检测人乳头瘤病毒HPV18的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，用所述成套试剂2进行LAMP，根据LAMP反应体系中的反应产物确定所述待测样品中是否含有人乳头瘤病毒HPV18或是否为人乳头瘤病毒HPV18；H3)检测或辅助检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的方法，包括所述H1)和所述H2)。上述H1)中，用所述成套试剂1进行LAMP的反应体系(将其命名为体系16)中所述HPV16-FIP和所述HPV16-BIP的浓度均可为40pmol/25μL,HPV16-F3和所述HPV16-B3的浓度均可为10pmol/25μL。所述体系16中BstDNA聚合酶的浓度可为8U/25μL。25μL的所述体系16中各试剂的量和浓度具体可为：所述2×LAMPBuffer12.5μL，BstDNA聚合酶8U，所述HPV16-FIP和所述HPV16-BIP各40pmol,所述HPV16-F3和所述HPV16-B3各10pmol，待测样品。上述H1)中，根据LAMP反应体系中的反应产物确定所述待测样品中是否含有人乳头瘤病毒HPV16或是否为人乳头瘤病毒HPV16可为根据所述LAMP反应体系颜色的变化确定所述待测样品中是否含有人乳头瘤病毒HPV16或是否为人乳头瘤病毒HPV16，具体可为H1a)和/或H1b)：H1a)在日光下，所述LAMP反应体系由橙色变为黄色，所述待测样品含有或候选含有人乳头瘤病毒HPV16或所述待测样品为或候选为人乳头瘤病毒HPV16；所述LAMP反应体系颜色无变化，所述待测样品不含有或候选不含有人乳头瘤病毒HPV16或所述待测样品不为或候选不为人乳头瘤病毒HPV16；H1b)在紫外灯下，所述LAMP反应体系由无色变为荧光黄色，所述待测样品含有或候选含有人乳头瘤病毒HPV16或所述待测样品为或候选为人乳头瘤病毒HPV16；所述LAMP反应体系颜色无变化，所述待测样品不含有或候选不含有人乳头瘤病毒HPV16或所述待测样品不为或候选不为人乳头瘤病毒HPV16。上述H2)中，用所述成套试剂2进行LAMP的反应体系(将其命名为体系18)中所述HPV18-FIP和所述HPV18-BIP的浓度均可为40pmol/25μL,HPV18-F3和所述HPV18-B3的浓度均可为10pmol/25μL。所述体系18中BstDNA聚合酶的浓度可为8U/25μL。25μL的所述体系18中各试剂的量和浓度具体可为：所述2×LAMPBuffer12.5μL，BstDNA聚合酶8U，所述HPV18-FIP和所述HPV18-BIP各40pmol,所述HPV18-F3和所述HPV18-B3各10pmol，待测样品。上述H2)中，根据LAMP反应体系中的反应产物确定所述待测样品中是否含有人乳头瘤病毒HPV18或是否为人乳头瘤病毒HPV18可为根据所述LAMP反应体系颜色的变化确定所述待测样品中是否含有人乳头瘤病毒HPV18或是否为人乳头瘤病毒HPV18，具体可为H2a)和/或H2b)：H2a)在日光下，所述LAMP反应体系由橙色变为黄色，所述待测样品含有或候选含有人乳头瘤病毒HPV18或所述待测样品为或候选为人乳头瘤病毒HPV18；所述LAMP反应体系颜色无变化，所述待测样品不含有或候选不含有人乳头瘤病毒HPV18或所述待测样品不为或候选不为人乳头瘤病毒HPV18；H2b)在紫外灯下，所述LAMP反应体系由无色变为荧光黄色，所述待测样品含有或候选含有人乳头瘤病毒HPV18或所述待测样品为或候选为人乳头瘤病毒HPV18；所述LAMP反应体系颜色无变化，所述待测样品不含有或候选不含有人乳头瘤病毒HPV18或所述待测样品不为或候选不为人乳头瘤病毒HPV18。上述H1)中和上述H2)中进行LAMP反应的温度均可为65℃。进行LAMP反应的时间均可为60min。具体可为65℃下恒温孵育60min，80℃保持5min。本发明中，BstDNA聚合酶具体可为NEB公司产品，货号为M0275V。上文中，所述在紫外灯下具体可为在365nm波长下。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:1.设备简单：该检测方法通过水浴锅或恒温加热设备就能进行实验，省去了昂贵的热循环设备和电泳等装置；2.操作简便：反应前一次性加入所有试剂，检测前不需要额外加入显色剂，减少了交叉污染的可能性，利用金属离子和指示剂的掩蔽和释放作用达到可视化检测的目的。3.特异性强：该方法针对每一段待测DNA设计4条特异性引物，相对于PCR的两条引物而言，特异性显著提高，假阳性出现的概率大大降低。