一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法与应用与流程

本发明涉及一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

乳糖酶(lactase)，即β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，该酶可催化两种类型的反应：一是水解作用，即将一分子的乳糖水解为一分子的葡萄糖和半乳糖；二是半乳糖苷的转移作用，即能把半乳糖残基转移到乳糖、葡萄糖等糖基上。

乳糖酶在以乳制品加工为主的工业中运用广泛，主要体现在以下方面：

I、水解乳制品中的乳糖，生产低乳糖的乳制品用以供给乳糖不耐受人群食用。

对大部分正常人来说，乳糖是不能直接被机体利用的，只有经乳糖酶水解，变成为半乳糖与葡萄糖后才能被人体利用；如果人体由于种种原因缺乏乳糖酶时则会造成乳糖未被吸收，就会引起腹鸣、腹胀、腹痛等症状，这种情况称为乳糖不耐受(Lactasenon—persistent，LNP)。由于遗传、饮食习惯等因素的影响，亚洲人中乳糖不耐症患者较多，我国成年人中大概有90％以上的人会出现乳糖酶活性下降的情况，这其中有15％左右的乳糖不耐受人群，他们不能像其他人一样从牛奶等乳制品中获得丰富的营养，因此只有开发添加β-半乳糖苷酶后的低乳糖的乳制品方能满足他们的需要。

II、减少乳糖结晶析出

在冷饮等食品工业中，通过添加乳糖酶，可使原来溶解度较低的乳糖转变为溶解度更大、甜度更高的单糖，这样能减少在乳类和冰淇淋中浓缩的乳糖结晶析出，同时也能够增加食品的甜度。

III、降低废物的排放，促进乳清等副产品的综合利用

在干奶酪加工等生产中过程中要产生大量的副产品——乳清。如果不经任何处理而当废水排放，这样不仅会污染环境，而且还要造成极大浪费。其实可以根据乳清中富含乳糖等营养物质的特点，利用乳糖酶将其水解为乳清糖浆，可使其中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，这样就会增加糖浆甜度和溶解度，可部分代替蔗糖，用于面包、饮料等食品加工工业中。

此外，利用乳糖酶的半乳糖苷的转移作用生产的低聚半乳糖已经开始投放市场，低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)不被人体吸收，但能被肠道内双歧杆菌所利用，是很好的益生元。

乳糖酶的分布非常广泛，在许多植物、动物以及微生物中都有乳糖酶的存在。尤其是在真菌和细菌等微生物中分布更加广泛，目前已经从多种微生物中发现乳糖酶，比如：细菌中有芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌有天蓝色链球菌；霉菌有黑曲霉、米曲霉、疏球曲霉；酵母菌有脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸酵母等。

β-半乳糖苷酶的编码基因为β-半乳糖苷酶基因，由于其来源不同，不同种属生物的β-半乳糖苷酶基因存着较大的差异性，所编码的乳糖酶的最适温度，pH值等酶学性质也各不相同。国际生物化学与分子生物学联盟(IUBMA)，根据氨基酸序列一致性比较，将已发现的各种糖基水解酶分成了133个家族，分别命名为GH1——GH133家族。在目前发现的133个家族中，β-半乳糖苷酶存在主要存在于第GH2，GH42家族，而且多数来自于乳酸菌等原核生物，在同一家族中的乳糖酶基因其相似性比较高。

乳糖酶的工业生产方法主要是微生物发酵法，根据其发酵菌株的不同，制取得到的乳糖酶酶学性质也各不相同。为了获得产酶量高的菌株，除了常规的微生物诱导筛选方法外，目前常采取利用基因工程等技术手段，将乳糖酶基因克隆并转化到其他生物细胞中进行过量表达的方法来构建乳糖酶高产的工程菌株。

Kefir粒(开菲尔粒)是一种原产于高加索地区的用于生产开菲尔发酵乳的发酵剂，它是一种由不同的微生物所构成的一个凝胶状微生物群落。Kefir粒中的微生物间存在着一种复杂共生关系，组成Kefir粒的微生物菌相非常复杂，其中乳酸菌含量最多，约占整个菌群总数的90％以上，而且其构成也非常复杂，已经发现的乳酸菌有：乳杆菌类的马奶酒样乳杆菌Lactobacillus kefiranofaciens，嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，短小乳杆菌Lactobacillus brevis，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，干酪乳杆菌Lactobacillus casei，瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus，发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum，德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，以及小鼠乳杆菌Lactobacillus murinus，戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus，Japonicus葡糖杆菌Gluconobacter japonicus，双歧杆菌Bifidobacterium等；乳球菌类乳酸乳球菌Lactococcus lactis，嗜热链球菌Streptococcus thermophiles，肠膜明串珠菌Leuconostoc mesentroides等。Kefir粒存在于牛乳、羊乳等富含乳糖的环境中，需要依靠其丰富乳酸菌群产生大量不同种类的乳糖酶，将乳糖水解成单糖后作为碳源利用。因此Kefir粒也是一个天然的乳糖酶资源库。

