一株产二甲苯单加氧酶的菌株Arthrobacterwoluwensis及其应用的制作方法

文档序号：12248358阅读：329来源：国知局

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株产二甲苯单加氧酶菌株 (Arthrobacter woluwensis) HW-1，及其在微生物发酵法制备 5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用。。

背景技术：

5-甲基吡嗪-2-羧酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid）是一种米白色固体结晶，Cas号为5521-55-1，分子式为C₆H₆N₂O₂，分子量138.12，熔点166～169℃，具有刺激性气味，暴露在空气中会缓慢氧化，由棕色油状物变为棕黑色粘稠状固体，需真空密封保存。

5-甲基吡嗪-2-羧酸结构式

5-甲基吡嗪-2-羧酸在医药工业领域有着广泛的用途，主要用于合成降血糖药物格列吡嗪、新型抗高血压药物阿西莫司以及抗结核药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等，因此对制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的研究具有重要的实际应用价值。

甲基吡嗪-2-羧酸的化学合成主要有以下工艺（陈炳和等, 化学试剂, 2008, 30(11)：869-870; 董阳阳等, 化学试剂, 2013, 35(6):505～509)：

.以丙酮醛和二氨基马来腈为原料催化环合生成2,3-二氰基-5-甲基吡嗪，然后再以环合生成的2,3-二氰基-5-甲基吡嗪酸化水解制得吡嗪二羧酸，最后经过脱羧得到目标产物5-甲基吡嗪-2-羧酸。由于二氨基马来腈合成条件苛刻，进口价格昂贵，且有剧毒，该方法生产成本较高。

氯化酰化水解氧化4步法：用2,5-二甲基吡嗪为原料在过氧苯甲酰引发下与N-氯代丁二酰亚胺氯化得2-甲基-5-氯甲基吡嗪，再经乙酰化、水解、高锰酸钾氧化、酸化得5-甲基吡嗪-2-羧酸，总收率约47%。此路线步骤长而复杂，总收率较低，高锰酸钾氧化成本高，需要氮气保护；且含锰废水不好处理，环境污染严重。

环合、氧化、酸化和脱羧法。采用顺-2,3-二氨基-2-丁烯-1,4-二腈为原料，经与丙酮醛环合、硫酸水解得2-甲基吡嗪-5,6-二羧酸，再经脱羧得5-甲基吡嗪-2-羧酸。此路线步骤长而复杂，顺-2,3-二氨基-2-丁烯-1,4-二腈须进口、价格高，在2-甲基吡嗪-5,6-二羧酸脱羧时得到5-甲基吡嗪-2-羧酸和6-甲基吡嗪-2-羧酸两种异构体的混合物，分离纯化困难。

化学合成法还包括分子间环合法、N-溴代丁二酰亚一步氧化法、环烷酸钴一步氧化法以及电化学氧化法等。

目前5-甲基吡嗪-2-羧酸的生产工业上是以化学法为主。但是化学合成一般需要高温高压、惰性气体保护、大量使用氧化剂，合成过程中产生大量废弃物，污染环境。并且化学合成法的总收率低，成本高。

生物法制备5-甲基吡嗪-2-羧酸，底物选择性好，催化效率较高，杂质少，并且污染小，代表着绿色化学的发展方向。瑞士Lonza公司已经实现了利用含二甲苯单加氧酶的菌株在批次补料反应器中制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。国内浙江工业大学（郑裕国等,化学与生物工程,2012,29(9):19~25）筛选获得一株含二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌，并利用该菌株进行5-甲基吡嗪-2-羧酸的生物制备，经过补料发酵产率可达到75.6%，产物浓度达到20.41 g/L，周期达到了22天。

技术实现要素：

发明目的

本发明的目的是克服化学合成5-甲基吡嗪-2-羧酸工艺的不足，并提供一株具有高区域选择性的催化单加氧反应的产二甲苯单加氧酶的菌株HW-1，及利用该菌株发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。

本发明的技术方案是：

一株产二甲苯单加氧酶的Arthrobacter woluwensis HW-1菌株，其菌种保藏编号为CGMCC 12833。该菌株的保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC 12833，保藏日期2016年8月15日。