4.检测效率高：该方法所用检测时间约为一小时，传统PCR扩增所用时间较长，一般需要两小时以上，缩短了反应时间，提高了检测的效率。本发明的检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂，仅需对细胞样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可快速检测出待测对象是否感染HPV16和HPV18病毒，其检测结果优于细胞学检查，特异性高，灵敏度高(分别可达5×104拷贝HPV16/μL和4×103拷贝HPV18/μL)，准确率高(可达100％)。方便医疗条件有限不具备大型仪器设备的地区使用，快速、简便的地进行HPV病毒检测，并且成本低廉，具有良好的实际应用前景。附图说明图1为用日光下检测HPV16病毒的LAMP扩增结果。图2为在紫外灯照射下HPV16病毒的LAMP扩增结果。图3为用日光下检测HPV18病毒的LAMP扩增结果。图4为在紫外灯照射下HPV18病毒的LAMP扩增结果。图5为成套试剂1和成套试剂2的特异性在日光灯下的检测结果。图6为成套试剂1和成套试剂2的特异性在紫外灯下的检测结果。图7为日光下检测HPV16LAMP扩增灵敏度结果。图8为紫外灯照射下检测HPV16LAMP扩增灵敏度结果。图9为日光下检测HPV18LAMP扩增灵敏度结果。图10为紫外灯照射下检测HPV18LAMP扩增灵敏度结果。图11为日光下临床样品LAMP扩增检测结果。图12为紫外灯照射下临床样品LAMP扩增检测结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的Caski细胞和Hela细胞均为中国医学科学院肿瘤医院产品，其中，Caski细胞含有HPV16病毒，Hela细胞含有HPV18病毒。实施例1、检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂的制备检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂，由成套试剂1和成套试剂2组成；成套试剂1由名称为HPV16-FIP的单链DNA、名称为HPV16-BIP的单链DNA、名称为HPV16-F3的单链DNA和名称为HPV16-B3的单链DNA组成；HPV16-FIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的单链DNA；HPV16-BIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的单链DNA；HPV16-F3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.3的单链DNA；HPV16-B3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.4的单链DNA；成套试剂2由名称为HPV18-FIP的单链DNA、名称为HPV18-BIP的单链DNA、名称为HPV18-F3的单链DNA和名称为HPV18-B3的单链DNA组成；HPV18-FIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.5的单链DNA；HPV18-BIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.6的单链DNA；HPV18-F3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.7的单链DNA；HPV18-B3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.8的单链DNA。检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂中的各单链DNA独立包装。实施例2、检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂可以用来检测HPV16和HPV18用TIANampMicroDNAKit分别提取Caski细胞和Hela细胞的基因组DNA，得到Caski细胞基因组DNA和Hela细胞基因组DNA。1、人乳头瘤病毒HPV16的检测25μL的检测人乳头瘤病毒HPV16的LAMP反应体系包含2×LAMPBuffer12.5μL，BstDNA聚合酶8U(NEB公司，M0275V)，HPV16-FIP和HPV16-BIP各40pmol,HPV16-F3和HPV16-B3各10pmol，Caski细胞基因组DNA1μL。