乳酸菌是一类革兰氏阳性、利用可发酵糖产生大量乳酸的微生物的通称。乳酸菌广泛地存在于自然界、动物体内、乳制品和发酵食品中，且大多数为非致病菌，通常被认为是安全的GRAS级(Generally Recognized As Safe)的微生物，在医药、食品及饲料等工业中获得了日益广泛的应用。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法与应用。

本发明技术方案如下：

一种建立乳糖酶工程菌资源库的特异引物组，所述特异引物组包含两对特异引物，分别为GH2家族特异引物和GH42家族特异引物，GH2家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；GH42家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

GH2家族特异引物核苷酸序列如下(I为次黄嘌呤)：

GH2-up:GGATCCATGIAAGCAAAIATIAAATGG——BamHI SEQ ID NO.1

GH2-down:CTCGAGTTAAAAITIGTTIAIIATGAAIGA——XhoI SEQ ID NO.2

GH42家族特异引物核苷酸序列如下：

GH42-up:GGATCCATGACAIAAACITTAICACGI——BamHI SEQ ID NO.3

GH42-down:CTCGAGCTATTTAACCAAIACTTGIAC——XhoI SEQ ID NO.4

一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法，包括如下步骤：

(1)将Kefir粒放入灭菌后的脱脂牛奶中，在20～30℃的条件下培养60～84h，然后离心，收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，离心取沉淀，然后用浓度为45～55mmol/L、pH7.5～8.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液进行第二次重悬，离心取沉淀，然后用含有浓度为45～55mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和18～22mmol/L EDTA、pH7.5～8.5的混合溶液进行第三次菌体重悬，制得菌悬液；然后提取DNA，制得基因组DNA；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，分别用上述GH2家族特异引物和GH42家族特异引物进行PCR扩增，制得扩增产物lacgh2和lacgh42；

(3)将步骤(2)制得的扩增产物lacgh2和lacgh42经BamH I和Xhol I双酶切后，与同样经BamH I和Xhol I双酶切的质粒表达载体pET30a连接，制得重组表达载体，然后转化至大肠杆菌中，筛选转化成功的菌群，制得乳糖酶工程菌资源库。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，提取DNA的步骤如下：

向菌悬液中按0.8～1.2mg/mL的比例加入溶菌酶，按0.08～0.12mg/mL的比例加入蛋白酶K以及按质量百分比浓度0.8～1.2％的比例加入十二烷基硫酸钠(SDS)，35～38℃保温25～40min裂解细胞；然后8000～12000rpm离心8～15min，收集上清液，按体积比25:24的比例加入苯酚/氯仿溶液，离心去除沉淀，上清液中加入8～10倍体积无水乙醇，取沉淀，用体积浓度为70％的乙醇冲洗后，即得。

根据本发明进一步优选的，上述苯酚/氯仿溶液为苯酚与氯仿按体积比1:1的比例混合的混合液。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸10min。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，双酶切体系如下，总体系20μl:

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，大肠杆菌为大肠杆菌E.coli BL21。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，转化条件为：

将感受态细胞与重组表达载体混合后，置于冰上25～35min；然后迅速放入40～45℃水浴锅内1～2min，进行热击转化后置于冰上1.5～2.5min；加入2倍体积以上的LB液体培养基，放到摇床上35～38℃振荡培养40～50min。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，筛选步骤如下：

将转化后的大肠杆菌E.coli BL21涂布于含有50μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基中，35～38℃培养12～14h，选取白色光滑菌落，即得。

上述构建的乳糖酶工程菌资源库在筛选特异乳糖酶中的应用。

有益效果

本发明以Kefir粒为对象，通过提取其基因组，然后以宏基因为研究对象，根据第GH2，GH42家族乳糖酶的不同特点，通过设计通用引物组，分别克隆出不同乳糖酶基因，插入到原核表达载体中，构建了该基因在大肠杆菌中过量表达的工程菌库，为进一步筛选能够适应不同条件的乳糖酶，或者制取乳糖酶复合制剂奠定基础。

附图说明

图 1、乳糖酶重组菌蛋白的表达与纯化电泳结果照片；

图中：M.蛋白分子量标准；1.E.coli BL21/pET30a-lac转化子纯化后蛋白；2.E.coli BL21/pET30a-lac转化子诱导后的总蛋白；3.E.coli BL21/pET30a空质粒转化子诱导后的总蛋白(对照)；

