一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法与应用与流程

技术特征：

1.一种建立乳糖酶工程菌资源库的特异引物组，其特征在于，所述特异引物组包含两对特异引物，分别为GH2家族特异引物和GH42家族特异引物，GH2家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；GH42家族特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种乳糖酶工程菌资源库的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将Kefir粒放入灭菌后的脱脂牛奶中，在20～30℃的条件下培养60～84h，然后离心，收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，离心取沉淀，然后用浓度为45～55mmol/L、pH7.5～8.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液进行第二次重悬，离心取沉淀，然后用含有浓度为45～55mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和18～22mmol/L EDTA、pH7.5～8.5的混合溶液进行第三次菌体重悬，制得菌悬液；然后提取DNA，制得基因组DNA；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，分别用权利要求1所述的GH2家族特异引物和GH42家族特异引物进行PCR扩增，制得扩增产物lacgh2和lacgh42；

(3)将步骤(2)制得的扩增产物lacgh2和lacgh42经BamH I和Xhol I双酶切后，与同样经BamH I和Xhol I双酶切的质粒表达载体pET30a连接，制得重组表达载体，然后转化至大肠杆菌中，筛选转化成功的菌群，制得乳糖酶工程菌资源库。

3.如权利要去2所述的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取DNA的步骤如下：

向菌悬液中按0.8～1.2mg/mL的比例加入溶菌酶，按0.08～0.12mg/mL的比例加入蛋白酶K以及按质量百分比浓度0.8～1.2％的比例加入十二烷基硫酸钠(SDS)，35～38℃保温25～40min裂解细胞；然后8000～12000rpm离心8～15min，收集上清液，按体积比25:24的比例加入苯酚/氯仿溶液，离心去除沉淀，上清液中加入8～10倍体积无水乙醇，取沉淀，用体积浓度为70％的乙醇冲洗后，即得。

4.如权利要去3所述的建立方法，其特征在于，所述苯酚/氯仿溶液为苯酚与氯仿按体积比1:1的比例混合的混合液。

5.如权利要去2所述的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸10min。

6.如权利要去2所述的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中，双酶切体系如下，总体系20μl:

7.如权利要去2所述的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中，大肠杆菌为大肠杆菌E.coli BL21。

8.如权利要去2所述的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中，转化条件为：

将感受态细胞与重组表达载体混合后，置于冰上25～35min；然后迅速放入40～45℃水浴锅内1～2min，进行热击转化后置于冰上1.5～2.5min；加入2倍体积以上的LB液体培养基，放到摇床上35～38℃振荡培养40～50min。

9.如权利要去2所述的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中，筛选步骤如下：

将转化后的大肠杆菌E.coli BL21涂布于含有50μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基中，35～38℃培养12～14h，选取白色光滑菌落，即得。

10.权利要求2构建的乳糖酶工程菌资源库在筛选特异乳糖酶中的应用。