本发明涉及RNA提取，涉及核酸纯化领域，具体地说就是骨组织RNA快速提取试剂盒。
背景技术：
分子生物学的研究主要集中在核酸和蛋白质，绝大部分的分子生物学研究都需要首先得到纯化的核酸，因此核酸纯化是分子生物学的基石之一，全球市场非常庞大，世界各国都在正在不断改进提取纯化方法，以达到更快、更纯的得到核酸。核酸纯化一般分为RNA提取纯化和DNA提取纯化两大类。
世界上主流的RNA提取解决方案主要是两种，一种是1987年Chomczynski 发明的异硫氰酸胍/酸酚/氯仿一步法抽提总RNA(俗称TRIzol法)，这是RNA提取纯化技术的第一个里程碑。其纯化原理为：在异硫氰酸胍/酸酚的条件下，DNA溶解于有机相，RNA溶解于水相，而蛋白质则在中间相；从而有效地将RNA和DNA/蛋白质分开。该方法优点是经济，灵活。缺点是使用苯酚，氯仿毒性物质。另一种是硅胶柱（Spin Columns）纯化技术，这是RNA提取纯化技术的第二个里程碑。硅胶柱将核酸抽提纯化变成一种简单的过滤操作，以取代传统溶液型抽提技术的离心方式。其纯化原理为：硅胶柱的纯化原理就是使用一种特殊的玻璃纤维滤膜，这种滤膜在高离液剂（硫氰酸胍，盐酸胍，NaI等）的条件下，可以同RNA发生吸附反应，同时蛋白质和其它杂质不会被吸附或者漂洗去除，然后在低盐条件下，RNA又可以从滤膜中释放出来，从而达到纯化核酸的目的。该方法的优点是不用苯酚，氯仿毒性物质，操作简单，速度快。缺点是硅胶柱会同时吸附RNA/DNA,因此容易导致DNA残留，造成纯度低。
骨组织坚硬、骨组织坚硬、骨细胞密度低、而且外周基质含有大量黏蛋白（蛋白多糖）和RNA难以分离，无法用传统Trizol法进行高质量提取。在提取骨组织RNA 的过程中，常由于提取时间过长，RNA 酶污染等原因造成RNA 降解，使得后续试验无法进行。因此，采用一种快速提取RNA 的方法对于进行RNA 的相关实验至关重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速有效提取骨组织RNA的试剂盒，该试剂盒采用独特的缓冲体系和双硅胶柱纯化系统解决DNA残留问题，能够得到纯度高，完整性好的骨组织RNA。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
骨组织RNA快速提取试剂盒，包括至少一个基因组DNA清除柱、至少一个RNA吸附柱以及与基因组DNA清除柱配合使用的裂解液和与RNA吸附柱配合使用的洗脱液。
作为优化的，所述裂解液包括裂解液RLT Plus和裂解液CLB，所述洗脱液为无核糖核酸酶水。
作为优化的，所述裂解液RLT Plus中含有浓度为2-5mol/L的异硫氰酸胍、PH为6.0-8.5的Tris-HCl缓冲溶液、1.5-3.0g/L的 十二烷基硫酸钠；所述裂解液CLB中含有浓度为2-5mol/L的异硫氰酸胍、2-2.5g/L的十六烷基三甲基溴化铵、PH为6.0-8.5的Tris-HCl缓冲溶液、2-10g/L的聚乙烯吡咯烷酮、浓度为10-100mmol/L的氯化钠。
作为优化的，所述的骨组织RNA快速提取试剂盒还包括漂洗液RW、助提剂PLANT aid、去蛋白液RW1。
作为优化的，所述漂洗液RW中含有PH为6.0-8.5、浓度为5-50mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、浓度为10-100mmol/L氯化钠。
作为优化的，所述助提剂PLANT aid中含有0.5-1.0mmol/L的二硫苏糖醇、0.5-2.0%的吐温-20、3-15%的聚乙烯吡咯烷酮。
作为优化的，所述去蛋白液RW1中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍、体积分数60-80%的乙醇。
作为优化的，所述基因组DNA清除柱和RNA吸附柱为硅膜吸附柱。
作为优化的，所述的骨组织RNA快速提取试剂盒提取RNA，至少包括如下两个步骤： A步骤，用基因组DNA清除柱将基因组DNA清除；B步骤，用RNA吸附柱将RNA吸附。
作为优化的，所述的骨组织RNA快速提取试剂盒提取RNA，包括如下步骤：
（1）利用裂解液CLB对样品进行裂解得到裂解物；
（2）将裂解物转入离心管，离心，收集上清液，向上清液中加入其体积0.5倍无水乙醇，混匀；
（3）A步骤，用基因组DNA清除柱将基因组DNA清除：将上清液加到基因组DNA清除柱上（清除柱放在收集管内），离心弃掉废液，将基因组DNA清除柱置于离心管内，加入裂解液RLT Plus，离心收集滤液；
（4）向步骤（3）得到的滤液中加入其体积0.5倍的无水乙醇混匀；
（5）B步骤，用RNA吸附柱将RNA吸附：将步骤（4）得到的混合物加入一个RNA吸附柱中，离心，弃掉滤液；
（6）向RNA吸附柱中加入去蛋白液RW1，离心，弃掉废液；
（7）向RNA吸附柱中加入漂洗液RW，离心，弃掉废液，重复一遍；
本发明的有益效果是：本试剂盒采用独有的不含苯酚/氯仿配方的裂解液，并添加多种成分去除骨组织蛋白多糖。同时独特基因组DNA清除柱技术可以有效清除基因组DNA（gDNA）残留，得到的RNA不需要DNA酶消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验，单个样品操作一般可在35分钟内完成。
附图说明
图1、骨组织RNA电泳图。
图中从左到右的五个泳道分别为泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5；其中泳道1为分子量标记，泳道2为大鼠股骨头，泳道3为兔椎间盘，泳道4为兔膝关节软骨，泳道5为小鼠胫骨。
具体实施方式
实验前装备：
取1ml裂解液 CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入100μl PLANTaid，颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。
实验步骤：
1. 液氮研磨法:
a. 骨钳夹碎骨组织后放入研钵，加入液氮后反复研磨成细粉，注意液氮蒸发后不断补加保存液氮一直存在。