图2重组菌在X-Gal培养基中的显色反应结果照片；

图3不同设计引物扩增两种类型乳糖酶基因的半定量PCR凝胶电泳图；

图4不同方法提取Kefir粒基因组凝胶电泳图。

具体实施方式

以下实施是为了更好地说明参数本发明的内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

菌株与载体

Kefir粒来源于高加索开菲尔菌，从市场购得，购于无锡市多洪食品有限公司；

大肠杆菌BL21(DE3)、表达载体pET30a均购自北京康为世纪生物科技有限公司；

酶与试剂盒

限制性内切酶，DNA聚合酶，T₄连接酶等酶制剂均购自大连宝生物技术有限公司；其余均为国产常规试剂。

细菌基因组提取试剂盒，高纯度质粒提试剂盒，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，细菌蛋白抽提试剂盒，Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒等均购自北京康为世纪生物科技有限公司；

培养基

LB(Luria-Bertani)液体培养基：

NaCl 10g与胰蛋白胨10g，酵母粉5g混合，加蒸馏水定容至1L，用NaOH调pH至7.0，121℃灭菌20min后保存。

LB(Luria-Bertani)固体培养基：

在LB液体培养基的基础上添加质量浓度为2％的琼脂粉，加蒸馏水定容至1L，用NaOH调pH至7.0，121℃灭菌20min后保存。

实施例1

一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法，包括如下步骤：

(1)将Kefir粒放入灭菌后的脱脂牛奶中，在25℃的条件下培养72h，然后离心，收集菌体，然后用PBS缓冲液重悬菌体，离心取沉淀，然后用浓度为50mmol/L、pH8.0的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液进行第二次重悬，离心去上清，然后用含有浓度为50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和20mmol/L EDTA、pH8.0的混合溶液进行第三次菌体重悬，制得菌悬液；然后提取DNA，制得基因组DNA；

所述步骤(1)中，提取DNA的步骤如下：

向菌悬液中按1mg/mL加入溶菌酶，0.1mg/mL加入蛋白酶K以及1％加入SDS，37℃保温30min裂解细胞；然后10000rpm离心10min，收集上清液，按25:24加入苯酚/氯仿溶液，苯酚/氯仿溶液为苯酚与氯仿按体积比1:1的比例混合的混合液，离心去除沉淀，上清液中加入10倍体积无水乙醇，取沉淀，用体积浓度为70％乙醇冲洗2遍后，即得。

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，分别用GH2家族特异引物和GH42家族特异引物进行PCR扩增，制得扩增产物lacgh2和lacgh42；

GH2家族特异引物核苷酸序列如下(I为次黄嘌呤)：

GH2-up:GGATCCATGIAAGCAAAIATIAAATGG——BamHI SEQ ID NO.1

GH2-down:CTCGAGTTAAAAITIGTTIAIIATGAAIGA——XhoI SEQ ID NO.2

GH42家族特异引物核苷酸序列如下：

GH42-up:GGATCCATGACAIAAACITTAICACGI——BamHI SEQ ID NO.3

GH42-down:CTCGAGCTATTTAACCAAIACTTGIAC——XhoI SEQ ID NO.4

PCR扩增体系如下，总体系50μl:

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸10min。

PCR扩增后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，两种家族乳糖酶基因PCR产物分别命名为lacgh2和lacgh42，挑选部分PCR产物送金唯智公司测序。然后分别回收两种家族乳糖酶基因PCR产物将其纯化后用于后续的连接反应。

(3)将步骤(2)制得的扩增产物lacgh2和lacgh42经BamH I和Xhol I双酶切后，与同样经BamH I和Xhol I双酶切的质粒表达载体pET30a(提取质粒表达载体pET30a的方法参照康维世纪质粒提取试剂盒说明书)连接，转化至大肠杆菌E.coli BL21中，筛选转化成功的菌群，制得乳糖酶工程菌资源库。

所述双酶切体系如下，总体系20μl:

所述步骤(3)中，转化条件为：

在100μL感受态细胞加入3μL重组表达载体，置于冰上30min；然后迅速放入42℃水浴锅内1.5min，进行热击转化后快速置于冰上2min；加入2倍体积以上的LB液体培养基，放到摇床上37℃轻柔振荡培养45min。

所述步骤(3)中，筛选步骤如下：

将转化后的大肠杆菌E.coli BL21涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养12～14h，选取白色光滑菌落，即得。

实施例2乳糖酶基因的表达库的活性检测

1、融合蛋白的诱导表达及纯化

将含有乳糖酶基因全长的阳性克隆接种于50μg·L^-1卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，然后按1:50接种量进行扩大培养，至OD₆₀₀约为0.5，加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L^-1，27℃继续振荡培养4h以诱导蛋白的表达。蛋白纯化方法参照(Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒)说明书。