其中，2×LAMPBuffer中各物质在该反应体系中的浓度分别为：Tris(碧云天生物技术有限公司)40mM,KCl20mM,MgSO4(北京化工厂)16mM,(NH4)2SO4(北京化工厂)20mM,Tween20(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)0.2％,Betaine(Sigma-Aldrich公司)1.6M,dNTPs(生工生物工程(上海)股份有限公司)2.8mM(四种dNTP中每种dNTP的浓度均为2.8mM),MnCl2(北京化工厂)1mM,Calcein(北京化工厂)50μM。设不含Caski细胞基因组DNA的体系作为阴性对照。将上述体系在65℃下恒温孵育60min，80℃保持5min，终止反应。分别用肉眼和在紫外灯照射下观察待测样品颜色变化，在日光下如果反应体系由橙色变为黄色，说明该待测样品含有HPV16，在紫外灯照射下(365nm下)如果反应体系由无色变为荧光黄色，说明该待测样品含有HPV16，若颜色无变化，则该待测样品不含HPV16。结果见图1和图2，图1为日光下LAMP扩增结果，图2为在紫外灯照射下LAMP扩增结果，图1和图2中左侧均为阴性对照，右侧均为Caski细胞的检测结果。结果显示，在日光下阴性对照反应体系颜色无变化，检测Caski细胞的反应体系由橙色变为黄色；在紫外灯下阴性对照反应体系颜色无变化，检测Caski细胞的反应体系由无色变为荧光黄色。说明，Caski细胞中含有HPV16，这与已知的Caski细胞含有HPV16一致，表明，该方法可以用来检测HPV16。2、人乳头瘤病毒HPV18的检测25μL的检测人乳头瘤病毒HPV18的LAMP反应体系包含步骤1的2×LAMPBuffer12.5μL，BstDNA聚合酶8U，HPV18-FIP和HPV18-BIP各40pmol,HPV18-F3和HPV18-B3各10pmol，Hela细胞基因组DNA1μL。设不含Hela细胞基因组DNA的体系作为阴性对照。将上述体系在65℃下恒温孵育60min，80℃保持5min，终止反应。分别用肉眼和在紫外灯照射下观察待测样品颜色变化，在日光下如果反应体系由橙色变为黄色，说明该待测样品含有HPV18，在紫外灯照射下(365nm下)如果反应体系由无色变为荧光黄色，说明该待测样品含有HPV18，若颜色无变化，则该待测样品不含HPV18。结果见图3和图4，图3为用日光下LAMP扩增结果，图4为在紫外灯照射下LAMP扩增结果，图3和图4中左侧均为阴性对照，右侧均为Hela细胞的检测结果。结果显示，在日光下阴性对照反应体系颜色无变化，检测Hela细胞的反应体系由橙色变为黄色；在紫外灯下阴性对照反应体系颜色无变化，检测Hela细胞的反应体系由无色变为荧光黄色。说明，Hela细胞中含有HPV18，这与已知的Hela细胞含有HPV18一致，表明，该方法可以用来检测HPV18。结果表明，本发明的检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂可以用于人乳头瘤病毒HPV16和HPV18环介导等温扩增实验，操作过程简便，结果便于观察。实施例3、检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂的特异性利用成套试剂2对实施例2中的Caski细胞基因组DNA进行检测，反应体系为将实施例2步骤2的25μL的检测人乳头瘤病毒HPV18的LAMP反应体系中的Hela细胞基因组DNA替换为Caski细胞基因组DNA，其他均不变得到的体系(体系1)。设不含Hela细胞基因组DNA的体系作为阴性对照。将上述两个体系在65℃下恒温孵育60min，80℃保持5min，终止反应。利用成套试剂2对实施例2中的Hela细胞基因组DNA进行检测，反应体系(体系2)与条件同实施例2。分别用肉眼和在紫外灯照射下观察待测样品颜色变化，结果发现，在日光下和紫外灯照射下阴性对照和体系1的颜色均无变化，体系2在日光下由橙色变为黄色，在紫外灯下由无色变为荧光黄色。表明，阴性对照和体系1均未发生LAMP反应，体系2中发生了LAMP反应。利用成套试剂1对实施例2中的Hela细胞基因组DNA进行检测，反应体系为将实施例2步骤1的25μL的检测人乳头瘤病毒HPV16的LAMP反应体系中的Caski细胞基因组DNA替换为Hela细胞基因组DNA，其他均不变得到的体系(体系3)。