b. 转移100mg细粉加至预热的裂解液CLB（已加有PLANTaid）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
c. 立刻接操作步骤的步骤3。
2. 其它骨组织破碎方法：
a. 取100mg骨组织加入1ml预热的裂解液CLB（已加有PLANTaid）高速均质仪粉碎匀浆。或者取100mg液氮冷冻包埋切片粉碎的骨头加入裂解液CLB（已加有PLANTaid）粉碎匀浆。
b. 立刻接操作步骤的步骤3。
3. 短时放回 65°C水浴中（10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。
4. 将裂解物13,000 rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。
5. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。
6. 将混合物（每次小于720μl，多可以分两次加入）加入一个基因组清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
7. 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free 或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm离心30秒， 收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
8. 立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RNA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
9. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
10. 加入500μl漂洗液RW中含有PH为7.0、浓度为25mol/L的Tris-HCl缓冲溶液、浓度为10-100mmol/L氯化钠，13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。
11. 将吸附柱RNA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12. 取出吸附柱RNA，放入一个无核糖核酸酶离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
13. 如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl无核糖核酸酶水重复步骤12，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。
本试剂盒还可用于脱氧核糖核酸酶I处理后的RNA清洁。
具体实施例：
将大鼠股骨头、兔椎间盘、兔膝关节软骨、小鼠胫骨四种骨组织进行如下操作：
1. 骨钳夹碎骨组织后放入研钵，加入液氮后反复研磨成细粉，保持液氮一直存在。转移100mg细粉加至预热的裂解液CLB离心管中。所述裂解液含有浓度为3mol/L的异硫氰酸胍、2g/L的十六烷基三甲基溴化铵、PH为7.0的Tris-HCl缓冲溶液、2g/L的聚乙烯吡咯烷酮、浓度为50mmol/L的氯化钠。立即剧烈涡旋45秒。放入 65°C水浴中（10 min），中间颠倒2次帮助裂解。
2. 将裂解物离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片，取上清液，加入上清液的1/2体积的无水乙醇混匀转入一个基因组清除柱中进行吸附离心，弃掉废液。基因组清除柱为硅膜吸附柱。
3. 将基因组DNA清除柱子放在一个干净离心管内，在基因组清除柱内加裂解液RLT Plus，所述裂解液RLT Plus中含有浓度为3mol/L的异硫氰酸胍、PH为7.0的Tris-HCl缓冲溶液、2g/L的 十二烷基硫酸钠。离心收集滤液，加入滤液的1/2体积的无水乙醇混匀。
3. 将混合物加入到放置于收集管中的吸附柱RNA中，离心弃掉废液。加去蛋白液RW1，所述RW1中含有3mol/L的异硫氰酸胍、体积分数70%的乙醇。室温放置1分钟，离心弃掉废液。加入漂洗液RW，所述漂洗液RW中含有PH为7.0、浓度为5-50mol/L的Tris-HCl缓冲溶液、浓度为10-100mmol/L氯化钠。离心弃掉废液，重复一遍。
4. 将吸附柱RNA放回空收集管中，离心除去漂洗液。
5. 取出吸附柱RNA，放入一个无核糖核酸酶离心管中，在吸附膜的中间部位加入RNase free water， 室温放置1分钟，离心。
6. 重复步骤5，合并两次洗液，分别得到需要的大鼠股骨头、兔椎间盘、兔膝关节软骨、小鼠胫骨骨组织RNA。
将得到的大鼠股骨头、兔椎间盘、兔膝关节软骨、小鼠胫骨四种骨组织RNA进行电泳，得到电泳图如图1所示。
泳道1为分子量标记，泳道2、3、4、5是用骨组织RNA快速提取试剂盒分别提取的大鼠股骨头、兔椎间盘、兔膝关节软骨、小鼠胫骨四种骨组织电泳图，从图片可以看出采用此方法提取的骨组织RNA无残留DNA，提取效果好。
工作原理：独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶， 离心沉淀去除蛋白多糖和次级代谢产物，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA被选择性洗脱滤过，吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的无核糖核酸酶水将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书的骨组织RNA快速提取试剂盒且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。