本发明提供的菌株是按如下方法筛选获得：

分别从威海、烟台、青岛等地化工厂排污口附近采集获得土样，各取约l g土样进行富集培养，置于160 r·min-1、28℃的摇床上富集3次，每次48 h。然后将稀释菌液涂布于平板培养基上，待长出单菌落后，挑取不同形态单菌落接种到种子培养基进行培养，得到种子液涂布平板后于4℃冰箱保存。初筛得到的菌株接种至摇瓶进行发酵培养12 h后加入0.10 g 2,5-二甲基吡嗪。培养48h后，取样离心，过膜处理后用高效液相色谱法检测。选择有催化活性的菌株，从中选取转化活性最高的菌株HW-1进行鉴定及摇瓶转化条件优化实验。

本发明提供的菌株具有以下分类学特征：

菌落形态：于28℃在培养基平板培养48 h，菌落呈圆形，无褶皱，边缘光滑，有光泽，乳白色，不透明。显微镜下，菌体形态较小，呈短杆状。氧化型，过氧化酶阳性。

以提取到的细胞总DNA为模板，利用设计的引物扩增菌株HW-1的16S rDNA 序列，将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，从图1可以看出经PCR扩增成功获得了一长约为1.4 kb的片段，符合预期结果。经测序获得1365 bp的基因片段。

将测序获得的基因序列与 GenBank 中保存的数据进行比对分析发现，本发明微生物菌株HW-1与Arthrobacter woluwensis (AB244293.1) 同源性最高 (homology，99％/1365bps, based on 16S rDNA)，根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于16S rDNA序列的同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。因此，结合生理生化试验，鉴定该微生物菌株属于Arthrobacter woluwensis。

本发明中的菌株用于制备5-甲基吡嗪-2-羧酸，其特征在于：

以2,5-二甲基吡嗪为原料，以发酵培养获得含有二甲苯单加氧酶活性的HW-1菌株作为催化剂，于pH 5.0~8.0，20~40℃下进行发酵转化，通过批次补料的方式进行反应提高产物积累量，最终获得所述较高浓度的产物5-甲基吡嗪-2-羧酸。

具体步骤如下：

第一步菌体种子液的制备

将Arthrobacter woluwensis接种到种子培养基中，在摇床转速100~180 r·min-1、20~40℃下培养12~24 h，获得种子液。其中此处所用种子培养基成分为蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水。

第二步菌株发酵及生物转化

1.将Arthrobacter woluwensis种子液以1~5%的接种量接到发酵培养基中，在二甲苯的诱导下，摇床转速100~180 r·min-1 、pH 6.0~8.0，20~40℃培养10~28 h。

所述的发酵培养基以二甲苯为诱导剂，并且添加其他营养成分和微量元素。本发明中产酶发酵培养基组成为：酵母粉0.5~2.0 g/L；蛋白胨1.0~4.0 g/L；硫酸铵 1.0~3.0 g/L；碳酸氢钠 1.0~5.0 g/L；磷酸二氢钾 0.5~4.0 g/L；氯化钠1.0~5.0 g/L；氯化镁 0.1~0.5 g/L；氯化钙 1.0~5.0 g/L；氯化铁 0.05~0.3 g/L；硫酸锌0.02~0.1 g/L；氯化锰 0.05~0.1 g/L；氯化铜 0.05~0.02 g/L；氯化镍0.01~0.03 g/L；EDTA·Na2·2H2O 1.0~5.0 g/L；硫酸亚铁1.0~3.0 g/L，二甲苯 0.1~2 mL/L，溶剂为水。

发酵培养及生物转化过程可以在摇瓶中进行，也可以在发酵罐中进行。

向发酵液中加入底物2,5-二甲基吡嗪，初始浓度为0.5~2 mL/L，继续发酵培养。

由于2,5-二甲基吡嗪生物转化制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的反应是一个产酸反应，为提高反应速率，在转化过程中需进行pH调节，使pH维持在6.0~7.0之间。