设不含Caski细胞基因组DNA的体系作为阴性对照。将上述两个体系在65℃下恒温孵育60min，80℃保持5min，终止反应。利用成套试剂1对实施例2中的Caski细胞基因组DNA进行检测，反应体系(体系4)与条件同实施例2。分别用肉眼和在紫外灯照射下观察待测样品颜色变化，结果发现，结果发现，在日光下和紫外灯照射下阴性对照和体系3的颜色均无变化，体系4在日光下由橙色变为黄色，在紫外灯下由无色变为荧光黄色。表明，阴性对照和体系3均未发生LAMP反应，体系4中发生了LAMP反应。结果见图5和图6，其中，1表示体系1,2表示体系2,3表示体系3,4表示体系4.表明成套试剂1与成套试剂2具有很好的特异性，不存在交叉反应的现象，可以很好的鉴定HPV16与HPV18。实施例4、检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂的灵敏性用TIANampMicroDNAKit分别从102、103、104、105、106个Caski细胞中提取DNA，分别得到102、103、104、105和106个Caski细胞基因组DNA，对这5个不同浓度的Caski细胞基因组DNA利用成套试剂1并按照实施例2步骤1的检测人乳头瘤病毒HPV16的LAMP反应体系进行检测，设不含Caski细胞基因组DNA的体系作为阴性对照。分别将上述体系在65℃下恒温孵育60min，80℃保持5min，终止反应。分别用肉眼和在紫外灯照射下观察待测样品颜色变化，结果如图7和图8所示，图7和图8中从左至右依次为阴性对照、102、103、104、105和106个Caski细胞基因组DNA的反应体系，以102、103、104、105和106个Caski细胞基因组DNA为模板的体系中HPV16的拷贝数分别为5×104、5×105、5×106、5×107和5×108拷贝/μL，结果表明成套试剂1的灵敏度为102个Caski细胞基因组DNA，即5×104拷贝HPV16/μL。用TIANampMicroDNAKit分别从102、103、104、105、106个Hela细胞中提取DNA，分别得到102、103、104、105和106个Hela细胞基因组DNA，对这5个不同浓度的Hela细胞基因组DNA利用成套试剂2并按照实施例2步骤2的检测人乳头瘤病毒HPV18的LAMP反应体系进行检测，设不含Hela细胞基因组DNA的体系作为阴性对照。分别将上述体系在65℃下恒温孵育60min，80℃保持5min，终止反应。分别用肉眼和在紫外灯照射下观察待测样品颜色变化，结果如图9和图10所示，图9和图10中从左至右依次为阴性对照、102、103、104、105和106个Hela细胞基因组DNA的反应体系，以102、103、104、105和106个Caski细胞基因组DNA为模板的体系中HPV18的拷贝数分别为4×103、4×104、4×105、4×106和4×107拷贝/μL，结果表明成套试剂2的灵敏度为102个Hela细胞基因组DNA，即4×103拷贝HPV18/μL。实施例5、实际样品LAMP实验(1)实际样品DNA的提取用TIANampMicroDNAKit提取18个临床血液样品的基因组DNA，得到待测样品基因组DNA。(2)环介导等温扩增每个待测样品基因组DNA分别利用实施例1中的成套试剂1和成套试剂2按照实施例2中的LAMP体系与条件进行LAMP扩增。分别设不含Caski和Hela细胞基因组DNA的体系作为阴性对照。(3)检测样品结果结果如图11和图12及表1所示。图11和图12中，A16-R16为利用成套试剂1对待测样品(表1中各样品的序号为A-R)进行检测的体系，A18-R18为利用成套试剂2对待测样品(表1中各样品的序号为A-R)进行检测的体系，序号为A-R的样品编号依次为0285,4669,4771,4776,4655,4724,4786,7825,0286,7819,7835,7838,0278,1578,4589,4617,7805,7831。检测结果汇总于下表，表1中，“16”表明待测样品含有HPV16，“18”表明待测样品含有HPV18，“-”表明待测样品不含HPV16和HPV18。该结果与临床上检测的结果一致，一致性(即准确率)达100％。表1、样品检测结果序号样品编号LAMP结果A028516B466916C477116D4776-E465518F472418G478618H782518I028616,18J781918K783518L783818M0278-N1578-O458918P461718Q780518R783118当前第1页1 2 3