一株醋酸杆菌及在加速绿豆淀粉分离沉降中的应用的制作方法

本发明涉及一株醋酸杆菌及在加速绿豆淀粉分离沉降中的应用。技术背景醋酸菌能改善食品的风味、品质和营养、延长保质期，具有调节人体肠道菌群平衡、抑制病原菌的生长、降低胆固醇、提高免疫力、延缓衰老等重要的生理保健作用，被广泛应用于食品行业，醋酸菌发酵食品也被认为是功能性食品。目前，绿豆淀粉的生产采用自然静置法或酸浆法，静置法不但费时而且淀粉去除不彻底；酸浆法淀粉分离效果较静置法好，但是由于酸浆是自然发酵的产物，受原料、气候变化等环境因素及操作方法的影响很大，产品质量很不稳定，有时由于温度或其他因素造成发酵过度，酸浆质量变劣；有时酸浆活力不足，使得淀粉不能与蛋白质等其他杂质及时有效分离。造成这些问题的主要原因是由于对酸浆中分离沉淀淀粉的主要作用菌认识还不是十分清楚，因此也一直没有人工制备的、可用于酸浆生产的发酵剂开发，还不能进行人工接种发酵。技术实现要素：：本发明的目的就是针对绿豆淀粉分离沉淀时间长、淀粉分离沉淀不彻底、产品的质量不稳定等问题，提供一株促进淀粉分离沉降能力强的醋酸杆菌，该醋酸杆菌能够在加速绿豆淀粉沉降分离的过程中起到关键作用。本发明的另一目的在于，该醋酸杆菌在加速淀粉分离沉降中的应用，提高淀粉的得率，使产品的稳定性提高。同时，本发明中的酸浆为纯菌发酵，无杂菌等致病菌污染，提高了淀粉产品的食用安全性。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明提供一株促淀粉分离沉降的醋酸杆菌，该醋酸杆菌为醋酸杆菌AcetobacterindonesiensisLLY11，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12794。所述的醋酸杆菌菌株的个体形态特征：大小为（0.8µm～1.2µm）×（1.5µm～2.5µm），细胞椭圆或短杆，革兰氏阴性，无芽孢。菌落形态特征：菌落大小在2mm～3mm，乳黄色，不透明，菌落边缘整齐，表面光滑、湿润有光泽，隆起呈半球状。生理生化特征为：耐氧，过氧化氢酶阳性，不能运动，硫化氢、硝酸盐还原、明胶实验阴性，代谢葡萄糖产酸不产气，能代谢果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、山梨醇、鼠李糖、松三糖、蜜二糖、纤维二糖产酸，不能利用棉籽糖、阿拉伯糖。该菌株的16SrDNA序列全长共1411bp，经Genbank比对与Acetobacterindonesiensis相似性达到99%；结合其个体、群体形态特征及生理生化实验结果，鉴定该菌为Acetobacterindonesiensis，并命名为AcetobacterindonesiensisLLY11。醋酸杆菌AcetobacterindonesiensisLLY11发酵酸浆的制备：用接种环挑取三环斜面保藏的醋酸杆菌AcetobacterindonesiensisLLY11于5mL绿豆汁培养基中，30℃下发酵12h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL绿豆汁培养基中30℃下发酵12h，获得AcetobacterindonesiensisLLY11的种子培养液。按5%-8%的接种量将种子培养液接入到绿豆汁培养基中，30℃下发酵12h，即可获得用于沉降绿豆淀粉乳的酸浆。醋酸杆菌AcetobacterindonesiensisLLY11发酵酸浆在沉淀淀粉中的应用：将上述AcetobacterindonesiensisLLY11纯菌发酵获得的酸浆按体积比10%的量加入到绿豆淀粉乳中，迅速搅拌1-2min，然后静置。该菌株能够特异性结合到淀粉颗粒表面，将众多淀粉颗粒联结成大的絮凝团，由于联结在一起的淀粉颗粒重力加大，加速了淀粉与蛋白质等杂质的分离沉降速度，可以将沉降速度由20min（100mL绿豆淀粉乳中沉淀10mL淀粉所需时间）缩短至2min。AcetobacterindonesiensisLLY11纯种发酵酸浆与自然发酵绿豆酸浆在绿豆淀粉生产中应用于具有以下优点：⑴提高了淀粉沉降速度，缩短了淀粉沉淀时间，提高淀粉得率；⑵AcetobacterindonesiensisLLY11发酵酸浆为纯菌发酵，无杂菌等致病菌污染，提高了淀粉产品的食用安全性。