本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种用于发酵生产丙酮酸的培养基及其应用。
背景技术：
丙酮酸(Pyruvic acid)，浅黄色至黄色透明液体，是生物体基本代谢中间产物之一，广泛应用于食品添加剂、农药、医药等领域。可作为前体，酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、D/L-丙氨酸和L-二羟基苯丙氨酸等，同时在减肥、增强耐力、降低胆固醇等人类健康领域有应用潜力。发酵法生产丙酮酸的研究开始于二十世纪90年代，日本、美国等国家在菌株选育、工程菌株构建、分离纯化等方面开展了一系列的工作，我国的相关研究主要由江南大学和中国科学院微生物研究所、中国科学院过程工程研究所等单位开展，也取得了不错的进展。
目前国内外的研究集中在菌种筛选和构建，研究最多的是光滑球拟酵母(Torulopsis glabuata)和大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌。无论是光滑球拟酵母还是大肠杆菌，在丙酮酸积累过程中均存在氧化还原力不平衡的问题。人们尝试表达外源的NADH氧化酶来解决NADH过度积累的问题。从发酵结果来看，在一定程度上缓解了还原力积累的问题，提高了菌株的生长速率和生物量，同时提高了丙酮酸的浓度。
“华中农业大学学报，2010，29(4)，527-532.”周景文等考察了采用氧化态更高的葡萄糖酸钠部分代替葡萄糖对多重营养缺陷型光滑球拟酵母发酵的影响。与100g/L葡萄糖作为唯一碳源的对照组相比，在含有90g/L的葡萄糖培养基中添加10g/L的葡萄糖酸钠，其细胞量、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生产强度分别提高了7.96％、13.04％和32.81％，胞内的NAD+浓度提高了29.73％，NADH/NAD+比值下降了26.89％。但是此研究同时指出，葡萄糖酸钠不能完全代替葡萄糖，否则细胞质量浓度和丙酮酸产量都会明显下降，且对于多重营养缺陷型光滑球拟酵母与大肠杆菌的代谢过程不尽相同，所以培养基也并不能直接适用于大肠杆菌。
中国科学院过程工程研究所通过调控脂肪酸代谢途径，增强糖酵解途径，降低TCA循环强度等手段，构建得到高产丙酮酸的大肠杆菌YP01和YP02。虽然在发酵过程中，可以得到较高的丙酮酸产量，但是仍存在发酵后期葡萄糖利用速率严重下降的问题。已有研究证明改变碳源可以改善多重营养缺陷型光滑球拟酵母的发酵过程，对于大肠杆菌而言，更适合丙酮酸发酵的碳源将是一种重要的研究方向。
技术实现要素：
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种用于发酵生产丙酮酸的培养基及其应用，所述培养基能够降低杂酸产量，提高丙酮酸的产率及产量。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种用于发酵生产丙酮酸的培养基，所述培养基包括碳源、氮源、磷源和无机盐，所述碳源包括葡萄糖酸钠，所述葡萄糖酸钠占碳源的质量比为80-100％。
本发明中，采用氧化态的葡萄糖酸钠代替葡萄糖，降低胞内NADH/NAD+比例，平衡胞内还原力，降低杂酸产量，提高丙酮酸的产率及产量。
优选地，所述碳源为葡萄糖酸钠。
优选地，所述氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、氨水、铵盐或尿素中的任意一种或至少两种的混合。
优选地，所述培养基的pH为6-8，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，优选为6.5-7.5。
第二方面，本发明提供一种以如第一方面所述的培养基发酵生产丙酮酸的方法，包括如下步骤：以如第一方面所述的培养基培养大肠杆菌。
优选地，所述大肠杆菌为E.coli YP01和/或E.coli YP02。
所述E.coli YP01的菌种保藏号为CGMCC No.10691，保藏时间2016.4.07，分类名：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述E.coli YP02的菌种保藏号为CGMCC No.12463，保藏时间2016.5.18，分类名：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述大肠杆菌的接种量为0.1-10％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。
优选地，所述培养基培养大肠杆菌的培养温度为35-39℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃或39℃，优选为37℃。
优选地，所述培养基培养大肠杆菌的培养时间为15-60h，例如可以是15h、16h、18h、20h、25h、28h、30h、35h、40h、45h、50h、55h或60h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明针对产丙酮酸的大肠杆菌工程菌的代谢特点，采用氧化态的葡萄糖酸钠代替葡萄糖，降低胞内NADH/NAD+比例，平衡胞内还原力，降低杂酸产量，提高丙酮酸的产率及产量；
(2)本发明中，大肠杆菌基因工程菌菌株YP01，在好氧条件下，利用无机盐培养基发酵24小时，可将45g/L葡萄糖酸钠转化生成34g/L丙酮酸，转化率达到0.76g/g葡萄糖酸钠，相比与葡萄糖作为碳源，丙酮酸浓度有了明显提高，α-酮戊二酸、富马酸、柠檬酸等杂酸显著降低。
附图说明