进行发酵转化过程中，转化率超过50%时适时进行补加底物2,5-二甲基吡嗪。

本发明的有益效果：经过筛选提供了一株产二甲苯单加氧酶的新菌株HW-1，经鉴定为Arthrobacter woluwensis，并首次利用该菌株通过生物发酵转化2,5-二甲基吡嗪制备获得药物中间体5-甲基吡嗪-2-羧酸，经摇瓶发酵并适时进行补料，产物积累浓度可达到34.19 g/L，产率81.4%。与文献报道的20.41 g/L相比，有较大优势，具有产业化前景。使用本发明进行5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备，反应条件温和、可控，环保节能，具有良好的工业应用价值。

（四）附图说明

图1为菌株 16S rDNA 序列 PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳图；

图2为转化液液相检测图谱；

图3为发酵过程中产物积累浓度；

图4为发酵液初始pH对转化的影响；

图5为底物添加量对转化的影响（◆代表转化率，▲代表产物积累浓度）；

图6为底物添加时间对转化的影响；

图7发酵转化温度对转化的影响。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施实例1：微生物筛选

种子培养基为：酵母膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，溶剂为水，pH 7.0。

富集筛选培养基成分：酵母粉1.5 g/L；蛋白胨2.0 g/L；硫酸铵 2.0 g/L；碳酸氢钠 1.5 g/L；磷酸二氢钾 2.0 g/L；氯化钠2.0 g/L；氯化镁 0.3 g/L；氯化钙 1.2 g/L；氯化铁 0.1 g/L；硫酸锌0.05 g/L；氯化锰 0.06 g/L；氯化铜 0.06 g/L；氯化镍0.02 g/L；EDTA·Na2·2H2O 2.0 g/L；硫酸亚铁2.0 g/L，二甲苯以0.1 mL/L的量加入，溶剂为水。

土样采集：从化工厂的排污口附近采集5~15 cm深处的土样，并详细记录每一份土样的采集时间及地点。由于土样来源的地理分布的差异会给筛选工作带来更多成功的机会。因而从威海、烟台及青岛等地采集得到共100余份土样用以菌种筛选。

取1 g土样放入三角瓶中，加入20 mL生理盐水，加入玻璃珠，放在摇床上振荡40 min。取0.5 mL土壤悬液加入到富集培养基中，于28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养36 h。富集培养重复进行3次后，取0.1 mL培养液涂布于固体平板进行分离培养。固体平板培养基组成为：酵母膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂 20 g/L，溶剂为水，pH 7.0。28℃培养至单菌落长成，挑取不同的菌落进行划线分离至获得单菌落。挑取单菌落接入到种子培养基中，28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养16 h，获得单菌株的种子液。将种子液以2%的接种量接入到富集筛选培养基中，于28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养16 h后，向发酵液中加入原料2,5-二甲基吡嗪0.20 g，培养48 h后发酵液经离心，过膜处理后用高效液相色谱检测 ( 柱子：C18柱，乙腈∶水：三氟乙酸＝12∶88∶0.5，流速 1 mL·min-1，检测波长270 nm，柱温25℃)，检测液相图谱如图2。经检测选择有活性菌株，最终获得一株有较高活力的菌株Arthrobacter woluwensis（编号：CGMCC 12833）。

实施实例2、发酵过程

以平板菌落为菌种，接入到种子液中，在28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养，获得纯种菌株的种子液。经测定培养过程中3-16 h为对数期，之后接种选取对数期种子液进行转接。

以发酵培养基体积的2%取种子液接入到发酵培养基中，在28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪0.20 g。发酵转化过程中发酵液pH不断降低，发酵至46 h后pH降到5.1，并伴随发酵转化速率的降低。发酵过程中产物浓度不断积累，具体变化趋势如图3。

实施实例3、发酵液初始pH对发酵转化的影响

改变发酵培养基初始pH值分别为：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以2%接种量取种子液接入到发酵培养基中，在28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪0.20 g，发酵转化36 h检测发酵液中产物浓度。具体结果如图4。pH过高和过低，对菌体的正常生长代谢不利，进而影响发酵转化效率；pH在7.0左右，转化活力最好，效率最高。

实施实例4、底物加入量对发酵转化影响

将种子液接入到100 mL发酵培养基中，在28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪，加入量分别为0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g，发酵转化36 h后经离心处理，取上清液稀释后以HPLC检测发酵液中产物浓度，测定数据如图5。随着底物2,5-二甲基吡嗪加入量的增加，转化率持续降低，而发酵液中产物浓度不断提高；2,5-二甲基吡嗪超过0.20 g后，底物抑制作用明显，转化率降低，伴随着产物浓度降低。