具体实施方式实施例1加速淀粉沉降微生物的分离、筛选与鉴定1培养基⑴绿豆汁培养基配方：酵母膏5g、K2HPO42g、葡萄糖20g、乳糖2g、醋酸钠5g、绿豆汁1000mL。⑵绿豆汁的制备方法：取100g绿豆加蒸馏水至1000mL，加热煮沸20min，用120目的筛子过滤，即得绿豆汁。⑶分离培养基：以可溶性淀粉替代绿豆汁培养基中葡萄糖作为碳源，具体成分及其配备如下：酵母膏5g、K2HPO42g、可溶性淀粉20g、乳糖2g、醋酸钠5g、绿豆汁1000mL。调pH至6.8，115℃灭菌30min。2检测方法2.1绿豆淀粉沉降速度的检测方法：取泡发8-12h的绿豆，按1:15的比例加水打浆，取100mL打好的绿豆淀粉乳若干份，分别加入自然发酵酸浆、纯菌发酵液和空白绿豆汁培养基，分别测定沉降10mL淀粉所需要的时间。每组做3个重复。2.2大肠菌群的检测方法：参照GB47893-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。3加速淀粉沉降微生物分离方法3.1样品的稀释用无菌吸管吸取自然发酵的绿豆酸浆5mL，移入盛有45mL无菌生理盐水带玻璃珠的三角瓶中，充分振摇均匀，即为10-1的样品稀释液。用无菌生理盐水对10-1的样品稀释液进行梯度稀释至10-7。3.2平板分离培养取上述10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的稀释液各1mL分别注入无菌培养皿中，每个稀释度做3个重复。注入分离培养基，待培养基凝固后，倒置于30℃温箱中培养24h～48h。3.3平板接种培养用接种环挑取单个小菌落，划线接种于分离培养基平板中，30℃培养24h，反复纯化3代，得到单菌落接种于绿豆汁斜面培养基上，30℃培养24h。3.4菌株筛选将分离到的斜面纯菌株活化后接入以可溶性淀粉替代葡萄糖的绿豆汁培养液中，30℃培养24h，以发酵液的加速淀粉分离沉降速度为指标，筛选出一株促淀粉分离沉降速度高的菌株LLY11。3.5菌种鉴定3.5.1菌株LLY11的形态特征观察将菌株LLY11在绿豆汁琼脂培养基中30℃下培养24h，然后进行革兰氏染色，其个体形态特征见表1。3.5菌种鉴定3.5.1菌株LLY11的形态特征观察将菌株LLY11在绿豆汁琼脂培养基中30℃下培养24h，然后进行革兰氏染色，其个体形态特征见表1。表1LLY11菌株的个体形态特征菌株菌体大小细胞形态细胞分裂后的排布方式革兰氏染色芽孢运动性LLY110.8µ～1.2µm）×（1.5µm～2.5µm）细胞椭圆或短杆链状革兰氏阴性无不运动菌株LLY11在绿豆汁琼脂培养基，30℃下培养48h，观察菌落大小、形态和颜色，结果见表2。表2菌落形态特征3.5.2LLY11的生理生化特征根据常规生理生化鉴定，结果见表3，参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步判断菌株LLY11为醋酸杆菌属。表3菌株生理生化特性测试项目结果测试项目结果过氧化氢酶+乳糖+运动性试验-半乳糖+H2S试验-麦芽糖+硝酸盐还原-甘露醇+明胶液化-山梨醇+15℃生长+棉子糖-45℃生长-甘露糖+葡萄糖酸盐+鼠李糖+葡萄糖产气-松三糖+葡萄糖产酸+蜜二糖+木糖-七叶糖+果糖+阿拉伯糖-蔗糖+纤维二糖+3.5.3醋酸杆菌LLY11的16SrDNA序列分析结果该菌株的16SrDNA序列全长共1411bp，经Genbank比对与Acetobacterindonesiensis相似性达到99%，综合其群体形态观察、个体形态观察、生理生化试验结果，确定该菌株为Acetobacterindonesiensis并命名为AcetobacterindonesiensisLLY11，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCCNo.12794。