图1是本发明以葡萄糖和葡萄糖酸钠为碳源的发酵过程对比图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实验仪器：
安捷伦(1200型)高效液相色谱；
伯乐公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱分析；
所述E.coli YP01的菌种保藏号为CGMCC No.10691，保藏时间2016.4.07，分类名：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述E.coli YP02的菌种保藏号为CGMCC No.12463，保藏时间2016.5.18，分类名：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1大肠杆菌基因工程菌YP01以葡萄糖酸钠为碳源发酵生产丙酮酸
种子培养基和发酵培养基含以下成分(除葡萄糖酸钠外)：
大量元素(mmol/L)：(NH4)2HPO4 19.92，NH4H2PO4 7.56，KCl 2.00，MgSO4·7H2O 1.50；
微量元素(μmol/L)：FeCl3·6H2O 8.88，CoCl2·6H2O 1.26，CuCl2·2H2O 0.88，ZnCl2 2.20，Na2MoO4·2H2O 1.24，H3BO3 1.21，MnCl2·4H2O 2.50；
以大肠杆菌基因工程菌株YP01生产丙酮酸，包括以下步骤：
(1)种子培养：在250mL三角瓶中加入种子培养基100mL，加入葡萄糖酸钠0.5wt％，115℃灭菌30min，冷却后将菌株YP01按照1％(v/v)的接种量接种于种子培养基，在pH＝7.0、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到种子液。
(2)发酵培养：5L发酵罐发酵培养基体积为2L，121℃灭菌20min，添加已高温灭菌的葡萄糖酸钠母液，使发酵罐中葡萄糖酸钠浓度为4.5wt％。将步骤1中种子按照5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，在pH＝7.0、37℃和400rpm的条件下培养24小时得到发酵液。
分析方法：使用高效液相色谱对发酵液中的成分进行定量分析，发酵液中的葡萄糖酸钠和有机酸浓度测定采用Aminex HPX-87H有机酸分析柱分析。结果如图1所示，对照组为以葡萄糖为碳源在同等条件下的发酵结果。
由图1可以看出：大肠杆菌基因工程菌菌株YP01，在好氧条件下，利用无机盐培养基发酵24小时，可将45g/L葡萄糖酸钠转化生成34g/L丙酮酸，转化率达到0.76g/g葡萄糖酸钠，相比与葡萄糖作为碳源，丙酮酸浓度有了明显提高，同时，α-酮戊二酸、富马酸、柠檬酸等杂酸显著降低。
实施例2大肠杆菌基因工程菌YP01以葡萄糖酸钠为主要碳源发酵生产丙酮酸
种子培养基和发酵培养基含以下成分(除葡萄糖和葡萄糖酸钠外)：
大量元素(mmol/L)：(NH4)2HPO4 19.92，NH4H2PO4 7.56，KCl 2.00，MgSO4·7H2O 1.50；
微量元素(μmol/l):FeCl3·6H2O 8.88，CoCl2·6H2O 1.26，CuCl2·2H2O 0.88，
ZnCl2 2.20，Na2MoO4·2H2O 1.24，H3BO3 1.21，MnCl2·4H2O 2.50；
以大肠杆菌基因工程菌株YP01生产丙酮酸，包括以下步骤：
(1)种子培养：在250mL三角瓶中加入种子培养基100mL，加入葡萄糖酸钠0.5wt％，115℃灭菌30min。冷却后将菌株YP01按照1％(v/v)的接种量接种于种子培养基，在pH＝7.0、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到种子液。
(2)发酵培养：5L发酵罐发酵培养基体积为2L，121℃灭菌20min，添加已高温灭菌的葡萄糖和葡萄糖酸钠的混合母液，其中葡萄糖和葡萄糖酸钠的质量比为1:4，使发酵罐中葡萄糖和葡萄糖酸钠的总浓度为4.5wt％。将步骤1中种子按照5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，在pH＝7.0、37℃和400rpm的条件下培养24小时得到发酵液。
分析方法同实施例1。大肠杆菌基因工程菌菌株YP01在以葡萄糖和葡萄糖酸钠为碳源时，利用无机盐培养基发酵24小时，可生成32g/L丙酮酸。
实施例3大肠杆菌基因工程菌YP02以葡萄糖酸钠为碳源发酵生产丙酮酸
种子培养基和发酵培养基含以下成分(除葡萄糖酸钠外)：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L。
以大肠杆菌基因工程菌株YP02生产丙酮酸，包括以下步骤：
(1)种子培养：在250mL三角瓶中加入种子培养基100mL，加入葡萄糖酸钠0.5wt％，115℃灭菌30min。冷却后将菌株YP02按照1％(v/v)的接种量接种于种子培养基，在pH＝7.0、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到种子液。
(2)发酵培养：5L发酵罐发酵培养基体积为2L，121℃灭菌20min，添加已高温灭菌的葡萄糖酸钠母液，使发酵罐中葡萄糖酸钠浓度为4.5wt％。将步骤1中种子按照5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，在pH＝7.0、37℃和400rpm的条件下培养24小时得到发酵液。
分析方法同实施例1。大肠杆菌基因工程菌菌株YP01在以葡萄糖和葡萄糖酸钠为碳源时，利用丰富培养基发酵24小时，生成38g/L丙酮酸。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。