实施实例5、底物加入时间对发酵转化影响

将种子液接入到100 mL发酵培养基中，在28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪0.20 g，分别在0、4、8、12、16、20 h加入底物2,5-二甲基吡嗪，发酵转化36 h后经离心处理，取上清液稀释后以HPLC检测发酵液中产物浓度，测定数据如图6。在12~16 h加入底物为最合适的时间。

实施实例6、发酵转化温度对转化的影响

将种子液接入到100 mL发酵培养基中，在摇床转速150 r·min-1条件下，设置发酵温度分别为15、20、25、30、35、40、45℃，在此条件下培养12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪0.20 g，发酵转化36 h后经离心处理，取上清液稀释后以HPLC检测发酵液中产物浓度，测定数据如图7。在25~35℃发酵转化，较为合适。

实施实例7、补加底物转化

将种子液接入到100 mL发酵培养基中，在28℃、摇床转速150 r·min-1条件下培养12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪0.20 g，在转化一段时间后，根据产物浓度和底物浓度，向发酵液中补加0.20 g底物2,5-二甲基吡嗪。转化过程耗时372 h，15.5天，共计加料21次，产物5-甲基吡嗪-2-羧酸浓度积累达到34.19 g/L，产率为81.4%。

基因序列表

CAGTCGAACG ATGAAGCCTA GCTTGCTGGG TGGATTAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG 060

TGAGTAACCT GCCCTTGACT CTGGGATAAG CCTGGGAAAC TGGGTCTAAT ACCGGATACG 120

ACCATTGCCC GCATGGGTTG GTGGTGGAAA GCTTTTGTGG TTTTGGATGG ACTCGCGGCC 180

TATCAGCTTG TTGGTGAGGT AATGGCTCAC CAAGGCGACG ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG 240

GGTGACCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG 300

GAATATTGCA CAATGGGCGA AAGCCTGATG CAGCGACGCC GCGTGAGGGA TGACGGCCTT 360

CGGGTTGTAA ACCTCTTTCA GTAGGGAAGA AGCGAAAGTG ACGGTACCTG CAGAAGAAGC 420

GCCGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG GCGCAAGCGT TATCCGGAAT 480

TATTGGGCGT AAAGAGCTCG TAGGCGGTTT GTCGCGTCTG CTGTGAAAGG CCAGGGCTCA 540

ACCCTGGTTC TGCAGTGGGT ACGGGCAGAC TTGAGTGATG TAGGGGAGAC TGGAATTCCT 600

GGTGTAGCGG TGAAATGCGC AGATATCAGG AGGAACACCG ATGGCGAAGG CAGGTCTCTG 660

GGCATTAACT GACGCTGAGG AGCGAAAGCA TGGGGAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT 720

AGTCCATGCC GTAAACGTTG GGCACTAGGT GTGGGGGACA TTCCACGTTT TCCGCGCCGT 780

AGCTAACGCA TTAAGTGCCC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGCTAAAA CTCAAAGGAA 840

TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGCGGAGCA TGCGGATTAA TTCGATGCAA CGCGAAGAAC 900

CTTACCAAGG CTTGACATGG ACTGGATCGC ATCAGAGATG GTGTTTCCCT TCGGGGCTGG 960

TTCACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC 1020

AACGAGCGCA ACCCTCGTTC CATGTTGCCA GCGCGTAATG GCGGGGACTC ATGGGAGACT 1080

GCCGGGGTCA ACTCGGAGGA AGGTGGGGAC GACGTCAAAT CATCATGCCC CTTATGTCTT 1140

GGGCTTCACG CATGCTACAA TGGCCGGTAC AAAGGGTTGC GATACTGTGA GGTGGAGCTA 1200

ATCCCAAAAA GCCGGTCTCA GTTCGGATTG GGGTCTGCAA CTCGACCCCA TGAAGTTGGA 1260

GTCGCTAGTA ATCGCAGATC AGCAACGCTG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA 1320

CCGCCCGTCA AGTCACGAAA GTTGGTAACA CCCGAAGCCG GTGGC 1365