实施例2AcetobacterindonesiensisLLY11发酵酸浆在淀粉加工中的应用1实验材料试验用的菌株为本发明分离的AcetobacterindonesiensisLLY11，淀粉生产原料选择绿豆。2AcetobacterindonesiensisLLY11发酵酸浆的制备⑴绿豆汁培养基配方：酵母膏5g、K2HPO42g、葡萄糖20g、乳糖2g、醋酸钠5g、绿豆汁1000mL。⑵绿豆汁的制备方法：取100g绿豆加蒸馏水至1000mL，加热煮沸20min，用120目的筛子过滤，即得绿豆汁。⑶醋酸杆菌LLY11种子培养液制备方法：用接种环挑取三环斜面保藏的醋酸杆菌LLY11于5mL绿豆汁培养基中30℃下发酵12h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL绿豆汁培养基中30℃下发酵12h，获得醋酸杆菌LLY11的种子培养液。⑷将醋酸杆菌LLY11种子培养液按5%-8%的接种量接入到绿豆汁培养基中，30℃下发酵12h，即可获得用于沉降绿豆淀粉乳的发酵酸浆。3应用于加速淀粉与蛋白质等杂质分离沉降将AcetobacterindonesiensisLLY11发酵获得的酸浆按体积比10%的量加入到绿豆淀粉乳中，迅速搅拌1-2min，然后静置。分别取加入AcetobacterindonesiensisLLY11发酵液前后的绿豆淀粉乳，在显微镜下观察淀粉颗粒的分布，见图1、图2，由图可以看出，AcetobacterindonesiensisLLY11能够特异性结合到淀粉颗粒表面，将众多淀粉颗粒联结成大的絮凝团。由于联结在一起的淀粉颗粒重力加大，加速了淀粉与蛋白质等杂质的分离沉降速度，可以将沉降速度由20min（100mL绿豆淀粉乳中沉淀10mL淀粉所需时间）缩短至2min。附图说明图1为在100倍显微镜下观察加入发酵液之前的绿豆淀粉颗粒分布图；图2为加入10%AcetobacterindonesiensisLLY11发酵酸浆后，绿豆淀粉颗粒联结成大的絮凝团。沉降效果比较见表4；4大肠菌群的检测数量:分别对AcetobacterindonesiensisLLY11发酵酸浆和自然发酵绿豆酸浆中大肠菌群的数量进行检测，结果如下表5:本发明从自然发酵绿豆酸浆中筛选出一株可以加速淀粉沉降的AcetobacterindonesiensisLLY11，并将其应用于绿豆酸浆发酵中，其发酵液可加速绿豆淀粉分离沉降。该发明不仅缩短了淀粉分离沉降的时间，提高了淀粉得率，使产品的稳定性提高；而且发明中的酸浆为纯菌发酵，无杂菌等致病菌污染，提高了淀粉产品的食用安全性。SEQUENCELISTING<110>锦州医科大学<120>一株促淀粉分离沉降的醋酸菌<130>在加速绿豆淀粉分离沉降中的应用<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1411<212>DNA<213>Acetobacterindonesiensis<400>1gtggtcggctgcgccccttgcgggttcgctcaccggcttaaggtcaaaccaactcccatg60gtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcg120attactagcgattccaccttcatgcactcgagttgcagagtgcaatccgaactgagacgg180cttttagagatcagcacgatgtcgccatctagcttcccactgtcaccgccattgtagcac240gtgtgtagcccaggacataagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggc300ttgtcaccggcagtctctctagagtgcccacccaaacatgctggcaactaaagatagggg360ttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgca420gcacctgtgcgg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