用SDS-PAGE电泳检测纯化产物，分离胶浓度为12％。蛋白纯化产物电泳图如图1所示，由图结果可知：与对照菌株(pET-30a)相比，原核表达菌(pET-30a-lac)在相对分子量35kD和76kD附近出现两条新带，与文献中报到的GH2和42GH乳糖酶家族中乳糖酶蛋白分子量一致。

2、乳糖酶的活性测定

使用液相色谱法通过测定乳糖的减少量以及半乳糖和葡萄糖的量来间接反应β-半乳糖苷酶的活力大小。

分别准确称取1.00g左右的乳糖，葡萄糖标准品，用水溶解并定容至50mL，配成浓度为20mg/mL的标准储备液。分别吸取糖标准液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00mL于10mL容量瓶中，用水稀释定容，分别吸20μL注入高效液相色谱仪，以葡萄糖和乳糖的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。然后通过待测样品的峰面积换算出乳糖或者葡萄糖的数量。色谱条件为：

色谱柱：氨基柱，5μm，4.6×300mm；

柱温：室温；

流动相：乙腈：水＝75：25；

流速：10mL/min；

示差折光检测器内温：40℃；

进样量:20μL

将实施例1中构建好的乳糖酶基因表达库中的E.coli BL21菌群发酵液菌体收集，使用超声波破碎，添加到牛乳中，37℃条件下存放24小时，测定其乳糖含量，如果大部分乳糖发生水解，证明其具有乳糖酶活性。

实施例3从乳糖酶基因表达库中筛选所需的工程菌

根据特定的需要，配制不同条件的LB平板，如要获得耐酸的工程菌，可将LB平板pH调至酸性条件，然后在每个平板上涂布少量的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)溶液，再涂布实施例1中构建好的乳糖酶基因表达库中的菌液，37℃培养24小时，当有蓝色的菌落出现，如图2所示，则表明该菌能在特定条件下生长，并且具有β-半乳糖苷酶水解活性，有可能是所需要的工程菌，从而进行后续分离筛选即可。

对比例1

如实施例1所述的乳糖酶工程菌资源库的建立方法，不同之处在于，步骤(2)PCR扩增采用的引物核苷酸序列如下：

GH2-up:GGATCCATGAAAGCAAATATCAAATGG——BamHI

GH2-down:CTCGAGTTAAAATTAGTTGAGAATGAATGA——XhoI

GH42家族特异引物核苷酸序列如下：

GH42-up:GGATCCATGACAAAAACATTATCACGT——BamHI

GH42-down:CTCGAGCTATTTAACCAATACTTGAAC——XhoI

考虑到引物的兼并性，实施例1中在乳糖酶的基因差异较大位点使用了次黄嘌呤I，其主要目的是为了提高与Kefir粒中不同来源的乳糖酶基因的结合率，因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对。因此相比对比例1中引物，能扩增出更多的乳糖酶基因片段，其结果可以通过采取半定量PCR等方法进行验证。

对比例2

如实施例1所述的乳糖酶工程菌资源库的建立方法，不同之处在于，步骤(1)如下：

将Kefir粒放入灭菌后的脱脂牛奶中，在25℃的条件下培养72h，然后离心，收集菌体，然后用PBS缓冲液重悬菌体，离心取沉淀，重复PBS缓冲液重悬菌体2次，制得菌悬液；然后提取DNA，制得基因组DNA。

实验例1

将实施例1与对比例1中引物，以相同的基因组为模版，进行半定量PCR进行验证，结果如图3所示。

通过对经过20轮循环后的PCR产物进行凝胶电泳分析，发现在引物和模板量相同的情况下，使用实施例1的两种引物，泳道1和3中的扩增条带亮度非常高；与此相对应的是，泳道2和4是采用了对比例1的引物扩增后的条带，亮度偏暗，说明该引物扩增出的乳糖酶基因数量要远远低于实施例1，由此可以判定实施例1中的引物具有更好的兼容性。

实验例2

将实施例1与对比例2提取的基因组通过凝胶电泳检测后，结果如图4所示。

由电泳图可以看到，泳道1为采用实施例1的PBS，Tris以及Tris+EDTA三部洗脱法提取的基因组比较完整，无断裂条带，无明显的蛋白杂带等，DNA提取浓度高，提取的样品可以作为模板进行下一步的基因克隆扩增。而泳道2为采用对比例2的方法，基因组出现了非常弥散的条带，而且在底部出现了大量的小分子量的亮带，估计是断裂的DNA片段或者是少量尚未降解的RNA，因此不适合做下一步基因扩增。